紅曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株及其用于Monacolin K制備中應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)微生物領(lǐng)域，涉及一株液體發(fā)酵生產(chǎn)MonacolinK紫色紅曲霉M-24菌株、用途和制備方法。紅曲霉（ Monascuspurpureus ）M-24菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO:M2014414，保藏日期為2014年9月14日。紫色紅曲霉M-24菌株具有高產(chǎn)MonacolinK、生長速度快、產(chǎn)孢量多等優(yōu)良性狀。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，MonacolinK產(chǎn)量可達(dá)170mg/L～210mg/L。CCTCC NO:M 20144142014.09.14
【專利說明】紅曲霉(Monascus purpureus) M-24菌株及其用于Monaco I i η K制備中應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)微生物領(lǐng)域，涉及一株液體發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K紫色紅曲霉Μ-24菌株、用途和制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]紅曲霉{Monascus )是我國重要的食用、藥用真菌，是傳統(tǒng)中藥紅曲的基原菌，也是制作傳統(tǒng)飲品紅曲酒的主要菌種，在我國已有上千年的應(yīng)用歷史。紅曲霉作為一種腐生真菌，最適生長溫度為25°C?30°C，最適pH為3.5?5.0，能夠以糖類、有機酸、醇類為碳源，以硝態(tài)氮、氨態(tài)氮和有機氮為氮源。其傳統(tǒng)用途主要是作為食品發(fā)酵劑、防腐劑、著色劑、增香劑以及用作中藥配伍。紅曲霉在生長代謝過程中能分泌產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)，莫納可林K (Monacolin K)、Y-氨基丁酸(Y -aminobutyric acid,GABA)、紅曲色素、麥角固醇、蛋白酶等，均引起了國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。
[0003]1979年，日本遠(yuǎn)藤章從紅色紅曲霉(ifoaasciAs rMer)發(fā)酵液中分離得到一種可抑制體內(nèi)膽固醇合成的活性物質(zhì)，命名為Monacolin K。時隔I年,美國Albert等亦從土曲霉(Aspergillus terrers)中發(fā)現(xiàn)了相似的物質(zhì)，并命名為Mevinolin,現(xiàn)稱Lovastatin(洛伐他汀)。此后發(fā)現(xiàn)Monacolin K存在于包括側(cè)耳屬O0Zearo加)、莖點菌屬(/%o?a)、青霉屬{Penicillium)在內(nèi)的多種真菌中。這一連串的發(fā)現(xiàn)引起了世界的轟動，掀起了紅曲霉降酯類產(chǎn)物的研究熱潮。Monacolin K的藥理作用是通過特異性抑制膽固醇合成系統(tǒng)中的限速酶HMG-CoA (3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A)還原酶活性；因Monacolin K的結(jié)構(gòu)與HMG-CoA結(jié)構(gòu)相似，所以Monacolin K對HMG-CoA還原酶具有競爭性抑制作用，從而減少機體內(nèi)膽固醇的含量。這類物質(zhì)在血液中濃度只要達(dá)到0.001 μ g/mL"0.005 μ g/mL就可以使膽固醇的合成受阻。
[0004]近年來，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率在全球均已躍居首位；主要是因為血液中積聚了過多的膽固醇；紅曲霉的代謝產(chǎn)物Monacolin K是各國公認(rèn)的降低膽固醇的理想藥齊U，具有高效、低毒、安全的特點。但Monacolin K的產(chǎn)量卻一直難以大幅度提高，紅曲霉菌種緩慢的生長速度和較少的產(chǎn)孢量，給紅曲霉的工業(yè)化生產(chǎn)Monacolin K造成了極大的障礙。因此，選育出穩(wěn)定高產(chǎn)Monacolin K的菌種顯得非常的迫切，也是Monacolin K工業(yè)化生廣的基本保障。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對市場上Monacolin K需求日益增長，而傳統(tǒng)使用紅曲霉菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K產(chǎn)量較低、生長緩慢、產(chǎn)孢量少等的問題。本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)Monacolin K紫色紅曲霉M-24菌株。紫色紅曲霉M-24菌株具有高產(chǎn)Monacolin K、生長速度快、產(chǎn)孢量多等優(yōu)良性狀。本發(fā)明的另外一個目的是提供采用上述的紫色紅曲霉菌株發(fā)酵和制備Monacolin K的方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
