專利名稱：一種利用黑曲霉液體發(fā)酵助提紅棗色素的方法
一種利用黑曲霉液體發(fā)酵助提紅棗色素的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于果品色素提取技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及采用微生物技術(shù)手段提取果品色素的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
天然色素是食品、保健和化妝品等領(lǐng)域重要的添加劑.與合成色素相比，其最大的優(yōu)點是安全性較高.而且大多數(shù)含較高的營養(yǎng)價值和藥理活性。紅棗在我國南北各地都有分布.產(chǎn)量大，而且富含天然紅色素。以紅棗或者加工過程中的大量廢棄棗皮提取紅色素，既綜合利用了紅棗資源，也對環(huán)境保護大有益處。研究表明紅棗紅色素對氧化劑、還原劑等均具有良好的穩(wěn)定作用，是一種理想的食品添加劑與藥用原料。
紅棗富含多種營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)和保健功效。據(jù)報道，紅棗含有多種酚類物質(zhì)，且具有較高的抗氧化活性，尤其是棗皮，但目前關(guān)于棗皮紅色素的研究較少。而紅棗紅色素是天然的綠色型色素，其色彩鮮艷，具有特殊香味，可增加食品風味。如將它添加在仿生食品中，可以改善食品色調(diào)，又與天然色澤相近，從而促進消費者的食欲且安全性高。紅棗紅色素用于飲料、糖果、酒品等著色，使其色彩艷麗動人。味道酸甜可口。另外，紅棗紅色素還具有一定的保健作用，添加到保健品中可有助于人們的健康。
隨著人們生活水平的提高，對食品感官質(zhì)量要求也越來越高，開發(fā)色調(diào)鮮艷，安全無毒的天然食用色素新產(chǎn)品已成為目前天然產(chǎn)物領(lǐng)域研究熱點之一。紅棗紅色素具有良好的穩(wěn)定性和藥理活性.可滿足化妝品、食品、染料、飲料等不同行業(yè)的需求，是一種極具開發(fā)前景的天然色素。我國紅棗資源豐富.但對其的綜合開發(fā)利用尚少。從紅棗中提取紅色素大多處于試驗研究階段.實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還需大量探索與實踐。紅棗紅色素提取工藝目前的研究熱點是優(yōu)化工藝條件，提高提取率。對高純度的紅棗紅色索很精制工藝研究不多，仍需在此方面努力，這也是今后有關(guān)紅棗紅色素研究的發(fā)展趨勢。同時，作為重要的食品添加齊U，紅棗紅色素提取過程中的安全性問題與綠色化生產(chǎn)也應引起研究人員的注意。此外，應加大研發(fā)力度，以期提高產(chǎn)品質(zhì)量，大幅度降低生產(chǎn)成本，獲得良好的經(jīng)濟效益和社會效.、Mo
植物纖維素作為細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分存在于所有的植物中，它是一種均勻葡聚糖，由(l，4)-a-D-吡喃葡萄糖基單位的直鏈所組成。果膠物質(zhì)主要是由(l，4)-a-D-批喃半乳糖醛酸基單位組·成的高聚物，存在于細胞壁的中間層。采用纖維素酶和果膠酶的復合酶可以將植物的細胞壁破碎，從而使得壁內(nèi)物質(zhì)充分釋放出來，這在果蔬汁飲料加工業(yè)中已得到應用。目前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于絲狀真菌，曲霉是公認產(chǎn)纖維素酶最高的菌種之一，其中黑曲霉是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，不僅可用于生產(chǎn)纖維素酶，還被用于生產(chǎn)果膠酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。
目前，現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于紅色素或者紅棗色素的提取主要集中報道在傳統(tǒng)化學浸提法、生物酶法提取等方法，未見關(guān)于微生物發(fā)酵法提取紅棗色素，更未見關(guān)于紅棗紅色素提取的報道。利用微生物發(fā)酵法提取紅棗色素具有重要的研究開發(fā)價值。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于紅色素或者紅棗色素的提取主要集中報道在傳統(tǒng)化學浸提法、生物酶法提取等方法，未見關(guān)于微生物發(fā)酵法提取紅棗色素，更未見關(guān)于紅棗紅色素提取的報道的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種利用黑曲霉液體發(fā)酵助提紅棗色素的方法，充分利用微生物發(fā)酵法提取紅棗色素，通過利用黑曲霉液體發(fā)酵助提獲得紅棗色素，具有廣泛而適用的價值。
