本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，涉及到一種同時(shí)產(chǎn)淀粉酶與糖化酶的新型黑曲霉菌株QY-002，所得發(fā)酵液具有淀粉酶與糖化酶雙酶活性，在淀粉制糖領(lǐng)域具有重要用途。

背景技術(shù)：

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，糧食種植面積廣，產(chǎn)量大，淀粉含量也很高，但價(jià)格低廉。為提高糧食的經(jīng)濟(jì)附加值，達(dá)到經(jīng)濟(jì)效益的最大化，多數(shù)需要進(jìn)行精深加工。其中，淀粉制糖是糧食深加工的主要途徑之一。

淀粉糖是蔗糖的最佳替代品，主要包括麥芽糖、葡萄糖、果糖等，廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥、化工和發(fā)酵行業(yè)等領(lǐng)域。目前，我國(guó)淀粉糖產(chǎn)量居世界第二（僅次美國(guó)），2013年產(chǎn)量超過1225萬噸，市場(chǎng)份額占制糖業(yè)的三分之一。淀粉糖的生產(chǎn)工藝常用雙酶法，即通過淀粉酶和糖化酶分別進(jìn)行淀粉的液化與糖化。但由于這兩種酶作用的最適pH值和最適溫度都不同，故而生產(chǎn)操作時(shí)須分步進(jìn)行，同時(shí)調(diào)節(jié)溫度和調(diào)節(jié)pH值以滿足兩種酶的最優(yōu)作用條件。而且在某些糧食如玉米淀粉制備結(jié)晶葡萄糖生產(chǎn)中，一般液化時(shí)間需要2～3小時(shí)，糖化時(shí)間則需要 70～80 小時(shí)，導(dǎo)致生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，操作過程繁瑣，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，耗能較大，嚴(yán)重制約了由淀粉制糖的生產(chǎn)能力。

為了解決淀粉制糖生產(chǎn)的這一瓶頸問題，近年來國(guó)內(nèi)外有關(guān)的淀粉制糖的研究工作主要集中在進(jìn)一步篩選淀粉酶或糖化酶分泌量高的新菌株、篩選耐熱糖化酶生產(chǎn)菌株、對(duì)已有菌種的誘變或用基因工程的方法進(jìn)行淀粉酶或糖化酶基因的表達(dá)等，但都收效甚微。此外，最近也有試圖將淀粉酶基因和糖化酶基因放在同一個(gè)宿主菌中進(jìn)行同時(shí)表達(dá)的研究報(bào)道，但也未能成功地用于生產(chǎn)實(shí)踐。在我們國(guó)內(nèi)，目前淀粉制糖生產(chǎn)的主要企業(yè)，如西王糖業(yè)、魯洲生物科技和保齡寶生物股份等大型玉米深加工企業(yè)，其淀粉糖產(chǎn)量約占國(guó)內(nèi)產(chǎn)量的80%，也都使用雙酶法生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外目前未見使用一步法進(jìn)行淀粉糖制備的報(bào)道。

黑曲霉（Aspergillus niger）屬半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬黑曲霉。黑曲霉是廣泛存在于自然界中的一種腐生真菌，也是重要的工業(yè)發(fā)酵菌種之一，在工業(yè)酶制劑、檸檬酸發(fā)酵方面有著廣泛的應(yīng)用。本專利涉及的新型黑曲霉（Aspergillus niger）QY-002，是我們首次篩選發(fā)現(xiàn)的能分泌同時(shí)具有淀粉酶和糖化酶雙活性的酶蛋白的特殊黑曲霉菌。利用黑曲霉QY-002發(fā)酵所得淀粉酶與糖化酶發(fā)酵液水解淀粉制糖，僅需一步添加，在同一溫度和同一pH值條件下即可完成淀粉糖化過程，且酶活性高，糖化時(shí)間縮短為10～20小時(shí)。大大簡(jiǎn)化了淀粉制糖工藝，縮短了反應(yīng)時(shí)間與生產(chǎn)周期，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，減少了人力、物力、能耗。該菌種應(yīng)用于淀粉制糖工業(yè)將會(huì)引起淀粉糖化工藝的里程碑性變革，具有較強(qiáng)的產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢(shì)和廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種同時(shí)產(chǎn)淀粉酶與糖化酶的新型黑曲霉菌株，發(fā)酵所得組合酶液具有雙酶活性，能應(yīng)用于淀粉制糖工藝，能在同一反應(yīng)條件下相互協(xié)同作用，高效率地催化底物淀粉完全水解為葡萄糖，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)措施：

