一種黑曲霉麩曲孢子活力的評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種評(píng)價(jià)黑曲霉麩曲孢子活力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬酸（Citric Acid)是一種具有多種功能的重要有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī) 藥、化工等領(lǐng)域；是當(dāng)前世界上產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的食用有機(jī)酸，全球產(chǎn)量超過170萬(wàn)噸。 同時(shí)，檸檬酸又具有優(yōu)良的生物特性，在生物聚合、藥物運(yùn)輸、細(xì)胞培養(yǎng)等新興產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域有 巨大的應(yīng)用潛力，其需求量以每年5%的速度增長(zhǎng)。
[0003] 黑曲霉（Aspergillus niger)是一類重要的工業(yè)微生物，由于具有酶系安全，利用 碳源種類多，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，耐酸能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而備受檸檬酸產(chǎn)業(yè)的親睞。工業(yè)化生產(chǎn)中， 一批成熟的黑曲霉孢子需要經(jīng)過試管斜面培養(yǎng)、茄子瓶培養(yǎng)、麩曲桶等方式逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。 由于孢子活力缺乏有效的考察標(biāo)準(zhǔn)，一般通過將其轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，通過比較發(fā)酵產(chǎn)酸效 果，以此來(lái)作為傳代擴(kuò)大培養(yǎng)的指標(biāo)；但這種方法所需周期較長(zhǎng)、工作量相對(duì)較大，缺乏系 統(tǒng)性和規(guī)范性，同時(shí)延長(zhǎng)了孢子培養(yǎng)周期。
[0004] 目前，關(guān)于細(xì)胞活力評(píng)價(jià)方法主要集中在生物醫(yī)學(xué)工程方面，檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)和 增殖，新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等，價(jià)格低廉成為細(xì)胞活性檢測(cè)的主要方法。常用的方法有 MTT法，F(xiàn)CM法，ATP法等，測(cè)定的基本原理主要利用了細(xì)胞膜的完整性和新陳代謝的能力。 但這些檢測(cè)方法存在操作流程較長(zhǎng)，反應(yīng)試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配，像MTT具有致癌性，儀器價(jià)格 昂貴等缺陷。
[0005] 麩曲孢子為黑曲霉特殊的休眠體，孢子壁較厚且通透性差，外源物質(zhì)難于介入；同 時(shí)孢子之間作用力較強(qiáng)，孢子粘附在一起，很難形成分散均勻的單孢子；因而，關(guān)于黑曲霉 麩曲孢子活力研宄鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請(qǐng)人提供了一種黑曲霉麩曲孢子活力的評(píng)價(jià) 方法。本發(fā)明可以有效縮短成熟種子培養(yǎng)時(shí)間，提高原料利用率；其它微生物孢子活力評(píng) 價(jià)，均適用本技術(shù)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種黑曲霉麩曲孢子活力的評(píng)價(jià)方法，包括如下步驟：
[0009] (1)取培養(yǎng)成熟的黑曲霉麩曲孢子，用磷酸緩沖液清洗麩曲孢子，用三層紗布過 濾，獲得黑曲霉麩曲孢子懸液；
[0010] ⑵在黑曲霉麩曲孢子懸液中添加〇. 05% (v/v)的吐溫80,同時(shí)在超聲波清洗儀 中處理，獲得分散均勻的單孢子懸液，并調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為1〇6~10 7個(gè)/mL ;
[0011] ⑶用磷酸緩沖液配置8~14mg/L濃度的亞甲基藍(lán)溶液；
[0012] (4)將步驟⑵與⑶的溶液按照v/v為1:1的比例于比色皿中混合均勾，并用蓋 子密封，反應(yīng)420s，于663nm波長(zhǎng)處掃描吸光度-時(shí)間曲線；
[0013] (5)測(cè)定反應(yīng)體系初始與反應(yīng)結(jié)束的吸光度，以吸光度的變化表征細(xì)胞活力大小。
[0014] 步驟⑴與（3)緩沖液pH范圍為6. 5~9. 0。
[0015] 步驟（2)超聲波清洗儀處理時(shí)間為30~120s。
[0016] 亞甲基藍(lán)用刃天青或其他還原性染料代替。
