利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉（CY018，Aspergillusfumigatus）生產(chǎn)生物堿類選擇性免疫抑制劑-煙曲霉文丙（FumigaclavineC，通稱FC）的方法及其培養(yǎng)基。配制1000ml所述培養(yǎng)基所需的成分包含：糖蜜50-150g/L、蔗糖40-80g/L、硝酸鈉（NaNO3）2-5g/L、磷酸氫二鉀（K2HPO4）0.5-1.5g/L、氯化鉀（KCl）0.25-1g/L、七水硫酸鎂（MgSO4?7H2O）0.25-1g/L、硫酸亞鐵（FeSO4）0.005-0.02g/L、硫酸鋅（ZnSO4）0.005-0.02g/L、硫酸銅（CuSO4）0.001-0.01g/L、色氨酸0.5-1.5g/L，以自來水溶解，并定容至1000ml，再以鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0-4.5，將所獲得的培養(yǎng)基以121℃滅菌15-30分鐘。本發(fā)明的培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，成本低廉，制備操作方便，不需特殊設(shè)備，用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙，能顯著提高煙曲霉文丙的產(chǎn)量。
【專利說明】利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的方法及其培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及培養(yǎng)基【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及用于培養(yǎng)海蟹共生曲霉的培養(yǎng)基【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是指一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生曲霉(CY018, Aspergillus fumigatus)生產(chǎn)生物堿類選擇性免疫抑制劑-煙曲霉文丙(Fumigaclavine C，通稱FC)的培養(yǎng)基之制備方法及使用該培養(yǎng)基制備煙曲霉文丙的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋是一個(gè)開放的復(fù)雜系統(tǒng)，在海洋特殊的生態(tài)環(huán)境下生活著40多萬種動(dòng)植物和上億種微生物。近年來許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了海洋生物作為活性化合物和藥物來源的巨大潛力，具有重要的研究意義與開發(fā)價(jià)值。為適應(yīng)海洋特有環(huán)境，各種海洋生物必須與其共生菌長(zhǎng)期共進(jìn)化并建立穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系，有些共生菌似乎與宿主形成了類似于“整體”的統(tǒng)一體，缺一難活。研究表明該“互惠共生”的化學(xué)本質(zhì)是共生菌可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能都比較特殊的代謝物，來保護(hù)或調(diào)節(jié)海洋生物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵御天敵、尋取食物等行為。故海洋共生菌被認(rèn)為是新藥源分子的重要來源，對(duì)其產(chǎn)物深入研究可為人類急需新藥的發(fā)現(xiàn)與研發(fā)提供廣闊的空間。 [0003]海洋來源內(nèi)生真菌菌株編號(hào):CY018屬半知菌類、絲孢目QiyphoniycetalesH^孢科、曲霉屬(Aspergillus)真菌，由南京大學(xué)譚仁祥教授分離得到。海洋來源內(nèi)生真菌CY018經(jīng)液體或固體發(fā)酵可產(chǎn)生多種代謝物，包括生物堿類、萜類化合物、多烯類化合物和鞘氨酸類化合物等天然物質(zhì)。煙曲霉文丙是其產(chǎn)生的一種生物堿類次級(jí)代謝物，煙曲霉文丙純品為白色針狀結(jié)晶，其具有同環(huán)孢菌素A相媲美的免疫抑制活性，是一種潛在的免疫抑制劑候選藥物。
[0004]然而，煙曲霉文丙在初始發(fā)酵工藝下的得率相當(dāng)?shù)?，已?jīng)成為制約煙曲霉文丙用于臨床前研究的瓶頸。因此通過改善其發(fā)酵工藝提高煙曲霉文丙產(chǎn)量已成為當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上現(xiàn)狀，解決限制對(duì)煙曲霉文丙深入研究的瓶頸問題，提供一種用于發(fā)酵海蟹共生曲霉生產(chǎn)選擇性免疫抑制劑-煙曲霉文丙的培養(yǎng)基及其制備方法，及使用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)煙曲霉文丙的方法；該培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，制備方法操作方便，成本低廉，不需特殊設(shè)備，而使用該培養(yǎng)基發(fā)酵海蟹共生曲霉生產(chǎn)選擇性免疫抑制劑煙曲霉文丙，能顯著提高煙曲霉文丙的產(chǎn)量。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的培養(yǎng)基，每升所述培養(yǎng)基包含:糖蜜 50-150g/L、蔗糖 40-80 g/L、硝酸鈉 2-5 g/L、磷酸氫二鉀 0.5-1.5 g/L、氯化鉀 0.25-1g/L、七水硫酸鎂0.25-1 g/L、硫酸亞鐵0.005-0.02 g/L、硫酸鋅0.005-0.02 g/L、硫酸銅