本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案: 本發(fā)明利用微生物發(fā)酵法，采用黑曲霉為發(fā)酵菌種，對以紅棗皮中的植物纖維素作為碳源發(fā)酵產(chǎn)生復合酶，破碎紅棗皮細胞壁，提高紅棗色素提取得率的發(fā)酵條件進行研究，為紅棗的有效開發(fā)和合理利用提供理論依據(jù)。
本發(fā)明具體提供一種利用黑曲霉液體發(fā)酵助提紅棗色素的方法，％按照重量百分比計，具體提取方法如下。
(I)過篩:粉碎的紅棗皮過40目篩。
(2)液體發(fā)酵:將上述步驟經(jīng)過粉碎過篩的紅棗皮粉為固定碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比按重量比為 5: 1，按照制備的發(fā)酵液量為添加標準，紅棗皮粉添加量為2%，Tween-80為0.02%，接入的黑曲霉液體菌種添加量為10%，在30°C下發(fā)酵5d后于121°C滅菌 15min。
(3)干燥:于80°C烘箱中干燥Ih。
(4)浸提:按照0.8% NaOH溶液為提取劑，浸提溫度為80°C，將步驟(3)制備的干燥料與提取劑按照料液比為1:20 (g/ml)，浸提時間為4h，提取級數(shù)為3級。
(5)離心:將步驟(4)制備的浸提液在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min,取上清液。
本發(fā)明中，黑曲霉菌種是常見的菌種，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過公眾渠道獲得，黑曲霉是以菌懸液的形式接入發(fā)酵培養(yǎng)基的，菌懸液的制備:采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將培養(yǎng)了72h±lh的黑曲霉，培養(yǎng)溫度為30°C，離心去上清，用與基礎(chǔ)培養(yǎng)基等體積的無菌生理鹽水清洗3次，最后得到菌懸液；基礎(chǔ)培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常見的PDA培養(yǎng)基。
本發(fā)明采用常見的提取級數(shù)即在其他提取條件不變的情況下，對目標產(chǎn)物進行重復提取的次數(shù)，具體的，提取級數(shù)，即按所述條件進行第一次提取后，離心，將上清和沉淀分離，上清作為第一級提取液備用，由于紅棗皮中還有一部分紅色素未被浸提出來，故沉淀按相同條件進行第二次提取，再離心分離上清和沉淀，此時上清作為第二級提取液備用，沉淀按相同條件進行第三次提取，再分離上清和沉淀，得到第三級提取液。此時，大部分紅棗紅色素已被提取出，雖然不是全部提出，但因考慮到實際成本的因素不作更多級提取。
現(xiàn)有技術(shù)熟知，紅棗紅色素為羥基葸醌類衍生物，難溶于丙酮、乙醚等極性較小的有機溶劑；易溶于水，以及甲醇、乙醇等強極性有機溶劑。紅棗色素呈紅色在不同濃度梯度的乙醇水溶液中表現(xiàn)出橙黃色顏色由深至淺的變化。紅棗紅色素在堿性條件下相對穩(wěn)定.光照、還原劑對紅棗紅色素的影響不大；紅棗紅色素熱穩(wěn)定良好，在20 1000°C溫度變化對其穩(wěn)定性幾乎無影響；金屬離子K+、Ca2+、Na+、M2+、Zn2+對其穩(wěn)定性影響不明顯；苯甲酸鈉和蔗糖溶液對紅棗紅色素的穩(wěn)定性影響較小。它是一種耐糖性色素，穩(wěn)定性不受人體所需的微量元素的影響。
通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下效果。
本發(fā)明以黑曲霉為發(fā)酵菌株，進行液體發(fā)酵法助提紅棗色素發(fā)酵條件的研究，確定了黑曲霉液體發(fā)酵法助提紅棗色素的最優(yōu)發(fā)酵條件，以紅棗皮為固定碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比5:1，發(fā)酵溫度30°C，發(fā)酵時間5d;與傳統(tǒng)化學浸提方法相比，微生物發(fā)酵法助提紅棗色素的提取得率為9.74%，比傳統(tǒng)浸提法提高了 2.11%，改善了紅棗紅色素的提取效率，可將產(chǎn)品得率提高2.11%，且兩種方法所得紅棗色素的抗氧化能力相近，均與濃度呈較顯著的量效關(guān)系。


圖1顯示為利用黑曲霉液體發(fā)酵提取紅棗色素的工藝流程圖。
圖2顯示為傳統(tǒng)化學法提取紅棗色素的工藝流程圖。
圖3顯示為氮源對紅棗色素提取得率的影響圖。
圖4顯示為碳氮比對紅棗色素提取得率的影響圖。
圖5顯示為發(fā)酵溫度對紅棗色素提取得率的影響圖。
圖6顯示為發(fā)酵時間對紅棗色素提取得率的影響圖。
圖7顯示為紅棗色素對二苯代苦味肼基自由基的清除能力圖。
圖8顯示為紅棗色素對羥基自由基的清除能力圖。
圖9顯示為紅棗色素的還原能力圖。
圖10顯示為維生素C對二苯代苦味肼基自由基的清除能力圖。
圖11顯示為維生素C對羥基自由基的清除能力圖。
圖12顯示為維生素C的還原能力圖。
具體實施方式