本發(fā)明所提供的菌株為新型黑曲霉(Aspergillus niger) QY-002，篩選于海拔1500～2000米的山間腐殖質(zhì)土壤中，經(jīng)初篩培養(yǎng)基初篩、產(chǎn)酶培養(yǎng)基復(fù)篩、遺傳穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)后，得到了一種高產(chǎn)淀粉酶與糖化酶的菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法鑒定為黑曲霉。已于2015年04月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10650。

該黑曲霉菌株QY-002的形態(tài)特征：

在特制麥芽汁培養(yǎng)基上蔓延迅速，24小時(shí)出現(xiàn)菌落，初為白色，后變成黃綠色直至黑色，呈絲絨狀，中心略凸起，菌落反面略帶黃白色（詳見附圖1）。72小時(shí)后，孢子豐富，在顯微鏡下孢子整體形狀似掃把，分生孢子梗長(zhǎng)短不一，分生孢子為圓球形呈黑色。（詳見附圖2及附圖3）該菌株產(chǎn)孢子能力強(qiáng)，具有很好的工業(yè)化生產(chǎn)性能。

本發(fā)明黑曲霉（Aspergillus niger）菌株QY-002 的培養(yǎng)方法或繁殖方法：

1) 麥芽汁斜面培養(yǎng)基：大麥芽粉碎后稱取100～400g加600～900ml水經(jīng)兩次糖化得到波美度在7～12的麥芽汁，然后加入2%的瓊脂，滅菌備用。

2) 種子復(fù)壯培養(yǎng)基：每1L培養(yǎng)基（pH=5.5～5.8）：硝酸鈉1.0～9.5g、磷酸二氫鉀0.5～5.0g、七水硫酸鎂0.2～5.0g、氯化鉀0.2～5.0g、七水硫酸亞鐵0.0001～1.0g、普通玉米淀粉10～70g、大麥芽5～35g。

3) 液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：每1L培養(yǎng)基（pH=5.5～5.8）：硝酸鈉1.0～9.5g、磷酸二氫鉀0.5～5.0g、七水硫酸鎂0.2～5.0g、氯化鉀0.2～5.0g、七水硫酸亞鐵0.0001～1.0g、普通玉米淀粉10～70g、大麥芽5～35g。

本發(fā)明提供了黑曲霉QY-002發(fā)酵所得組合酶液中淀粉酶、糖化酶兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)與活性參數(shù)，包括：最適作用溫度為68℃，最適pH為4.5，在4～80℃時(shí)酶的熱穩(wěn)定較好，pH值在4.0～7.0之間酶的穩(wěn)定性較好，Mg^-2+和Ca^------2+對(duì)該酶有促進(jìn)作用，Cu^-2+、Mn^-2+有抑制作用。具有雙酶活性的發(fā)酵液在溫度60～70℃，pH值4.5～5.5條件下，可以將30%的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，轉(zhuǎn)化率高達(dá)98%以上。

本發(fā)明還提供了黑曲霉QY-002發(fā)酵所得組合酶液中淀粉酶、糖化酶酶活性的定義及測(cè)定方法。

1) 淀粉酶活性單位定義：1ml酶液在40℃條件下，1min消耗1μg淀粉定義為一個(gè)酶活單位u。

2) 糖化酶活性單位定義：1ml酶液在40℃條件下1min水解淀粉生成1μmol葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位u。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明黑曲霉QY-002菌株有以下優(yōu)點(diǎn)：

