專利名稱：金離子吸附蛋白及富集并回收金離子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及通過基因與蛋白質(zhì)工程改造細(xì)菌的技術(shù)，具體涉及金離子吸附蛋白及富集并回收金離子的方法。
背景技術(shù)：
如何合理地將自然界中的重金屬應(yīng)用到人類的生產(chǎn)生活中，使之與生態(tài)環(huán)境保護(hù)可持續(xù)性和諧發(fā)展是目前科技工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。一方面，一些重金屬在很低濃度時(shí)就會(huì)對(duì)生物體具有極強(qiáng)的毒性，且與有機(jī)化合物不同，重金屬具有富集性，在自然環(huán)境中很難被降解。近年來，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的迅猛發(fā)展，對(duì)重金屬的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造活動(dòng)日益增多，造成不少如鉛、汞、鎘等的重金屬進(jìn)入大氣、水、土壤中，引發(fā)了一系列嚴(yán)重的污染事件，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了極大的危害。重金屬造成的急性中毒和各類人體慢性疾病如老年癡呆癥，也正在時(shí)刻威脅著人類的健康。而另一方面，隨著科技水平的日新月異，那些化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、物理屬性優(yōu)良的重金屬如金、銀、銅、鉬、鈀等，被廣泛應(yīng)用在了電子、通訊、航空航天、化工、醫(yī)療等部門及與人們?nèi)粘Ｉ钕嚓P(guān)的各類生活日用品中。但是，由于生產(chǎn)工藝的限制，在這一系列生產(chǎn)活動(dòng)所產(chǎn)生的廢棄物，例如工業(yè)廢水中仍然含有大量的重金屬離子，這既會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞，也使得生產(chǎn)成本居高不下。目前對(duì)于工業(yè)廢水中重金屬離子的檢測(cè)和富集主要采用的都是物理吸附和化學(xué)試劑法，這些方法一般檢測(cè)靈敏度較低，尤其是對(duì)各種性質(zhì)相近的重金屬離子的區(qū)分度較差，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)某種特定重金屬離子的特異識(shí)別與去除。而采用大型分析設(shè)備如ICP-MS (電感耦合等離子體質(zhì)譜)，雖然其對(duì)重金屬離子的檢測(cè)靈敏度更高，但是操作手段繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，必須要將樣品送到指定部門由專業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢驗(yàn)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且在檢測(cè)的基礎(chǔ)之上再利用這些大型儀器實(shí)現(xiàn)重金屬的特異吸附就更加的困難。除此之外，化學(xué)檢測(cè)手段中所使用的各類化學(xué)試劑通常會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，不是一種環(huán)境友好的水體中重金屬離子的處理方式。因此，如何開發(fā)一種對(duì)重金屬離子具有高靈敏度，強(qiáng)特異吸附性，且不需大型儀器設(shè)備，同時(shí)又不產(chǎn)生任何二次污染的環(huán)境友好的手段，是目前該領(lǐng)域亟需解決的關(guān)鍵問題。利用生物體內(nèi)的金屬特異結(jié)合蛋白來達(dá)到對(duì)某種金屬的特異識(shí)別，是近年來迅速崛起的一種先進(jìn)的檢測(cè)手段，以其檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單方便，尤其適用于生物樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，日益得到人們的青睞。在重金屬離子檢測(cè)方面，由于很多重金屬離子的電子層、結(jié)構(gòu)、價(jià)態(tài)等物理和化學(xué)性質(zhì)極為接近，目前科學(xué)家們很難設(shè)計(jì)出選擇性很強(qiáng)，能夠僅僅特異識(shí)別某種重金屬離子的化學(xué)試劑，這使得該類檢測(cè)的選擇性通常都比較低。與此相反，自然界中存在有多種選擇性極高、對(duì)金屬離子特異識(shí)別性極強(qiáng)的金屬蛋白質(zhì)。鐵、銅等是自然界微生物賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，而對(duì)于鉛、鎘、汞、金、銀等重金屬離子富集的環(huán)境，微生物必須具備識(shí)別和排異這類重金屬離子的能力才可以生存下來。因此，經(jīng)過億萬年的選擇進(jìn)化，很多微生物都具備了相應(yīng)的金屬調(diào)控蛋白質(zhì)，用以檢測(cè)和調(diào)節(jié)各種重金屬離子在體內(nèi)的含量。