0.001-0.01 g/L、色氨酸0.5-1.5 g/L，以自來水溶解。
[0007]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案之一，每升所述培養(yǎng)基包含:所述糖蜜90-130 g/L、蔗糖55-75 g/L、硝酸鈉3-4.5 g/L、磷酸氫二鉀0.9_1.3 g/L、氯化鉀0.4-0.7 g/L、七水硫酸鎂
0.4-0.7 g/L、硫酸亞鐵 0.009-0.013 g/L、硫酸鋅 0.009-0.013 g/L、硫酸銅 0.004-0.007g/L、色氨酸0.8-1.3 g/L、以自來水溶解。
[0008]一種用于制備上述本發(fā)明所述培養(yǎng)基的方法，包括如下步驟:
將所述糖蜜、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、七水硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅、色氨酸準(zhǔn)確稱量后，以自來水溶解，并定容至1000 ml，使它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的終濃度分別為 50-150g/L、40-80 g/L,2-5 g/L,0.5-1.5 g/L,0.25-1 g/L、0.25-1 g/L、0.005-0.02 g/L、，0.005-0.02 g/L、(λ 001-0.01 g/L、0.5-1.5 g/L，再以鹽酸調(diào)節(jié) pH 值至 4.0_4.5，然后將所獲得的培養(yǎng)基在121°C下滅菌15-30分鐘。
[0009]一種使用前述本發(fā)明所述培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的方法，其操作步驟包括:
a.將冷凍保存的海蟹共生煙曲霉解凍后，在固體平板培養(yǎng)基中央進(jìn)行點(diǎn)樣并活化培養(yǎng)4-6天，獲得新鮮固體平板培養(yǎng)基，固體平板培養(yǎng)基每隔30天重新活化一次；
b.從新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養(yǎng)基中挖取I塊瓊脂塊，接種至種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)3-4天，獲得新鮮種子液；
c.取所述新鮮種子液，按5-20%(v/v)的接種量接入所述培養(yǎng)基，以28±2° C、130±20 rpm搖床振蕩培養(yǎng)3-5天后，將轉(zhuǎn)速降為O rpm，靜置培養(yǎng)7_10天，獲得發(fā)酵液獲得發(fā)酵液；以及
d.取所述發(fā)酵液進(jìn)行研磨、萃取、純化，獲得煙曲霉文丙。
[0010]所述固體平板培養(yǎng)基每升包含有葡萄糖20 g、土豆200 g、瓊脂粉15-20 g，以自來水溶解。
[0011]所述種子培養(yǎng)基每升包含有葡萄糖20 g、土豆200 g，以自來水溶解。
[0012]本發(fā)明提供的一種利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的方法及其培養(yǎng)基的主要優(yōu)點(diǎn)如下:
本發(fā)明的培養(yǎng)基成分糖蜜、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、七水硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅和色氨酸，原料易得，價(jià)格低廉，有利于推廣應(yīng)用；
制備本發(fā)明的培養(yǎng)基只需將上述原料以自來水溶解，方法簡(jiǎn)單，難度低，無需專門技術(shù)培訓(xùn)及特殊儀器設(shè)備；
采用本發(fā)明的培養(yǎng)基及方法發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉，該菌株在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，較大程度改變代謝通路，減少副產(chǎn)物，使用該培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙，可提高目標(biāo)產(chǎn)物煙曲霉文丙的產(chǎn)量，為后期純化工作降低難度，煙曲霉文丙的最高產(chǎn)量可達(dá)到278.9 mg/L,是原始水平的4.4倍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明各實(shí)施例與對(duì)照組的煙曲霉文丙的產(chǎn)量的結(jié)果對(duì)照?qǐng)D。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明將根據(jù)具體實(shí)例做進(jìn)一步的描述，但其僅為例證性的目的而不起到限制性作用。[0015]在對(duì)實(shí)例描述前，有必要提供一些備注說明:
采用不同廠家、不同批次的糖蜜會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，屬于正?，F(xiàn)象；
在進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)，為保證平行實(shí)驗(yàn)間的重復(fù)性，建議將培養(yǎng)基過濾處理，以除掉來自于糖蜜的不溶性雜質(zhì)的干擾。
[0016]實(shí)施例1
1.配制發(fā)酵培養(yǎng)基
準(zhǔn)確稱取糖蜜100 g、蔗糖71.11 g、硝酸鈉4.375 g、磷酸氫二鉀I g、氯化鉀0.5 g、七水硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.0125 g、硫酸鋅0.01 g、硫酸銅0.00625 g、色氨酸1.25 g，以自來水溶解，并定容至1000 ml ο
[0017]2.發(fā)酵操作過程
將-80°C保存的海蟹共生煙曲霉解凍后，用接種針在固體平板培養(yǎng)基中央進(jìn)行點(diǎn)樣，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱，活化培養(yǎng)4-6天，獲得新鮮固體平板培養(yǎng)基，然后置于4°C冰箱保存。用接種鏟從新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養(yǎng)基中挖取I塊5X5 mm瓊脂塊，接種至裝有400 ml種子培養(yǎng)基的1000 ml搖瓶中，以28° C、150 rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)3_4天，獲得新鮮種子液。取新鮮種子液，按5-20% (v/v)的接種量接入所述新穎培養(yǎng)基，以28° C、130rpm搖床振蕩培養(yǎng)4.5天，后將轉(zhuǎn)速降為O rpm，靜置培養(yǎng)8天，獲得發(fā)酵液。
[0018]3.煙曲霉文丙產(chǎn)量檢測(cè)
取50 ml所獲發(fā)酵液于250 ml錐形瓶中，加入50 ml乙酸乙酯和30顆直徑為3 mm的玻璃珠，密封后，置于28°C·和200 rpm搖床環(huán)境進(jìn)行研磨、萃取I小時(shí)，并重復(fù)三次，然后取3 ml上層有機(jī)相進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾除去乙酸乙酯；殘留物用I ml無水甲醇溶解；在相對(duì)離心力為13780 Xg的條件下離心3分鐘后，取500 μ I上清液，用高效液相色譜法測(cè)定煙曲霉文丙的含量，進(jìn)而通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成所述發(fā)酵液中煙曲霉文丙的實(shí)際含量。
[0019]最后測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物煙曲霉文丙的產(chǎn)量為238.5mg/L。
[0020]實(shí)施例2
1.配制發(fā)酵培養(yǎng)基:
準(zhǔn)確稱取糖蜜100 g、蔗糖71.11 g、硝酸鈉3.5 g、磷酸氫二鉀1.25 g、氯化鉀0.625g、七水硫酸鎂0.625 g、硫酸亞鐵0.01 g、硫酸鋅0.01 g、硫酸銅0.005 g、色氨酸1.25 g，以自來水溶解，并定容至1000 ml ο
[0021]2.發(fā)酵操作過程 同實(shí)施例1步驟2。
[0022]3.煙曲霉文丙產(chǎn)量檢測(cè)
同實(shí)施例1步驟3，最后測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物煙曲霉文丙的產(chǎn)量為240.6 mg/L。
[0023]實(shí)施例3
1.配制發(fā)酵培養(yǎng)基:
準(zhǔn)確稱取糖蜜125 g、蔗糖56.89 g、硝酸鈉3.5 g、磷酸氫二鉀I g、氯化鉀0.625 g、七水硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.0125 g、硫酸鋅0.0125 g、硫酸銅0.005 g、色氨酸1.25 g，以自來水溶解，并定容至1000 ml ο
[0024]2.發(fā)酵操作過程 同實(shí)施例1步驟2。[0025]3.煙曲霉文丙產(chǎn)量檢測(cè)
同實(shí)施例1步驟3，最后測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物煙曲霉文丙的產(chǎn)量為258.5 mg/L。
[0026]實(shí)施例4
1.配制發(fā)酵培養(yǎng)基:
準(zhǔn)確稱取糖蜜100 g、蔗糖56.89 g、硝酸鈉3.5 g、磷酸氫二鉀I g、氯化鉀0.5 g、七水硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、硫酸鋅0.01 g、硫酸銅0.005 g、色氨酸I g，用自來水溶解并定容至1000 ml。
[0027]2.發(fā)酵操作過程 同實(shí)施例1步驟2。
[0028]3.煙曲霉文丙產(chǎn)量檢測(cè)
同實(shí)施例1步驟3，最后測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物煙曲霉文丙的產(chǎn)量為278.9 mg/L。