紫色紅曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株,該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCC Ν0:Μ 2014414，保藏日期為2014年9月14日。
[0007]該菌株在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)7 d后，菌落直徑達(dá)到24 mm，平坦，氣生菌絲稀疏短小，絲絨狀，大部分呈橘紅色，邊緣呈白色；菌落初期為白色絨毛狀，4 d后中心菌絲開始變紅色，培養(yǎng)25 d后色澤變?yōu)殚偌t色，菌落直徑達(dá)到65 mm ;顯微鏡觀察菌絲光滑，有隔膜，直徑3?7 μ m的分支狀，有深淺不一的紅褐色色素顆粒；分生孢子球形或倒梨形，單生或成鏈，直徑6?8 ym;閉囊殼呈球形，囊內(nèi)孢子可見，子囊孢子橢球形，直徑6?7 μπι，透明淡紅色或無色。
[0008]本發(fā)明從自然發(fā)酵紅曲米中篩選到一株紅曲霉Μ-24菌株，該菌株具有高產(chǎn)Monacolin K的特點，可用于Monacolin K工業(yè)化生產(chǎn)菌株。
[0009]為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種Monacolin K的制備方法,該方法采用所述的紅曲霉Μ-24菌株發(fā)酵制得。
[0010]作為優(yōu)選，所述的發(fā)酵有機碳源采用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一種或多種，氮源采用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨中的一種或多種。
[0011 ] 作為最優(yōu)選，所述的有機碳源為麥芽糖，氮源為酵母粉。
[0012]作為優(yōu)選，所述的發(fā)酵的溫度范圍為28°C?36°C，pH范圍為4.0?5.0。
[0013]作為優(yōu)選，所述的發(fā)酵的方法如下:
1)用接種針挑少量該菌株菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平皿中，活化培養(yǎng)7?15d ；
2)將平皿中菌餅接種于液體H)培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)4d?6 d，制得一級種子；
3)在混合培養(yǎng)液中,加入一級種子,200r/min搖床培養(yǎng)成二級種子；
4)在發(fā)酵罐中接種二級種子，發(fā)酵時間為130h ^160 h。
[0014]作為優(yōu)選，所述的發(fā)酵培養(yǎng)完后的提取方法如下:
O發(fā)酵培養(yǎng)完后，過濾發(fā)酵液，乙酸乙酯萃取菌絲中成分，與濾液混勻，調(diào)混合液pH2.5^3.5，過濾三次，取濾液，加熱抽濾獲澄清混合液；
2)分液漏斗取上層乙酸乙酯，3(T50°C旋蒸至干；
3)加入苯萃提，過濾棄沉淀并以重量比4(Γ60:1的比例加入重量百分比濃度為2?10%的Na2C03兩次，再以重量比40^60:1的比例加入0.1?0.3 M NaCl 一次，搖床震蕩I?3 h ；
4)分液漏斗取水層，調(diào)pH2.5^3.5 ;以重量比4(Γ60:1的乙酸乙酯萃取兩次去有機層混合蒸干得Monacolin K晶體。
[0015]紫色紅曲霉Μ-24菌株具有高產(chǎn)Monacolin K、生長速度快、產(chǎn)孢量多等優(yōu)良性狀。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，Monacolin K產(chǎn)量可達(dá)170 mg/L?210 mg/L。紅曲霉在食品藥品生產(chǎn)中獲得了長期的實踐證明，紅曲霉多數(shù)種都是較安全的，被FDA認(rèn)為是GRAS(generalIy recognized as safe)級別的食品添加劑,在市售的藥品中，MonacolinK于20世紀(jì)90年代直接開發(fā)為治療高血壓的藥物，其生產(chǎn)和應(yīng)用均不存在安全隱患，能直接應(yīng)用于食品藥品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1紫色紅曲霉M-24菌株在PDA上培養(yǎng)7 d (左)、25面d (右)菌落正面。
