-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)品安全檢測技術(shù)領域，更具體涉及一種黃顙魚組織中磺胺甲噁唑 代謝產(chǎn)物N4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)的制備方法，適用于黃顙魚肌肉、肝臟、腎 臟、鰓和卵巢組織中磺胺甲噁唑代謝產(chǎn)物N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ)，屬于廣譜抗菌藥物，是全球范圍內(nèi)銷售量 和使用量最大的藥物之一，廣泛用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)疾病的防治。人體長期攝入含有磺 胺類藥物殘留的動物性食品容易導致藥物在體內(nèi)蓄積，易導致細菌耐藥性的產(chǎn)生，對人類 的身體健康產(chǎn)生很大的危害。近年來，磺胺甲噁唑在體內(nèi)主要被N-乙?；D(zhuǎn)移酶代謝為N 4-乙?；前芳讎f唑，而且磺胺甲噁唑的毒性與體內(nèi)的代謝產(chǎn)物有關(guān)。攝入含磺胺類藥物殘留 的食物后會在人體內(nèi)蓄積，當藥物蓄積到一定濃度時會對人體機能產(chǎn)生損害，可產(chǎn)生過敏、 尿結(jié)晶、造血紊亂和致癌等毒性反應，因此，磺胺類藥物在動物源性食品中的殘留越來越受 到重視。
[0003] 為保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全，進而保護人類的健康，提供一種可靠的定性、定量方法分 析水產(chǎn)品中磺胺甲噁唑的代謝產(chǎn)物N4-乙?；?磺胺甲噁唑是非常必要的，但目前的分析方 法主要采用在水產(chǎn)品中添加的方式來判斷水產(chǎn)品中N 4-乙?；?磺胺甲噁唑分析方法的準 確度、精密度以及對其進行定量。但通過直接添加N4-乙?；?磺胺甲噁唑的方式與磺胺甲 噁唑在水產(chǎn)動物體內(nèi)代謝產(chǎn)生N 4-乙?；?磺胺甲噁唑的方式不同，磺胺甲噁唑在水產(chǎn)動物 體內(nèi)代謝過程復雜，與水產(chǎn)動物體結(jié)合形式多樣，在提取方式、提取劑的使用、檢測結(jié)果的 準確性等均同人為添加藥物殘留的檢測不同，因此，有必要制備一種水產(chǎn)動物組織中磺胺 甲噁唑的代謝產(chǎn)物N 4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)用于分析水產(chǎn)品中磺胺甲噁唑代 謝產(chǎn)物N4-乙?；?磺胺甲噁唑的殘留量，本發(fā)明發(fā)明了一種黃顙魚肌肉、肝臟、腎臟、鰓和 卵巢組織中磺胺甲噁唑代謝產(chǎn)物N 4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)的制備方法。
[0004] 目前，國內(nèi)外未見有黃顙魚組織中磺胺甲噁唑代謝產(chǎn)物N4-乙?；?磺胺甲噁唑殘 留標準物質(zhì)的制備方法的報道或申請專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種黃顙魚肌肉、肝臟、腎臟、鰓和卵巢組織中磺胺甲 噁唑代謝產(chǎn)物N4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)的制備方法，制備的N 4-乙酰基-磺胺甲 噁唑殘留標準物質(zhì)是采用給黃顙魚口灌磺胺甲噁唑，進入黃顙魚體內(nèi)的磺胺甲噁唑被黃顙 魚代謝為N 4-乙?；?磺胺甲噁唑，從而在黃顙魚肌肉、肝臟、腎臟、鰓和卵巢組織中形成一 定濃度的N4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留，在給藥后合適的時間（黃顙魚的組織中只有N 4-乙酰 基-磺胺甲噁唑殘留，沒有磺胺甲噁唑殘留）取黃顙魚的肌肉、肝臟、腎臟、鰓和卵巢組織，制 備出黃顙魚肌肉、肝臟、腎臟、鰓和卵巢組織中N 4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)，方法 易行，操作簡便，并對黃顙魚肌肉、肝臟、腎臟、鰓和卵巢組織中N4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留 標準物質(zhì)的濃度進行定值，并進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用 以下技術(shù)措施：