這些金屬蛋白對(duì)重金屬離子的特異結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了化學(xué)家所能設(shè)計(jì)的極限。近年來，以這類金屬蛋白為模板，開發(fā)相應(yīng)的生物傳感器是重金屬離子檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)方向。而進(jìn)一步的，如何在這些金屬傳感器的基礎(chǔ)上，達(dá)到檢測(cè)識(shí)別與特異吸附同時(shí)實(shí)現(xiàn)的目的，對(duì)這一領(lǐng)域提出了更高的要求。一種解決這一挑戰(zhàn)的方法，是把金屬識(shí)別蛋白與微生物體分別作為“檢測(cè)單元”和“吸附單元”同時(shí)加以利用。當(dāng)目標(biāo)金屬存在時(shí)，“檢測(cè)單元”將首先開始工作，并有效地激活后續(xù)“吸附單元”-工程化的微生物菌株，這些特殊的菌株將實(shí)現(xiàn)特異吸附目標(biāo)金屬的能力?，F(xiàn)有的重 金屬離子的處理回收方法主要是化學(xué)方法，通過加入化學(xué)試劑與重金屬離子形成沉淀或者懸浮的方法達(dá)到回收重金屬的目的。但是化學(xué)方法有三個(gè)缺點(diǎn)。第一是化學(xué)方法有可能由于加入的化學(xué)試劑的量不合適而造成二次污染；第二是化學(xué)方法選擇性不夠高，尤其是處理性質(zhì)極相近的各種重金屬效果不好，即使回收得到了一定的目的金屬，純度也不高，還需要進(jìn)一步處理；第三是化學(xué)方法回收工業(yè)廢水中的重金屬，所產(chǎn)生污水對(duì)于環(huán)境不友好，沉淀劑等化學(xué)試劑可能對(duì)于自然環(huán)境造成更大的破壞。金是重金屬中少有的化學(xué)、物理、電子性能優(yōu)異的金屬，應(yīng)用領(lǐng)域非常廣。而作為生產(chǎn)材料，金本身所具有的貨幣金屬性質(zhì)又使其成為控制生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)利潤(rùn)最大化的重要因素。但是現(xiàn)有的方法很難實(shí)現(xiàn)對(duì)工業(yè)廢水中金離子的高效選擇性富集和回收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金離子吸附蛋白，其包含大腸桿菌外膜蛋白A片段和金離子結(jié)合蛋白GolB片段。所述大腸桿菌外膜蛋白A片段的DNA序列如SEQ ID NO 3所示；所述金離子結(jié)合蛋白GolB片段的DNA序列如SEQ ID NO 6所示。優(yōu)選地，所述金離子吸附蛋白的DNA序列如SEQ ID NO 7所示。本發(fā)明還提供上述的金離子吸附蛋白的制備方法，其特征在于，主要包含步驟I)從大腸桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出編碼大腸桿菌外膜蛋白A片段的DNA序列；2)從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA中擴(kuò)增出編碼金離子結(jié)合蛋白GolB片段的DNA序列；3)以步驟I)和2)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增出編碼OmpA-GolB融合蛋白的DNA序列；4)將步驟3)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到宿主菌進(jìn)行表達(dá)，即獲得所述的金離子吸附蛋白。上述制備方法中，步驟I)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2所示的引物；步驟2)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5所示的引物；步驟3)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO: I、SEQ ID NO :5所示的引物。上述制備方法中，步驟I)所述大腸桿菌外膜蛋白A片段的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，步驟2)所述金離子結(jié)合蛋白GolB片段的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，步驟3)所述金離子吸附蛋白的DNA序列如SEQ ID NO 7所示。上述制備方法中，步驟4)所述表達(dá)載體為pBAD大腸桿菌表達(dá)載體。本發(fā)明還提供一種表達(dá)上述的金離子吸附蛋白的宿主菌，該宿主菌優(yōu)選為含pBAD表達(dá)載體的大腸桿菌。本發(fā)明還提供另外一種金離子吸附蛋白，其包含金離子誘導(dǎo)蛋白片段和antigen43 片段(SEQ ID NO 11 所示)。所述金離子誘導(dǎo)蛋白片段的DNA序列如SEQ ID NO 10所示。