下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指m/m質(zhì)量百分比。
本發(fā)明中設備和材料有: 紅棗棗皮，實驗室自制；黑曲霉為常見的菌種，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過公眾渠道獲得；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；氯化銨、氫氧化鈉、硝酸鈉等均為A.R.級。
WFZ-UV-2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；HH — S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海-恒科技有限公司；DSX-280AI型不銹鋼手提式滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HWY-2112型搖床，上海智誠分析儀器廠；SIM真空冷凍干燥設備，德國西門子公司。
本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。
實施例一:利用黑曲霉液體發(fā)酵提取紅棗色素 具體參見附圖1，％按照重量百分比計，具體利用黑曲霉液體發(fā)酵提取紅棗色素提取方法如下。
(I)過篩:粉碎的紅棗皮過40目篩。
(2)液體發(fā)酵:將上述步驟經(jīng)過粉碎過篩的紅棗皮粉為固定碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比按重量比為5: 1，按照制備的發(fā)酵液量為添加標準，紅棗皮粉添加量為2%，Tween-80為0.02%，接入的黑曲霉液體菌種添加量為10%，在30°C下發(fā)酵5d后于121°C滅菌 15 min。
(3)干燥:于80°C烘箱中干燥Ih。
(4)浸提:按照0.8% NaOH溶液為提取劑，浸提溫度為80°C，將步驟(3)制備的干燥料與提取劑按照料液比為1:20 (g/ml)，浸提時間為4h，提取級數(shù)為3級。
(5)離心:將步驟(4)制備的浸提液在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min,取上清液。
通過上述提供的利用黑曲霉液體發(fā)酵提取紅棗色素提取方法，以黑曲霉為發(fā)酵菌株，進行液體發(fā)酵法助提紅棗色素發(fā)酵條件的研究，確定了黑曲霉液體發(fā)酵法助提紅棗色素的最優(yōu)發(fā)酵條件，以紅棗皮為固定碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比5:1，發(fā)酵溫度30°C，發(fā)酵時間5d ;紅棗色素的提取按提取得率計，是以紅棗粉末和紅色素得率的重量百分比計，微生物發(fā)酵法助提紅棗色素的提取得率為9.74%，改善了紅棗紅色素的提取效率。
實施例二:傳統(tǒng)采用的化學法提取紅棗色素 具體參見附圖2，傳統(tǒng)采用的化學法提取紅棗色素的技術(shù)要點如下: 粉碎的棗皮過目篩，經(jīng)過浸提、離心，將浸提液在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心，取上清液，具體制備工藝參數(shù)本領(lǐng)域熟知，可采用與實施例一涉及到相同技術(shù)步驟的基礎(chǔ)參數(shù)。
實施例三:黑曲霉液體發(fā)酵法助提紅棗色素工藝的優(yōu)化 1.氮源對紅棗色素提取得率的影響: 分別選擇尿素、蛋白胨、硝酸鈉、酵母浸出物、氯化銨作為氮源，按碳氮比6:1加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察不同氮源對紅棗色素提取得率的影響，結(jié)果參見附圖3。
為了消耗紅棗皮中的植物纖維素，起到改變細胞壁通透性的效果，直接采用紅棗皮作為固定碳源，避免了引入其他物質(zhì)作為碳源后對紅棗色素提取得率的影響。此黑曲霉菌株發(fā)酵法助提紅棗色素的最佳碳源為硝酸鈉。
2.碳氮比對紅棗色素提取得率的影響: 以紅棗皮為碳源，硝酸鈉為氮源，將碳源和氮源按3:1、4:1、5:1、6:1、7:1的比例混合，加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，考察不同碳氮比對紅棗色素提取得率的影響，結(jié)果參見附圖4。
碳氮比是影響微生物生長`和酶合成的一個重要因素，微生物的生長和微生物酶的合成都有適宜碳氮比范圍，采用適宜的碳氮比有助于黑曲霉更好地消耗紅棗皮中的植物纖維素，從而起到助提紅棗色素的效果。由附圖4可知，隨著碳氮比的升高纖維素酶的活性由低到高再降低，碳氮比為5:1時吸光值達到最大，為0.393，之后又有一定幅度的下降。綜上可得，采用5: I的碳氮比生產(chǎn)纖維素酶。
3.發(fā)酵溫度對紅棗色素提取得率的影響: 以紅棗皮為碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比為5:1，將接種的液體培養(yǎng)基分別在28°C、30°C、32°C、34°C、36°C的環(huán)境中進行培養(yǎng)，考察不同發(fā)酵溫度對紅棗色素提取得率的影響，結(jié)果參見附圖5。