[0006] 其技術(shù)構(gòu)思是:選取60g~90g的已確認不含磺胺甲噁唑及其代謝產(chǎn)物N4-乙?；?磺胺甲噁唑的雌性黃顙魚在lm 3水族箱內(nèi)暫養(yǎng)一周，淡水養(yǎng)殖條件，水溫為25 °C~26°C，pH 為7.9~8.1，連續(xù)充氣，溶解氧值2 5. Omg/L。將0.84g磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰 胺中，再用水稀釋定容至1 OOmL，配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液，按60mg/kg黃顙魚的體 重的劑量口灌磺胺甲噁唑溶液，將口灌磺胺甲噁唑后的黃顙魚暫放在40L的水族箱中（有 20L水)觀察有無回吐，選擇沒有回吐的黃顙魚用于制備N 4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物 質(zhì)，將其放到lm3水族箱中，水族箱中有300L水，采集口灌磺胺甲噁唑后216h的黃顙魚的肌 肉、肝臟、腎臟、鰓和卵巢等組織。采集黃顙魚的背部肌肉，去皮后切成小塊，用高速勻質(zhì)機 (IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)將黃顙魚的肌肉勻質(zhì)，制備出肌肉中N4-乙?；?磺胺甲噁 唑殘留標準物質(zhì)，-20°C冷凍保存，有效期為3個月。打開黃顙魚的鰓蓋，采集黃顙魚的鰓弓 和鰓絲于10mL離心管中，用小剪刀將其剪碎后，用高速勻漿機(S-10手持式高速勻漿機)將 其勻質(zhì)，-20°C冷凍保存，有效期為3個月；采集黃顙魚的卵巢組織于50mL離心管中用高速勻 質(zhì)機(IKA ULTRA-TURRAX T18basic)將黃顙魚的卵巢勻漿，制備出卵巢中N4-乙?；?磺胺 甲噁唑殘留標準物質(zhì)，-20°C冷凍保存，有效期為3個月；采集黃顙魚的肝臟、腎臟組織分別 放于小塑料封口袋中，用手在袋外將袋內(nèi)肝臟和腎臟組織碾碎，分別制備出肝臟和腎臟中 N 4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)，-20°C冷凍保存，有效期為3個月。
[0007] 一種黃顙魚組織中N4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)的制備方法，其步驟是：
[0008] A、選取60g~90g已確認不含磺胺甲噁唑和N4-乙?；?磺胺甲噁唑的雌性黃顙魚， 在lm 3水族箱內(nèi)暫養(yǎng)一周，用于制備黃顙魚肌肉、肝臟、腎臟、鮑和卵巢組織中N4-乙?；?磺 胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)。淡水養(yǎng)殖條件，水溫為25°C~26°C，pH為7.9~8.1，連續(xù)充氣，溶解 氧值 2 5.0mg/L;
[0009] B、稱取0.84g磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再用水稀釋定容至100mL， 配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液；
[0010] C、按60mg/kg黃顙魚的體重的劑量口灌磺胺甲噁唑溶液，將口灌磺胺甲噁唑后的 黃顙魚暫放在40L的水族箱中（有20L水）觀察有無回吐，選擇沒有回吐的黃顙魚用于制備 N4-乙酰基-磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)；