本發(fā)明還提提供上述的金離子吸附蛋白的制備方法，其主要包含步驟I)從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA中擴(kuò)增出編碼金離子誘導(dǎo)蛋白片段的DNA序列；2)使用DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切步驟I)的擴(kuò)增產(chǎn)物，并將酶切片段連接到含有antigen43基因的表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到宿主菌進(jìn)行表達(dá)，即獲得所述的金離子吸附蛋白。上述制備方法中，步驟I)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9所示的引物；步驟2)所述表達(dá)載體為含有antigen43基因的pSBlC3大腸桿菌表達(dá)載體。 本發(fā)明還提供一種表達(dá)上述另外一種金離子吸附蛋白的宿主菌，該宿主菌為含PSB1C3表達(dá)載體的大腸桿菌。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用上述的兩種宿主菌富集并回收廢水中的金離子的方法，其主要包含步驟I)培養(yǎng)表達(dá)上述第一種金離子吸附蛋白的第一宿主菌；2)培養(yǎng)表達(dá)上述第二種金離子吸附蛋白的第二宿主菌；3)將步驟I)培養(yǎng)的第一宿主菌加入到含金離子的廢水中，加入誘導(dǎo)劑并充分混
合，靜置；4)將步驟2)培養(yǎng)的第二宿主菌加入步驟3)所得的混合液中，當(dāng)水體中底部產(chǎn)生沉淀后,過濾水體,回收吸附有金離子的菌體；5)用酶制劑處理步驟4)回收的菌體，分離得到回收的金離子；6)處理后的菌體作為菌種循環(huán)使用，重復(fù)步驟I)至5)。根據(jù)上述的方法，步驟3)所述的誘導(dǎo)劑優(yōu)選是阿拉伯糖；步驟5)所述的酶制劑為木瓜蛋白酶。本發(fā)明所述金離子吸附蛋白能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的三個(gè)缺點(diǎn)。首先，菌體在吸附金離子之后能夠自動(dòng)聚沉，可以通過過濾等方法回收，不會(huì)造成二次污染。第二，本發(fā)明是針對(duì)重金屬性質(zhì)相近的特點(diǎn)，選擇了可高效特異吸附金離子的模型，其在存在多種重金屬離子時(shí)仍能高效吸附金離子。最后，本發(fā)明是環(huán)境友好型的，不會(huì)造成環(huán)境的影響。另外，菌體采用的是非致病性的大腸桿菌，既不會(huì)對(duì)人體造成影響，甚至在自然環(huán)境下也難以生存，所以不會(huì)造成微生物污染。另外，傳統(tǒng)的離子交換法和膜過濾法等等進(jìn)行比較，本發(fā)明具備價(jià)格便宜，操作方便等的優(yōu)點(diǎn)。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖I是OmpA-GolB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。圖2是OmpA-GolB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的電泳鑒定圖，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I是OmpA-Golb融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。圖3 是 Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene with antigen43)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。
圖4 是 Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene with antigen43)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的電泳鑒定圖，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I是Antigen43-金離子誘導(dǎo)基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。圖5是OmpA-GolB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序圖譜。圖6是Antigen43_金離子誘導(dǎo)基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序圖譜。圖7是水體中金離子的吸附效率示意圖。圖8A-8B分別是菌體金離子回收效率及循環(huán)使用后菌體生長(zhǎng)水平示意圖。圖9是水體中存在多種重金屬離子時(shí)對(duì)金離子的選擇性吸附示意圖。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例IOmpA-GolB融合蛋白的構(gòu)建及鑒定I.大腸桿菌外膜蛋白A(OmpA)片段的基因擴(kuò)增根據(jù)所需擴(kuò)增目的DNA序列和堿基互配原理，設(shè)計(jì)特異引物Ompal (SEQ ID NO 1)和0mpa2(SEQ ID NO :2)，從大腸桿菌基因組DNA (NCBI中的引用位置NC 000913)中擴(kuò)增出編碼大腸桿菌外膜蛋白A(OmpA)第I位至第159位氨基酸的DNA序列(SEQ ID NO 3)。