本發(fā)明涉及微生物技術(shù)與酶技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法。
背景技術(shù)：
納豆是日本人最愛(ài)吃的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，納豆激酶（nattokinase，nk）是用大豆發(fā)酵制備的一種具有多種生物活性的蛋白酶，人們已對(duì)其進(jìn)行了相當(dāng)廣泛深入的研究。現(xiàn)代科學(xué)研究已表明，它的結(jié)構(gòu)為無(wú)空間折疊的線性氨基酸鏈，特征性作用底物為纖維蛋白，其溶栓作用優(yōu)于蛇毒纖溶酶、尿激酶（uk）和蚓激酶，具有4倍大于纖溶酶的纖溶活性，分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于尿激酶、蚓激酶，且可由腸道吸收。據(jù)報(bào)道，納豆激酶可以有效地溶解血栓，另外還具有降低血液粘度，抑制血小板凝固，降血脂、降膽固醇，改善血液循環(huán)狀況，維持血細(xì)胞的正常形態(tài)和功能等多種生理功能。納豆激酶不僅擁有纖溶酶原激活活性，而且還能直接消化利用有限的蛋白質(zhì)纖維。納豆激酶的體內(nèi)外溶栓性質(zhì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)也已得到確定，在體內(nèi)作用迅速，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，還能激活體內(nèi)的纖維蛋白酶，使之溫和、持續(xù)地提高血液的溶纖活性。其溶解血栓作用上的優(yōu)點(diǎn)是它的持續(xù)性。目前臨床上常用的血栓溶解劑（溶栓藥物）大都是注射劑，無(wú)論是哪種注入體內(nèi)，其作用時(shí)間(半衰期)都很短，只有4～20分鐘，而納豆激酶的作用時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)4～8小時(shí)。所以，納豆激酶不僅有望成為臨床治療血栓病的首選治療劑，其不同級(jí)別不同類型的制劑在預(yù)防和保健領(lǐng)域也將發(fā)揮重要作用。
雖然人們已對(duì)納豆激酶的理化特性和生理藥理活性進(jìn)行了相當(dāng)多的研究，并且不斷有新菌株被分離篩選出的報(bào)道，但大都是采用經(jīng)典的菌種篩選方法獲得的。經(jīng)典的菌種篩選方法主要有：反復(fù)的自然選育法、物理誘變法和化學(xué)誘變法等。這些方法雖然為新菌種的發(fā)現(xiàn)和獲得做出了重大貢獻(xiàn)，但普遍存在工作量大、效率低，隨機(jī)性大、目標(biāo)性差，就像大海撈針一樣，周期長(zhǎng)，材料消耗量大等缺陷。先進(jìn)的基因定點(diǎn)突變篩選法雖然大大提高了篩選的目標(biāo)性和方向性，但其應(yīng)用有個(gè)前提條件是，必須要搞清擬誘變與篩選菌株/菌種的基因組成、基因結(jié)構(gòu)和基因功能，而由于科技發(fā)展的水平等原因，目前這幾項(xiàng)都能真正清楚的微生物菌種/菌株還很少見(jiàn)，對(duì)于產(chǎn)納豆激酶的納豆芽孢桿菌菌株來(lái)說(shuō)，更是罕見(jiàn)。因而，使大多數(shù)的菌株的篩選無(wú)法或難以實(shí)現(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)或不足，本發(fā)明提供一種納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法，該方法是依據(jù)納豆激酶的理化特性和納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)代謝特性通過(guò)一種選擇性培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，借助于高通量篩選和od值的快速檢測(cè)等技術(shù)以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選。
該納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法包括以下工藝步驟：
（1）篩選培養(yǎng)基的制備
初篩液態(tài)培養(yǎng)基組成：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l；二異丙基氟代磷酸酯0.001-0.1g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯0.001-1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.001-0.5g/l或碘乙酸0.001-1g/l中的一種或其組合；青霉素0.001-0.5g/l、潔霉素0.001-0.5g/l或先鋒霉素0.001-0.5g/l中的一種或其組合；余量：去離子水；調(diào)節(jié)ph到7.2，121℃滅菌20-30min，備用；
初篩固態(tài)培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基組分，添加瓊脂15g/l同樣條件下滅菌即得初篩固態(tài)培養(yǎng)基，備用；
復(fù)篩液態(tài)培養(yǎng)基：豆粉4-10%，蔗糖2-8%，余量：去離子水，ph=7.2，115℃滅菌20min，備用；
復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10-40g/l，酵母粉5-20g/l，氯化鈉10g/l，瓊脂15g/l；ph=7.2，121℃滅菌20-30min，備用；
（2）初篩
按照微生物的無(wú)菌操作規(guī)范，在96或384深孔板內(nèi)各加入1ml液體培養(yǎng)基，將來(lái)自自然或經(jīng)理化等因子處理的在普通lb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的典型單菌落分別接種到每個(gè)深孔內(nèi)，37℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)24-48h，然后離心取上清液200ul于96或384微孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀法測(cè)其光密度od680nm，選取od680nm值較大的數(shù)株作為候選高產(chǎn)菌株；