[0011] D、將沒有回吐的黃顙魚放入另一水族箱中（有300L水的lm3水族箱中），養(yǎng)殖過程 中不飼喂任何飼料；
[0012] E、從水族箱中取5尾養(yǎng)殖192h-240h后的黃顙魚，分別采集新鮮黃顙魚的背部肌 肉、肝臟、腎臟、鮑和卵巢等組織，將相同組織合并。
[0013] F、將采集新鮮黃顙魚的背部肌肉，去皮后切成小塊，用高速勻質(zhì)機（11^1]1^1^-TURRAX T18 basic)將黃顙魚的肌肉勻質(zhì)，制備出肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑殘留標準 物質(zhì)，-20 °C冷凍保存，有效期為3個月。
[0014] G、打開黃顙魚的鰓蓋，用采集新鮮黃顙魚的鰓弓和鰓絲于1 OmL離心管中，用小剪 刀將其剪碎后，用高速勻漿機(S-?ο手持式高速勻漿機)將其勻質(zhì)，-20°c冷凍保存，有效期 為3個月；
[0015] H、采集新鮮黃顙魚的卵巢組織于50mL離心管中用高速勻質(zhì)機（IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)將黃顙魚的卵巢勻漿，制備出卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)，-20 "€冷凍保存，有效期為3個月；
[0016] I、采集新鮮黃顙魚的肝臟、腎臟組織分別放于小塑料封口袋中，用手在袋外將袋 內(nèi)肝臟和腎臟組織碾碎，分別制備出肝臟和腎臟中N 4-乙?；?磺胺甲噁唑殘留標準物質(zhì)，-20 °C冷凍保存，有效期為3個月；
[0017] 黃顙魚各組織中N4-乙?；?磺胺甲噁唑定量分析方法：
[0018] J、將黃顙魚肝臟、腎臟、鰓、卵巢和肌肉組織的樣品進行處理：從采集新鮮黃顙魚 的肝臟、腎臟、鰓、卵巢和肌肉組織中，分別稱取lg肝臟、腎臟、鰓、卵巢和2g肌肉組織樣品， 分別放到10mL離心管中，加入50yL lyg/mL的磺胺甲噁唑同位素內(nèi)標(磺胺甲噁唑-d4)，再 加入5mL乙腈，振蕩30s左右，超聲3min，再加入lg無水硫酸鈉，振蕩30s左右，8000r/min離心 4 -6min，轉(zhuǎn)移上層液體到10mL離心管中，再向殘渣中加入4mL乙腈，振蕩30s左右，8000r/ min離心4一6min，合并兩次乙腈提取液于同一 10mL離心管中，置49一51°C氮吹儀上氮吹至 干，加入lmL定容溶液溶解殘渣，振蕩30s左右，加入試劑A，振蕩30s左右，8000r/min，離心 4 一 6min，棄去上層液體，下層液體過0.22μπι聚醚砜水系濾頭過濾，獲得從肝臟、腎臟、鰓、卵 巢組織中提取、凈化后含Ν 4-乙?；?磺胺甲噁唑可供HPLC-MS/MS分析的液體。
[0019] K、HPLC-MS/MS的分析條件:色譜柱:Hypersil GOLD C18色譜柱（150mmX2. lmm,5μ m);柱溫:34 - 36°C，流速:0.2mL/min;流動相:有機相為試劑Β，水相為試劑C和試劑D的水溶 液。梯度洗脫程序:有機相與水相初始的體積比為20:80，維持lmin;從lmin到3min，有機相 與水相的體積比由20:80均勻變?yōu)?5:55;從3. Omin到7.5min，有機相與水相的體積比45:55 維持不變;再從7.5min到7.6min，有機相與水相的體積比由45:55均勻變?yōu)?0:80; 7.6min到 8.5min，有機相與水相的體積比維持20:80不變;進樣量1(^匕
[0020] L、離子化模式:大氣壓電噴霧離子源(ESI )，正離子模式;檢測方式采用選擇反應 監(jiān)測（SRM)模式；噴霧電壓：3500V;蒸發(fā)氣溫度：48 - 52 °C ;鞘氣壓力35arb ;輔助氣壓力 5arb;碰撞氣及壓力:氬氣(純度2 99.999)，1.5m Torr;離子傳輸毛細管溫度:348 - 352°C ; Q1 PW 0.7，Q3 PW 0.7。母離