反應(yīng)條件如下PCR 反應(yīng)體系50 μ IddH20 36 μ IIOX Pfu DNA 聚合酶緩沖液5 μ IIOmMdNTP:I μ I正向引物OmpalI μ I反向引物0mpa2I μ IPfu DNA 聚合酶I μ IDNA 模板5 μ IPCR 條件第一步95°C 2分鐘第二步95°C O. 5 分鐘第三步63 °C O. 5分鐘第四步72°C0.5分鐘第五步重復(fù)第二步至第四步，29個(gè)循環(huán)第六步72 °C 10分鐘第七步4°C保溫?；厥誔CR產(chǎn)物，備用。2.金離子結(jié)合蛋白GolB片段的基因擴(kuò)增根據(jù)所需擴(kuò)增目的DNA序列和堿基互配原理，設(shè)計(jì)特異引物Golbl (SEQ ID NO 4)和Golb2(SEQ ID NO 5)從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA(NCBI中的引用位置NC 003197)中擴(kuò)增出編碼金離子結(jié)合蛋白GolB的DNA序列(SEQ ID NO :6)，并在其C端加上編碼FLAG-tag的序列反應(yīng)條件如下
PCR 反應(yīng)體系50 μ IddH20 36 μ IIOX Pfu DNA 聚合酶緩沖液5μ IIOmMdNTP:I μ I正向引物GolblI μ I反向引物Golb2I μ IPfu DNA 聚合酶I μ I
DNA 模板5 μ IPCR 條件第一步95°C 2分鐘第二步95°C O. 5 分鐘第三步60°C O. 5分鐘第四步72°C0.5分鐘第五步重復(fù)第二步至第四步，29個(gè)循環(huán)第六步72 °C 10分鐘第七步4°C保溫回收PCR產(chǎn)物，備用。3. OmpA-GolB融合蛋白的基因擴(kuò)增使用特異引物Ompal (SEQ ID NO 1)和Golb2(SEQ ID NO 5)以上述第I和2點(diǎn)回收的PCR產(chǎn)物為模板，采用重疊PCR擴(kuò)增出編碼用于大腸桿菌表面展示的OmpA-GolB融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO 7)反應(yīng)條件如下PCR 反應(yīng)體系50 μ IddH20 36 μ IIOX UltraII DNA 聚合酶緩沖液5μ1IOmMdNTP:I μ I正向引物OmpalI μ I反向引物Golb2I μ IUltraII DNA 聚合酶Ιμ DNA 模板0mpA PCR 產(chǎn)物O. 5 μ IGolB PCR 產(chǎn)物O. 5 μ IPCR 條件第一步95°C 2分鐘第二步95°C O. 5 分鐘第三步60°C O. 5分鐘第四步72°C0.5分鐘第五步重復(fù)第二步至第四步，29個(gè)循環(huán)第六步72 °C 10分鐘第七步4°C保溫
回收PCR產(chǎn)物，備用。4. OmpA-GolB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定I)使用DNA限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII酶解上述第3點(diǎn)中得到的DNA片段(即SEQ ID勵(lì)7)，然后使用了40嫩連接酶插入含有可由阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)的&以840啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)載體pBAD(由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院昌增益教授實(shí)驗(yàn)室葛曦博士饋贈(zèng))中，OmpA-GolB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜請(qǐng)?jiān)斠妶DI。
酶切反應(yīng)體系20μ1DNA (OmpA-GolB PCR 產(chǎn)物)1.5pg
10 X K 緩沖液 (TAKARA)2 μ
10 X BSA 緩沖液(TAKARA)2 μ
Ncol(TAKARA)1.5 μ Hindlll(TAKARA)2 μ ddH20補(bǔ)齊至20 μ 反應(yīng)條件37°C水浴 10 小時(shí)。
DNA連接反應(yīng)體系10 μ (100 ng DNA) OmpA-GolB 酶切產(chǎn)物37.5 ng pBAD大腸桿菌表達(dá)載體62.5 ng