（3）復(fù)篩
a.雙碟培養(yǎng)將獲得的候選高產(chǎn)菌株原種再各取一份分別接種到初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)24-48h；生長(zhǎng)旺盛的單菌落即為納豆激酶高產(chǎn)菌株，挑取幾個(gè)單菌落，備檢；
b.復(fù)驗(yàn)將得到的初篩固態(tài)培養(yǎng)良好的納豆激酶高產(chǎn)菌株按1%接種量接到50ml復(fù)篩液體培養(yǎng)基上，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h，離心取上清液即為粗酶液，采用folin-酚法和瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其酶活力大小，酶活力最大者即為納豆激酶高產(chǎn)菌株；
c.斜面培養(yǎng)保藏將選取的納豆激酶高產(chǎn)菌株從對(duì)應(yīng)的初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到復(fù)篩固態(tài)試管斜面培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h后即得所述高產(chǎn)菌株，置4℃冰箱中保藏。
實(shí)施上述發(fā)明需用的主要儀器有：數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，hh-4型，河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司；便攜式防水型ph/mv/℃測(cè)定儀，hi8424型，hannainstruments；可見(jiàn)分光光度計(jì)，723型，上海精密科學(xué)儀器有限公司，微量移液器，百得實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司，phb-1型ph計(jì)，上海宇隆儀器有限公司，alc-2103型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，gl-16a冷凍離心機(jī)、tgl-16c型臺(tái)式高速離心機(jī)、tdl-5a型低速離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司，渦旋混合器hq-60-ⅱ，北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司，ldzx-0kbs型立式高溫蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠，elix10型超純水系統(tǒng)，milipore，thz-312型臺(tái)式恒溫振蕩器、shp-150型生化培養(yǎng)箱、dk-8d型電熱恒溫水槽、dhg-9246a型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，sw-cj-zf型雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司，v-1100型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司，酶標(biāo)儀，biotek，usa，等。
本發(fā)明的特點(diǎn)和有益效果是：
與典或傳統(tǒng)的自然選育法、物理誘變法和化學(xué)誘變法等菌種篩選方法相比，本發(fā)明具有方向明確，目標(biāo)精準(zhǔn)，工作量小，用時(shí)短，效率高，成功率大等優(yōu)點(diǎn)，不僅使其工作量大、效率低，篩選的隨機(jī)性大、目標(biāo)性差的缺點(diǎn)得以克服，還使篩選周期明顯縮短；該方法不是以菌落大小為主要依據(jù)，而是以快速得到的酶活高低為判斷標(biāo)準(zhǔn)；與前沿的基因定點(diǎn)突變篩選法相比，不僅沒(méi)有降低篩選的目標(biāo)性和方向性，還節(jié)省了大量的人力物力財(cái)力消耗等，同時(shí)，也大大降低了篩選的難度。本方法操作簡(jiǎn)單，方便快捷，省時(shí)省力省錢，可廣泛用于絲氨酸蛋白酶類產(chǎn)生菌的快速篩選，亦可為其它相關(guān)菌種的高效快速篩選提供借鑒。
具體實(shí)施方式
以下詳細(xì)介紹本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1：
主要儀器：數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，hh-4型，河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司；便攜式防水型ph/mv/℃測(cè)定儀，hi8424型，hannainstruments；可見(jiàn)分光光度計(jì)，723型，上海精密科學(xué)儀器有限公司，微量移液器，百得實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司，phb-1型ph計(jì)，上海宇隆儀器有限公司，alc-2103型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，gl-16a冷凍離心機(jī)、tgl-16c型臺(tái)式高速離心機(jī)、tdl-5a型低速離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司，渦旋混合器hq-60-ⅱ，北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司，ldzx-0kbs型立式高溫蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠，elix10型超純水系統(tǒng)，milipore，thz-312型臺(tái)式恒溫振蕩器、shp-150型生化培養(yǎng)箱、dk-8d型電熱恒溫水槽、dhg-9246a型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，sw-cj-zf型雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司，v-1100型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司，酶標(biāo)儀，biotek，usa。