[0017]圖2紫色紅曲霉M-24菌株的菌絲及分生孢子顯微特征(400X)。
[0018]圖3紫色紅曲霉M-24菌株的閉囊殼顯微特征(400X)。
[0019]圖4基于ITS序列建立的紅曲霉屬系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0020]圖5 Monacolin K粗提物有機溶液(左)與蒸干后得到的晶體(右)。
[0021]圖6 Monacolin K粗提物HPLC色譜圖，注:出峰時間6.989 min處為MonacolinK,峰面積為 8459.34 mAU*s。
[0022]圖7 Monacolin K提取物核磁共振氫譜圖。
[0023]生物保藏聲明
紫色紅曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株,該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCC Ν0:Μ 2014414，保藏日期為2014年9月14日。

【具體實施方式】
[0024]下面對本發(fā)明【具體實施方式】做一個詳細(xì)的說明。
[0025]實施例1紫色紅曲霉M-24菌株的分離、純化和篩選 1.1培養(yǎng)基
(I)PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.5%，水，pH自然。
[0026](2) 一級種子培養(yǎng)基H):馬鈴薯20%，葡萄糖2%，水，pH6.0。
[0027](3)二級種子培養(yǎng)基:葡萄糖6%，蛋白胨2 %，KH2P04 0.2%,MgSO4.7Η20 0.1%,NaNO30.2%,水,pH 6。
[0028](4)發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油9%、大米水解液2%、大豆蛋白胨3%，酵母膏0.5%, MgSO4.7Η20
0.1%，NaNO3 0.2%, ΚΗ2Ρ04 0.1%，ZnSO4 0.2%，水，ρΗ4.0。
[0029]分離、純化和篩選
紫色紅曲霉Μ-24菌株分離自自然發(fā)酵的紅曲米。將紅曲米0.5 g用研缽研磨成粉狀，取少量均勻的灑入PDA培養(yǎng)基表面，30°C培養(yǎng)48 h，待白色絨毛狀菌絲長出后，挑取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一 PDA培養(yǎng)平板上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)I W后重復(fù)上述分離純化操作，經(jīng)三次純化后即可得到得性狀均一的紅曲霉菌株。將篩選獲得的紅曲霉菌株保存于25%甘油并置于4 V冰箱中，編號備用。菌種使用之前需先活化，250 mL三角瓶裝入50 mL H)培養(yǎng)液，接入大小一致的菌餅，32°C搖床(200 r/min)培養(yǎng)5 d。
[0030]鑒定
該菌株在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)7 d后，菌落直徑達(dá)到24 mm，平坦，氣生菌絲稀疏短小，絲絨狀，大部分呈橘紅色，邊緣呈白色；菌落初期為白色絨毛狀，4 d后中心菌絲開始變紅色，培養(yǎng)25 d后色澤變?yōu)殚偌t色，菌落直徑達(dá)到65 mm (附圖1)。顯微鏡觀察菌絲光滑，有隔膜，直徑3?7 μ m的分支狀，有深淺不一的紅褐色色素顆粒；分生孢子球形或倒梨形，單生或成鏈，直徑6?8 ym；閉囊殼呈球形，囊內(nèi)孢子可見，子囊孢子橢球形，直徑6?7μπι，透明淡紅色或無色(附圖2、圖3)。生理生化實驗表明，該菌株的適宜生長溫度范圍為280C?36°C，最適pH范圍為4.(Γ5.0。能夠很好的利用各種有機碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、番薯粉等，其中最適生長碳源為麥芽糖；在氮源利用方面，可利用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨等無機氮源和牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多種有機氮源，以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生長最好。ITS序列分析結(jié)果表明，與紫色紅曲霉的相似度高達(dá)99% (附圖
4)，根據(jù)M-24菌株形態(tài)特征、顯微特征、ITS序列，結(jié)合李鐘慶和郭芳紅曲霉分種檢索表,將M-24菌株鑒定為紫色紅曲霉(ifoaasciAs purpureus ) ?