[0017] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0018] 本發(fā)明技術(shù)目的是針對(duì)檸檬酸生產(chǎn)菌種的黑曲霉麩曲孢子逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)存在流 程復(fù)雜、周期長(zhǎng)、孢子活力篩選工作量大等問題，提供一種評(píng)價(jià)黑曲霉麩曲孢子活力評(píng)價(jià)方 法，提高種子活力，同時(shí)可以有效縮短成熟種子培養(yǎng)時(shí)間，提高原料利用率。
[0019] 亞甲基藍(lán)染色法可對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)，活細(xì)胞中的還原酶能使浸入細(xì)胞內(nèi) 的亞甲基藍(lán)脫色，但死細(xì)胞由于酶失活，不發(fā)生脫色作用而保留初始的藍(lán)色。本發(fā)明在黑曲 霉麩曲孢子懸液中添加吐溫80分散孢子，在超聲波清洗儀中處理進(jìn)一步分散孢子，同時(shí)能 夠疏松孢子壁提高通透性，從而便于基于亞甲基藍(lán)還原性的特點(diǎn)，建立一種評(píng)價(jià)黑曲霉麩 曲孢子活力的方法。
[0020] 本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)有：
[0021] (1)本發(fā)明能夠定量直接反應(yīng)孢子活力，具有準(zhǔn)確度高，檢測(cè)速度快，安全無(wú)毒，對(duì) 設(shè)備要求低和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)；
[0022] (2)提高種子活力，同時(shí)可以有效縮短成熟種子培養(yǎng)時(shí)間，提高原料利用率；
[0023] (3)可以解決傳統(tǒng)孢子活力評(píng)價(jià)方法孢子活力篩選工作量大，靈敏度低，無(wú)需嚴(yán)格 的無(wú)菌操作，易受雜菌污染影響，周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，提高活力檢測(cè)針對(duì)性。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為實(shí)施例1不同活力的孢子與吸光度變化量曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。在下面所有的實(shí)施方案中，孢子計(jì)數(shù)采 用血球計(jì)數(shù)板。孢子活力檢測(cè)采用亞甲基藍(lán)褪色程度表征，通過吸光度的變化表征活力。其 它無(wú)特殊說(shuō)明，均采用本領(lǐng)域常用的知識(shí)和方法。下面實(shí)施例中的黑曲霉種子的來(lái)源是江 蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司生產(chǎn)菌種。
[0026] 實(shí)施例1 :
[0027] 配置PDA平板，試管斜面和茄子瓶培養(yǎng)基。玉米芯顆粒與水按照1:1比例混合均 勻，添加玉米漿調(diào)節(jié)總氮量含量（TN = 1%~3% )，滅菌，獲得麩曲桶培養(yǎng)基。黑曲霉菌種 接種于PDA平板培養(yǎng)基活化，35~38°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)40~48h ;挑取單菌落接種試管斜面， 35~38°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5~7天，獲得成熟的黑曲霉孢子；挑取一環(huán)試管斜面孢子，接種前 子瓶培養(yǎng)基，35~38°C培養(yǎng)8~10天，獲得成熟的黑曲霉孢子；無(wú)菌水清洗茄子瓶孢子，獲 得孢子菌懸液，轉(zhuǎn)接麩曲桶，每天翻桶2~3次，35~38°C培養(yǎng)8~10天，獲得成熟的黑曲 霉麩曲孢子。
[0028] 取一定量的麩曲孢子，用pH 7. 0的磷酸緩沖液清洗麩曲孢子，用三層紗布過濾玉 米芯顆粒。在黑曲霉麩曲孢子懸液中添加0.05% (v/v)的吐溫80,在超聲波清洗儀中處理 30s，獲得分散均勻的單孢子懸液，調(diào)節(jié)孢子濃度107個(gè)/mL。取新鮮孢子液與滅活處理后的 孢子液分別按照 0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6 :4、7:3、8:2、9:1、10:0 比例混合均勻，配置 不同活力的孢子懸液。
[0029] 分別取lmL上述孢子懸液與lmL的8mg/L亞甲基藍(lán)溶液于比色皿中，蓋上比色皿 蓋，反應(yīng)420s，于663nm波長(zhǎng)處吸光度-時(shí)間掃描曲線，測(cè)定反應(yīng)體系初始與反應(yīng)結(jié)束的吸 光度，以吸光度的變化表征細(xì)胞活力大小。獲得不同活力孢子與吸光度的變化量如圖1所 述。