10 X T4 連接酶緩沖液(Fermentas)I μ Τ4 連接酶(Fermentas)0.5 μ ddH20補(bǔ)齊至10 μ 反應(yīng)條件16°C水浴 16 小時(shí)。2)OmpA-GolB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的提取與鑒定,結(jié)果請(qǐng)見圖2。實(shí)施例2Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene with antigen43)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定I.金離子誘導(dǎo)基因的擴(kuò)增 使用特異引物pGoltsl(SEQ ID NO 8)和pGolb2(SEQ ID NO 9)從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA (NCBI中的引用位置NC 003197)中擴(kuò)增出編碼Gold inductive gene的DNA序列(SEQ ID NO 10)。反應(yīng)條件如下PCR 反應(yīng)體系50 μ IddH20 36 μ IIOX Pfu DNA 聚合酶緩沖液5μ IIOm MdNTP I μ I正向引物pGoltslI μ I反向引物pGolb2I μ I Pfu DNA 聚合酶Ιμ DNA 模板5 μ IPCR 條件第一步95°C 3分鐘第二步95°C I分鐘第三步60°C2分鐘第四步72°C4分鐘第五步重復(fù)第二步至第四步，29個(gè)循環(huán)第六步72 °C 10分鐘第七步4°C保溫回收PCR產(chǎn)物，備用。2. Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene with antigen43)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定I)使用DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切上述第I點(diǎn)得到的DNA片段(SEQ IDNO 10)，然后使用T4DNA連接酶插入含有antigen43基因的大腸桿菌表達(dá)載體PSB1C3 (由2010iGEM大賽總部饋贈(zèng))中，Antigen43-金離子誘導(dǎo)基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜請(qǐng)?jiān)斠妶D3。
酶切反應(yīng)體系20μ1
DNA (Gold inductive gene PCR 產(chǎn)物)1.5pg
10 X H 緩沖液(TAKARA)2μ1
EcoRl(TAKARA)1·5μ1
Xbal(TAKARA)2μ1
ddH20補(bǔ)齊至20 μ 反應(yīng)條件37°C水浴 10 小時(shí)。DNA連接反應(yīng)體系10 μ (100 ng DNA)
Gold inductive gene 酶切產(chǎn)物37.5 ng
PSB1C3大腸桿菌表達(dá)載體62.5 ng
10 X T4 連接酶緩沖液(Fermentas)I μ
Τ4 連接酶(Fermentas)0.5 μ
ddH20補(bǔ)齊至10 μ 反應(yīng)條件16°C水浴 16 小時(shí)。2)Antigen43_金離子誘導(dǎo)基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的提取與鑒定,結(jié)果請(qǐng)見圖4。實(shí)施例30mpA-GolB 融合蛋白、Antigen43_金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive genewith antigen43)融合蛋白轉(zhuǎn)入宿主菌及宿主菌的培養(yǎng)I. OmpA-GolB融合蛋白轉(zhuǎn)入宿主菌I)將用于表達(dá)OmpA-GolB融合蛋白的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞DHlOb中，通過在含有氨芐青霉素(50 μ g ml/1)的LB固體培養(yǎng)基上于37°C中培養(yǎng)16小時(shí)，從中篩選出陽性克隆并加以保存。感受態(tài)細(xì)胞的熱激轉(zhuǎn)化和稀釋涂布步驟如下①將連接反應(yīng)的產(chǎn)物于感受態(tài)細(xì)胞(DHlOb)中，手指輕彈混勻；②冰浴30分鐘后42 0C熱激95秒，快速轉(zhuǎn)移至冰上；③冰浴2分鐘后每管加入事先37 °C預(yù)熱好的LB培養(yǎng)基900 μ I，37 °C，200rpm培養(yǎng)I小時(shí)使其復(fù)蘇；④3000rpm離心30秒，移去O. 9ml上清后，取下層O. Iml涂布相應(yīng)的抗性平板，37°C培養(yǎng)10小時(shí)。2)重組菌的篩選和鑒定采用常規(guī)菌落PCR法和抽提陽性克隆的質(zhì)粒后酶切鑒定法，具體可參見《TAKARA限制性內(nèi)切酶采購(gòu)目錄和技術(shù)指南》。測(cè)序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。OmpA-GolB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序圖譜請(qǐng)見圖5。2. Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene with antigen43)融合蛋白轉(zhuǎn)入宿主菌I)將用于表達(dá) Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene withantigen43)融合蛋白的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞DHlOb中，通過在含有氯霉素(34 μ g πιΓ1)的LB固體培養(yǎng)基上于37°C中培養(yǎng)16小時(shí)，從中篩選出陽性克隆并加以保存。感受態(tài)細(xì)胞的熱激轉(zhuǎn)化和稀釋涂布步驟如下①將連接反應(yīng)的產(chǎn)物于感受態(tài)細(xì)胞(DHlOb)中，手指輕彈混勻；②冰浴30分鐘后42°C熱激95s，快速轉(zhuǎn)移至冰上；