由附圖5可知，在30°C時，黑曲霉助提紅棗色素的效果最佳，粗體液吸光值達0.373。在34°C 36°C時，助提效果逐漸減小。這可能是由于較高溫度下，菌體生長較快，但不利于產(chǎn)酶，較低溫度下菌體雖生長較慢，但可延長產(chǎn)酶時間。綜上可得，30°C是產(chǎn)纖維素酶的最適溫度。
4.發(fā)酵時間對紅棗色素提取得率的影響: 以紅棗皮為碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比為5:1，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵ld、2d、3d、4d、5d、6d，考察不同發(fā)酵時間對紅棗色素提取得率的影響，結(jié)果參見附圖6。
由附圖6可知，第I 2d吸光值變化幅度較小，從第3d開始增幅變大，直至第5d吸光值達到最大，為0.476，之后開始呈現(xiàn)一定幅度的下降，這可能與微生物的生長曲線一致。綜上可得，最佳發(fā)酵時間為5d。
通過采用單因素及正交優(yōu)化試驗確定了黑曲霉液體發(fā)酵法助提紅棗色素的最優(yōu)發(fā)酵條件為:以紅棗皮為固定碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比為5:1，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時間為5d。與傳統(tǒng)化學浸提方法相比，微生物發(fā)酵法助提紅棗色素可將產(chǎn)品得率提高(浸膏質(zhì)量/紅棗質(zhì)量)2.11%，且兩種方法所得紅棗色素的抗氧化能力相近，均與濃度呈較顯著的量效關(guān)系。
實施例四:影響因子正交優(yōu)化試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進一步選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間，碳氮比三因素，進行三因素三水平的正交優(yōu)化試驗。
在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用L9 (33)正交表進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果見表1、2。
表I黑曲霉發(fā)酵助提紅棗紅色素正交試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種利用黑曲霉液體發(fā)酵助提紅棗色素的方法，其特征在于，％按照重量百分比計，具體利用黑曲霉液體發(fā)酵提取紅棗色素提取方法如下: (1)過篩:粉碎的紅棗皮過40目篩； (2)液體發(fā)酵:將上述步驟經(jīng)過粉碎過篩的紅棗皮粉為固定碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比按重量比為5: I，按照制備的發(fā)酵液量為添加標準，紅棗皮粉添加量為2%，Tween-80為0.02%，接入的黑曲霉液體菌種添加量為10%，在30 °C下發(fā)酵5d后于121°C滅菌15 min ； (3)干燥:于80°C烘箱中干燥Ih ； (4)浸提:按照0.8% NaOH溶液為提取劑，浸提溫度為80°C，將步驟(3)制備的干燥料與提取劑按照料液比為1:20 (g/ml)，浸提時間為4h，提取級數(shù)為3級； (5)離心:將步驟(4)制 備 的浸提液在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min,取上清液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用黑曲霉液體發(fā)酵助提紅棗色素的方法。利用黑曲霉為發(fā)酵菌種，紅棗皮粉為固定碳源，硝酸鈉為氮源，碳氮比為5∶1，紅棗皮粉添加量為2%，Tween-80為0.02%，接入的黑曲霉液體菌種添加量為10％，在30℃下發(fā)酵5d后于121℃滅菌15min，于80℃烘箱中干燥1h，并按照0.8%NaOH溶液為提取劑，浸提溫度為80℃，將干燥料與提取劑按照料液比為120(g/ml)，浸提時間為4h，級數(shù)為3級，浸提液在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液。與傳統(tǒng)化學浸提方法相比，本申請?zhí)峁┓椒óa(chǎn)品得率提高2.11%，獲得良好的技術(shù)效果，具有廣泛的實用價值。
文檔編號C09B61/00GK103232724SQ201310107810
公開日2013年8月7日 申請日期2013年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月31日
發(fā)明者敬思群, 王俠, 房芳 申請人:新疆刀郎棗業(yè)有限公司, 新疆大學