[0030] 從圖1中可以看出，隨著體系中孢子活力（即活孢子濃度）增加，其對(duì)亞甲基藍(lán)的 褪色反應(yīng)程度越劇烈，亞甲基藍(lán)的褪色程度AA與體系中鮮活孢子含量之間存在較好的線 性相關(guān)（y = 〇. 008x+0. 227, R2= 0. 995)。由此可以說(shuō)明，亞甲基藍(lán)的褪色程度，可以很好 的反映體系中細(xì)胞的活力情況。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 配置PDA平板，試管斜面和茄子瓶培養(yǎng)基。玉米芯顆粒與水按照1:1比例混合均 勻，添加玉米漿調(diào)節(jié)總氮量含量（TN = 1%~3% )，滅菌，獲得麩曲桶培養(yǎng)基。黑曲霉菌種 接種于PDA平板培養(yǎng)基活化，35~38°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)40~48h ;挑取單菌落接種試管斜面， 35~38°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5~7天，獲得成熟的黑曲霉孢子；挑取一環(huán)試管斜面孢子，接種前 子瓶培養(yǎng)基，35~38°C培養(yǎng)8~10天，獲得成熟的黑曲霉孢子；無(wú)菌水清洗茄子瓶孢子，獲 得孢子菌懸液，轉(zhuǎn)接麩曲桶，每天翻桶2~3次，35~38°C培養(yǎng)8~10天，獲得成熟的黑曲 霉麩曲孢子。
[0033] 取一定的麩曲孢子，用pH 9. 0的磷酸緩沖液清洗麩曲孢子，用三層紗布過濾玉米 芯顆粒。在黑曲霉麩曲孢子懸液中添加0.05% (v/v)的吐溫80,在超聲波清洗儀中處理 120s，獲得分散均勻的單孢子懸液，調(diào)節(jié)孢子濃度107個(gè)/mL。取5mL新鮮麩曲孢子懸液，依 次向試管中加入0、1、2、3、4、51^加熱殺死的孢子懸液，剩余體積用口119.0的磷酸緩沖液補(bǔ) 充，定容體積10mL，配置同等活力、不同濃度的麩曲孢子懸液。
[0034] 分別取lmL上述孢子懸液與lmL的12mg/L亞甲基藍(lán)溶液于比色皿中，蓋上比色皿 蓋，反應(yīng)420s，于663nm波長(zhǎng)處吸光度-時(shí)間掃描曲線，測(cè)定反應(yīng)體系初始與反應(yīng)結(jié)束的吸 光度，以吸光度的變化表征細(xì)胞活力大小。獲得同等活力、不同濃度的麩曲孢子懸液與吸光 度的變化量如表1所述。從表1中可以看出，同等活力孢子、不同濃度的麩曲孢子懸液的褪 色程度基本是一致的。由此可以說(shuō)明，亞甲基藍(lán)的褪色程度，可以很好的反映體系中細(xì)胞的 活力情況。
[0035] 表1同等活力孢子的亞甲基藍(lán)還原反應(yīng)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黑曲霉麩曲孢子活力的評(píng)價(jià)方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 取培養(yǎng)成熟的黑曲霉麩曲孢子，用磷酸緩沖液清洗麩曲孢子，用三層紗布過濾，獲 得黑曲霉麩曲孢子懸液； (2) 在黑曲霉麩曲孢子懸液中添加0. 05% (v/v)的吐溫80,同時(shí)在超聲波清洗儀中處 理，獲得分散均勻的單孢子懸液，并調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為IO6~10 7個(gè)AiL; (3) 用磷酸緩沖液配置8~14mg/L濃度的亞甲基藍(lán)溶液； (4) 將步驟⑵與（3)的溶液按照v/v為1:1的比例于比色皿中混合均勾，并用蓋子密 封，反應(yīng)420s，于663nm波長(zhǎng)處掃描吸光度-時(shí)間曲線； (5) 測(cè)定反應(yīng)體系初始與反應(yīng)結(jié)束的吸光度，以吸光度的變化表征細(xì)胞活力大小。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)與（3)緩沖液pH范圍為6. 5~ 9. 0 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)超聲波清洗儀處理時(shí)間為30~ 120s〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于亞甲基藍(lán)用刃天青或其他還原性染料代 替。
【專利摘要】一種黑曲霉麩曲孢子活力的評(píng)價(jià)方法：(1)取培養(yǎng)成熟的黑曲霉麩曲孢子，用磷酸緩沖液清洗，過濾，獲得黑曲霉麩曲孢子懸液；(2)添加0.05％(v/v)的吐溫80，超聲波處理，獲得分散均勻的單孢子懸液，調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為106～107個(gè)/mL；(3)用磷酸緩沖液配置8～14mg/L濃度的亞甲基藍(lán)溶液；(4)將步驟(2)與(3)的溶液按照v/v為1:1的比例于比色皿中混合均勻密封，反應(yīng)420s，于663nm波長(zhǎng)處掃描吸光度-時(shí)間曲線；(5)測(cè)定反應(yīng)體系初始與反應(yīng)結(jié)束的吸光度，以吸光度的變化表征細(xì)胞活力大小。本發(fā)明可以有效縮短成熟種子培養(yǎng)時(shí)間，提高原料利用率；其它微生物孢子活力評(píng)價(jià)，均適用本技術(shù)。
【IPC分類】C12R1-685, C12Q1-02
【公開號(hào)】CN104789635
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510224891
【發(fā)明人】石貴陽(yáng), 王寶石, 張 杰, 胡志杰, 蔣小東, 孫福新, 張梁, 李由然, 丁重陽(yáng), 李贏, 顧正華
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年5月5日