技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種數(shù)字pcr微滴制備裝置及制備方法，屬于數(shù)字pcr技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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pcr技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)最重要的工具之一，它廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)診斷、個(gè)體化醫(yī)療、食品檢驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)、病原體鑒定、免疫分析、法醫(yī)科學(xué)等方面。而作為pcr技術(shù)的最新一代，基于微流控技術(shù)發(fā)展產(chǎn)生的數(shù)字pcr，具有比傳統(tǒng)qpcr更小的反應(yīng)體積、更快的反應(yīng)速度、更低的系統(tǒng)噪聲和更高的靈敏度。

通過油包水結(jié)構(gòu)，將單個(gè)dna分子封裝到單獨(dú)的微滴中，利用油的惰性實(shí)現(xiàn)dna分子間的相互隔離，每個(gè)dna分子被限制在自己的微滴中單獨(dú)的進(jìn)行擴(kuò)增，避免來自其他序列競(jìng)爭(zhēng)。在合適的溫度條件下完成dna分子的擴(kuò)增后，通過記錄微滴的總體個(gè)數(shù)和可以檢測(cè)到熒光信號(hào)的微滴個(gè)數(shù)，利用泊松分布算法就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)dna拷貝數(shù)的精確定量。

作為數(shù)字pcr技術(shù)的核心，微滴的制備一直是限制其發(fā)展的重要因素。由于數(shù)字pcr是通過泊松分布計(jì)算事件概率得到最終結(jié)果，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，微滴的制備應(yīng)該滿足兩個(gè)基本條件：1.高數(shù)據(jù)群體的體量2.優(yōu)秀的單分散性。正是由于這兩個(gè)條件的制約，嚴(yán)重限制了數(shù)字pcr技術(shù)的發(fā)展。近幾年來，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字pcr技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的最佳契機(jī)。

本發(fā)明涉及一種數(shù)字pcr的微滴制備裝置及制備方法，滿足微滴制備微滴產(chǎn)率高、體積小、單分散性高的系統(tǒng)要求。雖然單分子pcr微流控液滴的利用仍處于早期階段，但其巨大的應(yīng)用前景已經(jīng)被證實(shí)，也將為生物醫(yī)學(xué)工程在單分子放大分析等領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)提供全新的解決方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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為了解決數(shù)字pcr微滴生成過程中產(chǎn)率低、體積大、單分散性差等關(guān)鍵技術(shù)難題，使微滴生成更加簡(jiǎn)便，本發(fā)明提供了一種數(shù)字pcr微滴制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)來實(shí)現(xiàn)的：

一種適用于數(shù)字pcr微滴生成的微流控裝置，其特征在于，包括油相微通道(7)、水相微通道(3)、出口通道(5)、油相入口(1)、水相入口(2)、擴(kuò)張角(8)；油相微通道(7)整體為長(zhǎng)方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的微通道，長(zhǎng)方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一邊a邊的中間位置與水相入口(2)連通，與長(zhǎng)方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一邊a邊相對(duì)的一邊b邊的中間位置與水相微通道(3)直接連接連通，同時(shí)出口通道(5)在長(zhǎng)方形環(huán)狀結(jié)構(gòu)的b邊中間位置也與油相微通道(7)連通；油相微通道(7)通過擴(kuò)張角與出口通道(5)連接連通，出口通道(5)與出口(6)連通；油相微通道(7)、水相微通道(3)、擴(kuò)張角(8)相連通處形成通道交叉(4)；在通道交叉(4)處，水相微通道(3)與油相微通道(7)連通的一段是直管，直管且垂直于油相微通道(7)的b邊；在通道交叉(4)處，水相微通道(3)和油相微通道(7)的連通口a與擴(kuò)張角(8)與和油相微通道(7)的連通口b相對(duì)；連通口b的直徑與連通口a的直徑相等；

水相微通道(3)為蛇形結(jié)構(gòu)；油相微通道(7)的直徑等于水相微通道(3)的直徑；優(yōu)選出口通道(5)的直徑是油相微通道(7)直徑的2-10倍；進(jìn)一步優(yōu)選油相微通道(7)的直徑和水相微通道(3)的直徑為80-120μm；出口通道(5)的直徑為200-300μm。進(jìn)一步優(yōu)選擴(kuò)張角(8)的角度為120-150°。