納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法包括以下工藝步驟：
（1）篩選培養(yǎng)基的制備
初篩液態(tài)培養(yǎng)基組成：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l；二異丙基氟代磷酸酯0.1g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.5g/l或碘乙酸1g/l；青霉素0.001g/l、潔霉素0.001g/l或先鋒霉素0.001g/l；余量：去離子水，調(diào)節(jié)ph到7.2，121℃滅菌20-30min，備用；
初篩固態(tài)培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基組分，添加瓊脂15g/l同樣條件下滅菌即得初篩固態(tài)培養(yǎng)基，備用；
復(fù)篩液態(tài)培養(yǎng)基：豆粉10%，蔗糖8%，余量：去離子水，ph=7.2，115℃滅菌20min，備用；
復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨40g/l，酵母粉20g/l，氯化鈉10g/l，瓊脂15g/l；ph=7.2，121℃滅菌30min，備用；
（2）初篩
按照微生物的無(wú)菌操作規(guī)范，在96或384深孔板內(nèi)各加入1ml液體培養(yǎng)基，將來(lái)自自然或經(jīng)理化等因子處理的在普通lb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的典型單菌落分別接種到每個(gè)深孔內(nèi)，37℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)48h，然后離心取上清液200ul于96或384微孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀法測(cè)其光密度od680nm，選取od680nm值較大的數(shù)株作為候選高產(chǎn)菌株；
（3）復(fù)篩
a.雙碟培養(yǎng)將獲得的候選高產(chǎn)菌株原種再各取一份分別接種到初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h；生長(zhǎng)旺盛的單菌落即為納豆激酶高產(chǎn)菌株，挑取幾個(gè)單菌落，備檢；
b.復(fù)驗(yàn)將得到的初篩固態(tài)培養(yǎng)良好的納豆激酶高產(chǎn)菌株按1%接種量接到50ml復(fù)篩液體培養(yǎng)基上，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h，離心取上清液即為粗酶液，采用folin-酚法和瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其酶活力大小，酶活力最大者即為納豆激酶高產(chǎn)菌株；
c.斜面培養(yǎng)保藏將選取的納豆激酶高產(chǎn)菌株從對(duì)應(yīng)的初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到復(fù)篩固態(tài)試管斜面培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h后即得所述高產(chǎn)菌株，置4℃冰箱中保藏。
實(shí)施例2：
主要儀器：與實(shí)施例1相同。
納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法包括以下工藝步驟：
（1）篩選培養(yǎng)基的制備
初篩液態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l；二異丙基氟代磷酸酯0.001g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯0.001g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.001g/l或碘乙酸0.001g/l；青霉素0.5g/l、潔霉素0.5g/l或先鋒霉素0.5g/l；余量：去離子水，調(diào)節(jié)ph到7.2，121℃滅菌20-30min，備用；
初篩固態(tài)培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基組分，添加瓊脂15g/l同樣條件下滅菌即得初篩固態(tài)培養(yǎng)基，備用；
復(fù)篩液態(tài)培養(yǎng)基：豆粉4%，蔗糖2%，余量：去離子水，ph=7.2，115℃滅菌20min，備用；
復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l，瓊脂15g/l；ph=7.2，121℃滅菌20min，備用；
（2）初篩
按照微生物的無(wú)菌操作規(guī)范，在96或384深孔板內(nèi)各加入1ml液體培養(yǎng)基，將來(lái)自自然或經(jīng)理化等因子處理的在普通lb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的典型單菌落分別接種到每個(gè)深孔內(nèi)，37℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)24h，然后離心取上清液200ul于96或384微孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀法測(cè)其光密度od680nm，選取od680nm值較大的數(shù)株作為候選高產(chǎn)菌株；