1) 黑曲霉QY-002菌株獨(dú)特。

2)黑曲霉菌株QY-002生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢子能力強(qiáng)，具有很好的工業(yè)化生產(chǎn)性能。

3)黑曲霉QY-002分泌的酶能同時(shí)具有淀粉酶與糖化酶雙酶活性且兩種酶互相配合能讓淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖更加高效。

4) 該黑曲霉菌株QY-002生產(chǎn)的雙活性淀粉酶組合物能夠變淀粉糖化工業(yè)上的雙步添加法為單步法，大大簡(jiǎn)化原有的淀粉制糖工藝。

附圖說明

圖1 黑曲霉QY-002在麥芽汁培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

圖2 黑曲霉QY-002在100倍顯微鏡下的形態(tài)示意圖。

圖3 黑曲霉QY-002在400倍顯微鏡下的形態(tài)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更加清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。

實(shí)施例1新型黑曲霉菌株QY-002的篩選和分離。

本發(fā)明中所述的新型黑曲霉菌株QY-002是來自海拔1500-2000米的山間腐殖質(zhì)土壤中，經(jīng)過初篩培養(yǎng)基初篩和產(chǎn)酶培養(yǎng)基復(fù)篩，從中獲得一株生長(zhǎng)性能優(yōu)良的菌種，能夠利用淀粉，同時(shí)產(chǎn)生淀粉酶和糖化酶，且兩種酶酶活性高，保存至麥芽汁斜面培養(yǎng)基上。

麥芽汁斜面培養(yǎng)基制備方法：大麥芽粉碎后稱取300g加700ml水，經(jīng)兩次糖化得到波美度在7-12的麥芽汁，然后加入2%的瓊脂，滅菌備用。

實(shí)施例2新型黑曲霉QY-002的菌株鑒定。

1)微生物學(xué)特性：在特制麥芽汁培養(yǎng)基上蔓延迅速，24小時(shí)出現(xiàn)菌落，初為白色，后變成黃綠色直至黑色，呈絲絨狀，中心略凸起，菌落反面略帶黃白色。72小時(shí)后，孢子豐富，分生孢子整體形狀似掃把，分生孢子梗長(zhǎng)短不一，分生孢子為圓球形呈黑色。

2)分子生物學(xué)特性：該菌株經(jīng)18S rRNA序列鑒定為黑曲霉菌株（Aspergillus niger），序列表如SEQ ID NO.1所示。

實(shí)施例3新型黑曲霉QY-002的復(fù)壯及液體發(fā)酵制備淀粉酶和糖化酶酶液。

1)復(fù)壯：將菌株接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基28～34℃培養(yǎng)7天。

麥芽汁培養(yǎng)基制備方法：大麥芽粉碎后稱取400g加600ml水，經(jīng)兩次糖化得到波美度在7～12的麥芽汁，然后加入2%的瓊脂，滅菌備用。

2)液體培養(yǎng)：麥芽汁斜面接種至搖瓶液體培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)條件：溫度28～32℃，轉(zhuǎn)速160～200rpm，培養(yǎng)時(shí)間68～78小時(shí)。四層紗布過濾，取濾液備用。濾液中淀粉酶活性可以達(dá)到1.8 u/ml、糖化酶活性可達(dá)40 u/ml。

培養(yǎng)基配方：每1L培養(yǎng)基（pH=5.5～5.8）：硝酸鈉7.28g、磷酸二氫鉀0.8g、七水硫酸鎂0.4g、氯化鉀0.4g、七水硫酸亞鐵0.0015g、普通玉米淀粉48g、大麥芽20g。