上述數(shù)字pcr微滴的制備裝置制備pcr微滴的方法，其特征在于，載體油從油相入口(1)進(jìn)入油相微通道(7)后在a邊進(jìn)行分流，分別流入兩側(cè)的微通道，由于兩側(cè)的微通道直徑相同，保證得到載體油的流速相同，減少微滴生成過程中由于流速變化造成的微滴大小不均勻；反應(yīng)液從水相入口(2)進(jìn)入后需經(jīng)過水相微通道(3)后，從油相入口流入的載體油和從水相入口(2)流入的反應(yīng)液會(huì)在通道交叉(4)處匯合，由于載體油縱向的剪切力和橫向的粘性拉力生成微滴，然后進(jìn)入出口通道(5)。

水相微通道(3)采用蛇形結(jié)構(gòu)微通道的作用是減少外界干擾引起的反應(yīng)液流速的瞬時(shí)改變，造成微滴生成不均勻，具有穩(wěn)流作用，同時(shí)減小入口流速變化對(duì)微滴生成單分散性的影響，影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果。

微流控裝置的設(shè)計(jì)主要針對(duì)數(shù)字pcr微滴生成這一特定問題，所述微通道包括水相入口通道、設(shè)置在水相入口通道后的蛇形穩(wěn)流通道、油相入口通道、設(shè)置在油相入口通道后的分流通道、出口為錐形放大的油相與水相交匯通道以及微滴生成后的輸出通道。

與油相入口通道相連的分流通道可以將油相平均分流到上下兩個(gè)通道，保證兩個(gè)通道內(nèi)油相流速的一致性。

各通道通過連接器與外界相連。

本發(fā)明的有益效果是，專門為數(shù)字pcr中的微滴生成設(shè)計(jì)，兼顧了微滴生成速率、體積、單分散性、生物相容性四方面因素，更加適用于數(shù)字pcr微滴生成。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明在微滴生成過程中的顯微鏡照片。

油相入口1、水相入口2、水相微通道3、通道交叉4、出口通道5、出口6、油相微通道7、擴(kuò)張角8。

具體實(shí)施方式:

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

適用于數(shù)字pcr微滴生成的微流控裝置見圖1，油相微通道7、水相微通道3、出口通道5在一個(gè)平面內(nèi)，微滴生成過程中的顯微鏡照片見圖2。

載體油從油相入口1進(jìn)入后在裝置的左側(cè)中間位置進(jìn)行分流，分別流入上下兩側(cè)的油相通道。由于上下側(cè)微通道結(jié)構(gòu)相同，可以保證得到載體油的流速相同，減少微滴生成過程中由于流速變化造成的微滴大小不均勻；反應(yīng)液從水相入口2進(jìn)入后需經(jīng)過蛇形結(jié)構(gòu)微通道3才能進(jìn)行后續(xù)的微滴生成。蛇形結(jié)構(gòu)微通道的作用是減少外界干擾引起的反應(yīng)液流速的瞬時(shí)改變，造成微滴生成不均勻，影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果。從油相入口流入的載體油1和從水相入口2流入的反應(yīng)液會(huì)在通道交叉4處匯合，載體油通道和反應(yīng)液通道在交叉位置4處相互垂直，由于載體油縱向的剪切力和橫向的粘性拉力生成微滴。位于通道交叉位置下游的微通道出口擴(kuò)張角為120-150°；出口通道5的直徑為油相和水相通道的2-10倍，有利于減小微滴出口壓力，便于微滴生成，生成后的微滴與載體油從出口6流出。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
一種數(shù)字PCR微滴制備方法，屬于數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域。包括水相通道、具有分流通道的油相通道、出口為錐形放大的油相與水相交叉通道以及微滴生成后的輸出通道。本發(fā)明主要解決數(shù)字PCR微滴生成中產(chǎn)率低、體積大、單分散性差的問題，可以提高數(shù)字PCR的檢測(cè)精度。

技術(shù)研發(fā)人員：馮繼宏;張森;高辛未;張碩晨
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.06.08
技術(shù)公布日：2017.08.29