（3）復(fù)篩
a.雙碟培養(yǎng)將獲得的候選高產(chǎn)菌株原種再各取一份分別接種到初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)24h；生長(zhǎng)旺盛的單菌落即為納豆激酶高產(chǎn)菌株，挑取幾個(gè)單菌落，備檢；
b.復(fù)驗(yàn)將得到的初篩固態(tài)培養(yǎng)良好的納豆激酶高產(chǎn)菌株按1%接種量接到50ml復(fù)篩液體培養(yǎng)基上，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h，離心取上清液即為粗酶液，采用folin-酚法和瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其酶活力大小，酶活力最大者即為納豆激酶高產(chǎn)菌株；
c.斜面培養(yǎng)保藏將選取的納豆激酶高產(chǎn)菌株從對(duì)應(yīng)的初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到復(fù)篩固態(tài)試管斜面培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h后即得所述高產(chǎn)菌株，置4℃冰箱中保藏。
實(shí)施例3：
主要儀器：與實(shí)施例1相同。
納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法包括以下工藝步驟：
（1）篩選培養(yǎng)基的制備
初篩液態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l；二異丙基氟代磷酸酯0.05g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯0.1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.05g/l或碘乙酸0.1g/l；青霉素0.08g/l、潔霉素0.1g/l或先鋒霉素0.06g/l；余量：去離子水，調(diào)節(jié)ph到7.2，121℃滅菌30min，備用；
初篩固態(tài)培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基組分，添加瓊脂15g/l同樣條件下滅菌即得初篩固態(tài)培養(yǎng)基，備用；
復(fù)篩液態(tài)培養(yǎng)基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去離子水，ph=7.2，115℃滅菌20min，備用；
復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化鈉10g/l，瓊脂15g/l；ph=7.2，121℃滅菌25min，備用；
（2）初篩
按照微生物的無(wú)菌操作規(guī)范，在96或384深孔板內(nèi)各加入1ml液體培養(yǎng)基，將來(lái)自自然或經(jīng)理化等因子處理的在普通lb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的典型單菌落分別接種到每個(gè)深孔內(nèi)，37℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)32h，然后離心取上清液200ul于96或384微孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀法測(cè)其光密度od680nm，選取od680nm值較大的數(shù)株作為候選高產(chǎn)菌株；
（3）復(fù)篩
a.雙碟培養(yǎng)將獲得的候選高產(chǎn)菌株原種再各取一份分別接種到初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)36h；生長(zhǎng)旺盛的單菌落即為納豆激酶高產(chǎn)菌株，挑取幾個(gè)單菌落，備檢；
b.復(fù)驗(yàn)將得到的初篩固態(tài)培養(yǎng)良好的納豆激酶高產(chǎn)菌株按1%接種量接到50ml復(fù)篩液體培養(yǎng)基上，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h，離心取上清液即為粗酶液，采用folin-酚法和瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其酶活力大小，酶活力最大者即為納豆激酶高產(chǎn)菌株；
c.斜面培養(yǎng)保藏將選取的納豆激酶高產(chǎn)菌株從對(duì)應(yīng)的初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到復(fù)篩固態(tài)試管斜面培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h后即得所述高產(chǎn)菌株，置4℃冰箱中保藏。
實(shí)施例4：
主要儀器：與實(shí)施例1相同。
納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法包括以下工藝步驟：
（1）篩選培養(yǎng)基的制備
初篩液態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l；二異丙基氟代磷酸酯0.05g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯0.1g/l、苯甲基磺酰氟（pmsf）0.05g/l；青霉素0.08g/l、潔霉素0.1g/l；余量：去離子水，調(diào)節(jié)ph到7.2，121℃滅菌30min，備用；
初篩固態(tài)培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基組分，添加瓊脂15g/l同樣條件下滅菌即得初篩固態(tài)培養(yǎng)基，備用；
復(fù)篩液態(tài)培養(yǎng)基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去離子水，ph=7.2，115℃滅菌20min，備用；