[0029]對(duì)照組實(shí)例
1.配制發(fā)酵培養(yǎng)基:
準(zhǔn)確稱取葡萄糖36 g、甘露醇24 g、硝酸鈉3.5 g、磷酸氫二鉀1.5 g、七水硫酸鎂0.7g、硫酸亞鐵0.02 g、谷氨酸鈉3 g、酒石酸鈉1.5 g,用自來水溶解并定容至1000 ml ο
[0030]2.發(fā)酵操 作過程 同實(shí)施例1步驟2。
[0031]3.煙曲霉文丙產(chǎn)量檢測(cè)
同實(shí)施例1步驟3，最后測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物煙曲霉文丙的產(chǎn)量為62.7 mg/L。
[0032]從實(shí)施例f 4可以發(fā)現(xiàn):使用本發(fā)明的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生曲霉生產(chǎn)獲得的煙曲霉文丙的產(chǎn)量都在200 mg/L以上，最高產(chǎn)量為278.9 mg/L，與對(duì)照組相比較，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基酵培養(yǎng)海蟹共生曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙，如圖1所示，煙曲霉文丙的產(chǎn)量得到顯著提高。
[0033]需要說明的是，以上較佳實(shí)施例僅供說明本發(fā)明之用，而非對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，所作出各種變換或變型，均屬于本發(fā)明的范疇。
【權(quán)利要求】
1.一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的培養(yǎng)基，其特征在于，每升所述培養(yǎng)基的成分包含有糖蜜50-150g/L、蔗糖40-80 g/L、硝酸鈉2_5 g/L、磷酸氫二鉀0.5-1.5 g/L、氯化鉀 0.25-1 g/L、七水硫酸鎂 0.25_1 g/L、硫酸亞鐵 0.005-0.02 g/L、，硫酸鋅0.005-0.02 g/L、硫酸銅0.001-0.01 g/L、色氨酸0.5-1.5 g/L，以自來水溶解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的培養(yǎng)基，其特征在于，每升所述培養(yǎng)基的成分包含:所述糖蜜90-130 g/L、蔗糖55-75 g/L、硝酸鈉 3-4.5 g/L、磷酸氫二鉀 0.9-1.3 g/L、氯化鉀 0.4-0.7 g/L、七水硫酸鎂 0.4-0.7 g/L、硫酸亞鐵 0.009-0.013 g/L、硫酸鋅 0.009-0.013 g/L、硫酸銅 0.004-0.007 g/L、色氨酸0.8-1.3 g/L，以自來水溶解。
3.一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的培養(yǎng)基之制備方法，其特征在于，將所述糖蜜、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、七水硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅、色氨酸準(zhǔn)確稱量后，以自來水溶解，并定容至1000 ml，使上述成分在培養(yǎng)基中的終濃度分別為 50-150g/L、40-80 g/L,2-5 g/L,0.5-1.5 g/L,0.25-1 g/L、0.25-1 g/L、0.005-0.02g/L,, 0.005-0.02 g/L、0.001-0.01 g/L、0.5-1.5 g/L，再以鹽酸調(diào)節(jié) pH 值至 4.0-4.5，然后在121°C下滅菌15-30分鐘。
4.一種利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)煙曲霉文丙的方法，其特征在于，所述方法包括以下操作步驟: a.將冷凍保存的海蟹共生煙曲霉解凍后，在固體平板培養(yǎng)基中央進(jìn)行點(diǎn)樣并活化培養(yǎng)4-6天，獲得新鮮固體平板培養(yǎng)基，固體平板培養(yǎng)基每隔30天重新活化一次； b.從新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養(yǎng)基中挖取I塊瓊脂塊，接種至種子培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)3-4天，獲得新鮮種子液；` c.取所述新鮮種子液，按5-20%(v/v)的接種量接入權(quán)利要求1和2任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基，以28±2° C、130±20 rpm搖床振蕩培養(yǎng)3_5天后，將轉(zhuǎn)速降為O rpm，靜置培養(yǎng)7_10天，獲得發(fā)酵液；以及 d.取所述發(fā)酵液進(jìn)行抽提、萃取、純化，獲得煙曲霉文丙。
【文檔編號(hào)】C12P17/18GK103849663SQ201410012366
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】盧艷花, 朱一翔, 焦瑞華, 譚仁祥, 姚凌云, 胡偉偉 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué), 南京大學(xué)