實(shí)施例4淀粉酶與糖化酶活力的測(cè)定。

本發(fā)明所述的新型黑曲霉QY-002能夠同時(shí)產(chǎn)淀粉酶及糖化酶，由于這兩種酶的生物學(xué)特性不同于普通的淀粉酶與糖化酶的特性，所以在此提供了專一對(duì)應(yīng)雙酶活性的酶活定義及其測(cè)定方法。

淀粉酶活性測(cè)定方法。

1)淀粉酶活性單位定義：1ml酶液在40℃條件下，1min消耗1μg淀粉定義為一個(gè)酶活單位u。

2)測(cè)定試劑的配制：

1%的淀粉溶液：稱取1g的可溶性淀粉溶于0.05M的醋酸緩沖溶液中。

原碘液：稱取0.5g碘和5g碘化鉀溶于水中，加水定容到200ml。

顯色液：量取2ml原碘液于100ml 0.1M的稀鹽酸溶液中，混勻。

3)測(cè)定步驟：

準(zhǔn)確量取1%的淀粉溶液10ml于試管中，加4ml蒸餾水混勻，置于40℃水浴鍋中預(yù)熱5min， 加入1ml待測(cè)酶液（空白對(duì)照用滅活的酶液），計(jì)時(shí)、反應(yīng)10min結(jié)束。吸取0.2ml反應(yīng)液加入10ml顯色液中顯色，于650nm可見光分光光度計(jì)比色，記錄吸光度。

4)酶活性（A）計(jì)算公式：

A=

C=

其中：D1—空白樣的吸光度

D2—加入待測(cè)酶液反應(yīng)后測(cè)得的吸光度

n—加酶體積（ml）。

糖化酶活性測(cè)定方法。

1)糖化酶活性單位定義：1ml酶液在40℃條件下1min水解淀粉生成1μmol葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位u。

2)測(cè)定方法：

將上述測(cè)定淀粉酶活性中反應(yīng)10min結(jié)束的反應(yīng)液置于100℃沸水浴中滅活3-5min，終止反應(yīng)。反應(yīng)液降溫至室溫后，用生物傳感分析儀檢測(cè)反應(yīng)液中葡萄糖的含量，根據(jù)葡萄糖含量的測(cè)定值a來計(jì)算糖化酶活性。

3)酶活性（A）計(jì)算公式：

A=

其中：a—葡萄糖含量（mg/ml）

b—稀釋倍數(shù)

n—加酶體積（ml）

t—反應(yīng)時(shí)間（min）。

實(shí)施例5：新型黑曲霉QY-002液體發(fā)酵所得組合酶制劑在淀粉制糖上的應(yīng)用。

本發(fā)明所述黑曲霉QY-002能夠同時(shí)高產(chǎn)淀粉酶及糖化酶，由于兩種酶來源相同，因而可以在同一反應(yīng)條件下，協(xié)同作用，能完全、高效地水解淀粉為葡萄糖。

本發(fā)明利用黑曲霉QY-002發(fā)酵所得具有雙酶活性的酶液，對(duì)95℃糊化5分鐘的30%的玉米淀粉溶液進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。按照1g淀粉2～5u的加酶量（以淀粉酶酶活計(jì)），以pH 4.0～4.8的醋酸緩沖液預(yù)調(diào)淀粉溶液的pH值，置于60～70℃水浴搖床中水解淀粉，在8～12小時(shí)就達(dá)到水解終點(diǎn)，淀粉水解為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)至99%以上，無需將液化與糖化過程分開，也無需更換溫度及pH值。該應(yīng)用簡(jiǎn)化了淀粉制糖的工藝，節(jié)約了能源和成本，提高了生產(chǎn)效率，具有較強(qiáng)的產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢(shì)和廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 煙臺(tái)啟元微生物技術(shù)研究院有限公司

<120> 一種新型的黑曲霉菌株及應(yīng)用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1341

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger)

<400> 1

agtataagca ctttatactg tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt atcgtttatt 60

tgatagtacc ttactacatg gatacctgtg gtaattctag agctaataca tgctgaaaac 120

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