[0031]實施例2發(fā)酵法生產(chǎn)和制備Monacolin K的工藝流程紫色紅曲霉(ifoaascMM-24菌株篩選自自然發(fā)酵的紅曲米,可用于發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K。取紫色紅曲霉Μ-24菌株保存菌種，在無菌條件下，用接種針挑少量菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平皿中，活化培養(yǎng)7?15 d ;將平皿中菌餅接種于液體H)培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)4 d d,制得一級種子；在混合培養(yǎng)液中,加入一級種子,200 r/min搖床培養(yǎng)成二級種子；在發(fā)酵罐中接種二級種子，發(fā)酵時間為130 h ^160 h;發(fā)酵培養(yǎng)完后，過濾發(fā)酵液，乙酸乙酯萃取菌絲中成分，與濾液混勻。發(fā)酵罐接種量為69TlO% (V/V)，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為200 r/min?250 r/min，溫度為26°C，通氣量80?120 L/h，罐壓0.1?0.5 MPa。經(jīng)高效液相法(HPLC)檢測 Monacolin K 產(chǎn)量達(dá) 170 mg/L?210 mg/L (附圖 6)。
[0032]調(diào)上述混合液pH 3.0,過濾三次，取濾液，加熱抽濾獲澄清混合液；分液漏斗取上層乙酸乙酯，45°C旋蒸至干。加入苯萃提，過濾棄沉淀并以50:1的比例加入5 %的Na2C03兩次，再以50:1的比例加入0.2M NaCl—次，搖床震蕩2 h。分液漏斗取水層，調(diào)pH3.0。以50:1的乙酸乙酯萃取兩次去有機層混合蒸干得晶體(附圖5)，經(jīng)過核磁共振氫譜實驗表明提取物純度較高(附圖7)，可用于紅曲保健品與藥品的制備。
【權(quán)利要求】
1.紅曲霉(/7tfr/7tfT￡^s)M-24菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCC NO:M 2014414，保藏日期為2014年9月14日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅曲霉M-24菌株，其特征在于該菌株在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)7 d后，菌落直徑達(dá)到24 mm，平坦，氣生菌絲稀疏短小，絲絨狀，大部分呈橘紅色，邊緣呈白色；菌落初期為白色絨毛狀，4 d后中心菌絲開始變紅色，培養(yǎng)25 d后色澤變?yōu)殚偌t色，菌落直徑達(dá)到65 mm ;顯微鏡觀察菌絲光滑，有隔膜，直徑3?7 μ m的分支狀，有深淺不一的紅褐色色素顆粒；分生孢子球形或倒梨形，單生或成鏈，直徑6?8 ym;閉囊殼呈球形，囊內(nèi)孢子可見，子囊孢子橢球形，直徑6?7 μ m，透明淡紅色或無色。
3.權(quán)利要求1所述的紅曲霉M-24菌株用于MonacolinK制備中應(yīng)用。
4.一種Monacolin K的制備方法,其特征在于該方法采用權(quán)利要求1所述的紅曲霉M-24菌株發(fā)酵制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種MonacolinK的制備方法，其特征在于發(fā)酵有機碳源采用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一種或多種，氮源采用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種MonacolinK的制備方法,其特征在于有機碳源為麥芽糖，氮源為酵母粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的一種MonacolinK的制備方法,其特征在于發(fā)酵的溫度范圍為20°C?36°C，pH范圍為4.0?5.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的一種MonacolinK的制備方法,其特征在于發(fā)酵的方法如下: 1)用接種針挑少量該菌株菌絲，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平皿中，活化培養(yǎng)Γ15d ； 2)將平皿中菌餅接種于液體H)培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)4d?6 d，制得一級種子； 3)在混合培養(yǎng)液中,加入一級種子,200r/min搖床培養(yǎng)成二級種子； 4)在發(fā)酵罐中接種二級種子，發(fā)酵時間為130h ^160 h。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的一種MonacolinK的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)完后的提取方法如下: O發(fā)酵培養(yǎng)完后，過濾發(fā)酵液，乙酸乙酯萃取菌絲中成分，與濾液混勻，調(diào)混合液pH2.5^3.5，過濾三次，取濾液，加熱抽濾獲澄清混合液； 2)分液漏斗取上層乙酸乙酯，3(T50°C旋蒸至干； 3)加入苯萃提，過濾棄沉淀并以重量比4(Γ60:1的比例加入重量百分比濃度為2?10%的Na2CO3兩次，再以重量比40^60:1的比例加入0.1?0.3 M NaCl 一次，搖床震蕩I?3 h ； 4)分液漏斗取水層，調(diào)pH2.5^3.5 ;以重量比4(Γ60:1的乙酸乙酯萃取兩次去有機層混合蒸干得Monacolin K晶體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種MonacolinK的制備方法,其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)完后的提取方法如下: O發(fā)酵培養(yǎng)完后，過濾發(fā)酵液，乙酸乙酯萃取菌絲中成分，與濾液混勻，調(diào)混合液ρΗ2.5^3.5，過濾三次，取濾液，加熱抽濾獲澄清混合液； 2)分液漏斗取上層乙酸乙酯，3(T50°C旋蒸至干； 3)加入苯萃提，過濾棄沉淀并以重量比4(Γ60:1的比例加入重量百分比濃度為2?10%的Na2CO3兩次，再以重量比40^60:1的比例加入0.1?0.3 M NaCl 一次，搖床震蕩I?3 h ； 4)分液漏斗取水層，調(diào)pH2.5^3.5 ;以重量比4(Γ60:1的乙酸乙酯萃取兩次去有機層混合蒸干得Monacolin K晶體。
【文檔編號】C12N1/14GK104277985SQ201410505127
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】蔣冬花, 陳璨, 馮青青, 黃欣 申請人:浙江師范大學(xué)