③冰浴2分鐘后每管加入事先37 °C預(yù)熱好的LB培養(yǎng)基900 μ I，37 °C，200rpm培養(yǎng)I小時(shí)使其復(fù)蘇；④3000rpm離心30秒，移去O. 9ml上清后，取下層O. Iml涂布相應(yīng)的抗性平板，37°C培養(yǎng)10小時(shí)。2)重組菌的篩選和鑒定采用常規(guī)菌落PCR法·和抽提陽性克隆的質(zhì)粒后酶切鑒定法，具體可參見《TAKARA限制性內(nèi)切酶采購(gòu)目錄和技術(shù)指南》。測(cè)序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。Antigen43-金離子誘導(dǎo)基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序圖譜請(qǐng)見圖6。3.誘導(dǎo)培養(yǎng)I)將用于表達(dá)OmpA-GolB融合蛋白的大腸桿菌菌種接入適量含有氨節(jié)青霉素(50 μ g πιΓ1)的LB液體培養(yǎng)基中于37°C中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液I : 100稀釋入適量含有氨芐青霉素(50 μ g πιΓ1) LB液體培養(yǎng)基中于37°C中培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD6tltl = O. 6，向培養(yǎng)液中加入終濃度為O. 002%的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)液在37°C中繼續(xù)培養(yǎng)過夜。2)將用于表達(dá) Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene withantigen43)融合蛋白的大腸桿菌菌種接入適量含有氯霉素(34 μ g mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中于37°C中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液I : 100稀釋入適量含有氯霉素(34 μ g mLlLB液體培養(yǎng)基中于37 °C中培養(yǎng)過夜。實(shí)施籃IOmpA-GolB融合蛋白的金離子吸附能力的檢測(cè)I.將用于表達(dá)OmpA-GolB融合蛋白的大腸桿菌菌種接入適量含有氨節(jié)青霉素(50 μ g πιΓ1)的LB液體培養(yǎng)基中于37°C中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液I : 100稀釋入適量含有氨芐青霉素(50 μ g πιΓ1) LB液體培養(yǎng)基中于37°C中培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD6tltl = O. 6，向培養(yǎng)液中同時(shí)加入終濃度為O. 002 %的阿拉伯糖和終濃度為50 μ M的金離子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)和金離子吸附，培養(yǎng)液在37°C中繼續(xù)培養(yǎng)過夜；2.培養(yǎng)過夜的細(xì)菌培養(yǎng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，IOmin)收集后，用去離子水清洗至少3次；3.清洗后的菌體經(jīng)過真空凍干成粉末狀固體，稱重；4.采用ICP-AES標(biāo)準(zhǔn)流程灰化消解后，通過電感偶和等離子體發(fā)射光譜儀對(duì)金離子結(jié)合情況進(jìn)行檢測(cè)。具體檢測(cè)結(jié)果請(qǐng)見圖7，與未經(jīng)改造的對(duì)照菌株相比，其對(duì)水體中金離子的吸附能力提高了近12倍，達(dá)到干重每克菌體可吸附金約2. 4毫克。實(shí)施例5菌體的分離和金離子的回收I.吸附有金離子的大腸桿菌工程菌體細(xì)胞可通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，IOmin)的方式，從液體中分離獲得；2.從吸附有金離子的大腸桿菌工程細(xì)胞回收金離子，將離心分離得到的大腸桿菌工程菌體細(xì)胞重懸于適量含有5mg ml/1木瓜蛋白酶Papain的PBS (pH 7.4)緩沖溶液中，反應(yīng)液于30°C反應(yīng)3小時(shí)；3.經(jīng)過木瓜蛋白酶處理后的反應(yīng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，IOmin)，將液體上清與可循環(huán)使用的大腸桿菌工程菌體細(xì)胞分離開來。液體上清中含有從菌體細(xì)胞上回收得到的金離子。
采用酶降解法對(duì)吸附有金離子的菌體進(jìn)行處理后，金(離子)的有效回收效率可達(dá)到近40% (圖8A-8B)。其在存在多種重金屬離子時(shí)仍能高效吸附金離子(圖9)。實(shí)施例6金離子誘導(dǎo)表汰Antigen43~金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive genewith antigen43)融合蛋白的大腸桿菌菌體沉聚的檢測(cè)方法I.將用于表達(dá) Antigen43_ 金離子誘導(dǎo)基因(Gold inductive gene withantigen43)融合蛋白的大腸桿菌菌種接入適量含有氯霉素(34 μ g mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中于37°C中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液I : 100稀釋入適量含有氯霉素(34 μ g mLlLB液體培養(yǎng)基中于37 °C中培養(yǎng)過夜；2.將培養(yǎng)過夜的菌體用磷酸緩沖液(PBS pH 7. 4)重新懸浮均勻，至OD6tltl = I. 00，加入終濃度為O. 15mM的氯化鈉，充分混勻； 3.向反應(yīng)液中加入終濃度為50μΜ的金離子，隨著時(shí)間的增加，反應(yīng)液中的菌體會(huì)聚集沉淀下來。本發(fā)明基于一系列能夠和金離子特異結(jié)合的MerR家族蛋白=GolS和GolB蛋白，其中在宿王囷中，GoIB蛋白的表達(dá)還可以通過GolS蛋白來進(jìn)打調(diào)控。通過上述的不例性實(shí)施例，將GolB蛋白與細(xì)胞外膜表達(dá)蛋白相融合，并在前端加入araBAD的啟動(dòng)子，連接到質(zhì)粒中后導(dǎo)入非致病性的大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)，使得融合蛋白能夠在微量阿拉伯糖的誘導(dǎo)下大量表達(dá)，該種蛋白的特點(diǎn)是能夠在細(xì)菌的外膜表面上實(shí)現(xiàn)對(duì)金離子的高效特異性結(jié)合。因此該種經(jīng)過改造后的工程菌對(duì)金離子的吸附效果很好，而且經(jīng)過回收處理的菌體還可以作為菌種進(jìn)行二次循環(huán)利用，其吸附效率與處理前沒有顯著差異。另一方面，利用GolS蛋白和antigen43抗體蛋白結(jié)合,并在兩者之間加入了 GolB蛋白的啟動(dòng)子,使得這個(gè)抗體蛋白也能夠在金離子的誘導(dǎo)下表達(dá)使得菌體聚沉。這樣，將上述兩者相結(jié)合的工程菌可以作含金工業(yè)廢水的處理用將菌液加入到廢水中，在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下，菌體能夠在細(xì)胞膜外大量表達(dá)GolB蛋白，將廢水中的金離子結(jié)合。隨后，在完成金離子的結(jié)合吸附后，細(xì)菌還能通過表達(dá)antigen43蛋白，自主性地聚集和沉淀，方便對(duì)菌體的回收。通過對(duì)菌體的酶處理和二次使用，本項(xiàng)發(fā)明最終能夠通過生物手段實(shí)現(xiàn)對(duì)工業(yè)廢水中重金屬一金的可循環(huán)富集和回收。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許之更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種金離子吸附蛋白，其特征在于，包含大腸桿菌外膜蛋白A片段和金離子結(jié)合蛋白GolB片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金離子吸附蛋白，其特征在于，所述大腸桿菌外膜蛋白A片段的DNA序列如SEQ ID NO :3所示；所述金離子結(jié)合蛋白GolB片段的DNA序列如SEQ IDNO 6所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金離子吸附蛋白，其特征在于，所述金離子吸附蛋白的DNA序列如SEQ ID NO 7所示。
4.一種權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的金離子吸附蛋白的制備方法，其特征在于，包含步驟1)從大腸桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出編碼大腸桿菌外膜蛋白A片段的DNA序列；2)從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA中擴(kuò)增出編碼金離子結(jié)合蛋白GolB片段的DNA序列；3)以步驟I)和2)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增出編碼OmpA-GolB融合蛋白的DNA序列；4)將步驟3)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到宿主菌進(jìn)行表達(dá)，即獲得所述的金離子吸附蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金離子吸附蛋白的制備方法，其特征在于，步驟I)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO USEQ ID NO 2所示的引物；步驟2)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5所示的引物；步驟3)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 5所示的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金離子吸附蛋白的制備方法，其特征在于，步驟I)所述大腸桿菌外膜蛋白A片段的DNA序列如SEQ ID NO :3所示，步驟2)所述金離子結(jié)合蛋白GolB片段的DNA序列如SEQ ID NO 6所示，步驟3)所述金離子吸附蛋白的DNA序列如SEQ IDNO 7所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金離子吸附蛋白的制備方法，其特征在于，步驟4)所述表達(dá)載體為pBAD大腸桿菌表達(dá)載體。
8.一種宿主菌，其特征在于，表達(dá)權(quán)利要求I所述的金離子吸附蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌為含pBAD表達(dá)載體的大腸桿菌。
10.一種金離子吸附蛋白，其特征在于，包含金離子誘導(dǎo)蛋白片段和antigen43片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的金離子吸附蛋白，其特征在于，所述金離子誘導(dǎo)蛋白片段的DNA序列如SEQ ID NO 10所示。
12.—種權(quán)利要求10或11所述的金離子吸附蛋白的制備方法，其特征在于，包含步驟1)從鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA中擴(kuò)增出編碼金離子誘導(dǎo)蛋白片段的DNA序列；2)使用DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切步驟I)的擴(kuò)增產(chǎn)物，并將酶切片段連接到含有antigen43基因的表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到宿主菌進(jìn)行表達(dá)，即獲得所述的金離子吸附蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的金離子吸附蛋白的制備方法，其特征在于，步驟I)中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9所示的引物；步驟2)所述表達(dá)載體為含有antigen43基因的pSBlC3大腸桿菌表達(dá)載體。
14.一種宿主菌，其特征在于，表達(dá)權(quán)利要求10所述的金離子吸附蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌為含pSBlC3表達(dá)載體的大腸桿菌。
16.—種應(yīng)用權(quán)利要求8和14所述的宿主菌富集并回收廢水中的金離子的方法，其特征在于，包含步驟1)培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主菌；2)培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的宿主菌；3)將步驟I)培養(yǎng)的宿主菌加入到含金離子的廢水中，加入誘導(dǎo)劑并充分混合，靜置；4)將步驟2)培養(yǎng)的宿主菌加入步驟3)所得的混合液中，當(dāng)水體中底部產(chǎn)生沉淀后，過濾水體，回收吸附有金離子的菌體；5)用酶處理步驟4)回收的菌體，分離得到回收的金離子；6)處理后的菌體作為菌種循環(huán)使用，重復(fù)步驟I)至5)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的誘導(dǎo)劑是阿拉伯糖；步驟5)所述的酶為木瓜蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種金離子吸附蛋白及富集并回收金離子的方法。其中所述金離子吸附蛋白包含大腸桿菌外膜蛋白A片段和金離子結(jié)合蛋白GolB片段；或者包含金離子誘導(dǎo)蛋白片段和antigen43片段。本發(fā)明所述的金離子吸附蛋白及富集并回收金離子的方法能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，不會(huì)造成二次污染；其在存在多種重金屬離子時(shí)仍能高效吸附其中的金離子；而且是環(huán)境友好型的，不會(huì)造成對(duì)環(huán)境的影響；且所述的金離子吸附蛋白容易制備、成本較低、操作方便。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102924602SQ201110226028
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者陳鵬, 趙勁, 魏煒, 陳興 申請(qǐng)人:深圳市艾派格生物技術(shù)有限公司