復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化鈉10g/l，瓊脂15g/l；ph=7.2，121℃滅菌25min，備用；
（2）初篩
按照微生物的無(wú)菌操作規(guī)范，在96或384深孔板內(nèi)各加入1ml液體培養(yǎng)基，將來(lái)自自然或經(jīng)理化等因子處理的在普通lb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的典型單菌落分別接種到每個(gè)深孔內(nèi)，37℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)32h，然后離心取上清液200ul于96或384微孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀法測(cè)其光密度od680nm，選取od680nm值較大的數(shù)株作為候選高產(chǎn)菌株；
（3）復(fù)篩
a.雙碟培養(yǎng)將獲得的候選高產(chǎn)菌株原種再各取一份分別接種到初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)36h；生長(zhǎng)旺盛的單菌落即為納豆激酶高產(chǎn)菌株，挑取幾個(gè)單菌落，備檢；
b.復(fù)驗(yàn)將得到的初篩固態(tài)培養(yǎng)良好的納豆激酶高產(chǎn)菌株按1%接種量接到50ml復(fù)篩液體培養(yǎng)基上，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h，離心取上清液即為粗酶液，采用folin-酚法和瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其酶活力大小，酶活力最大者即為納豆激酶高產(chǎn)菌株；
c.斜面培養(yǎng)保藏將選取的納豆激酶高產(chǎn)菌株從對(duì)應(yīng)的初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到復(fù)篩固態(tài)試管斜面培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h后即得所述高產(chǎn)菌株，置4℃冰箱中保藏。
實(shí)施例5：
主要儀器：與實(shí)施例1相同。
納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法包括以下工藝步驟：
（1）篩選培養(yǎng)基的制備
初篩液態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l；二異丙基氟代磷酸酯0.05g/l、o,o-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯0.1g/l；青霉素0.08g/l；余量：去離子水，調(diào)節(jié)ph到7.2，121℃滅菌30min，備用；
初篩固態(tài)培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基組分，添加瓊脂15g/l同樣條件下滅菌即得初篩固態(tài)培養(yǎng)基，備用；
復(fù)篩液態(tài)培養(yǎng)基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去離子水，ph=7.2，115℃滅菌20min，備用；
復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化鈉10g/l，瓊脂15g/l；ph=7.2，121℃滅菌25min，備用；
（2）初篩
按照微生物的無(wú)菌操作規(guī)范，在96或384深孔板內(nèi)各加入1ml液體培養(yǎng)基，將來(lái)自自然或經(jīng)理化等因子處理的在普通lb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的典型單菌落分別接種到每個(gè)深孔內(nèi)，37℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)32h，然后離心取上清液200ul于96或384微孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀法測(cè)其光密度od680nm，選取od680nm值較大的數(shù)株作為候選高產(chǎn)菌株；
（3）復(fù)篩
a.雙碟培養(yǎng)將獲得的候選高產(chǎn)菌株原種再各取一份分別接種到初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)36h；生長(zhǎng)旺盛的單菌落即為納豆激酶高產(chǎn)菌株，挑取幾個(gè)單菌落，備檢；
b.復(fù)驗(yàn)將得到的初篩固態(tài)培養(yǎng)良好的納豆激酶高產(chǎn)菌株按1%接種量接到50ml復(fù)篩液體培養(yǎng)基上，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h，離心取上清液即為粗酶液，采用folin-酚法和瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其酶活力大小，酶活力最大者即為納豆激酶高產(chǎn)菌株；
c.斜面培養(yǎng)保藏將選取的納豆激酶高產(chǎn)菌株從對(duì)應(yīng)的初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到復(fù)篩固態(tài)試管斜面培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h后即得所述高產(chǎn)菌株，置4℃冰箱中保藏。
實(shí)施例6：
主要儀器：與實(shí)施例1相同。
納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選方法包括以下工藝步驟：
（1）篩選培養(yǎng)基的制備
初篩液態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l；二異丙基氟代磷酸酯0.05g/l；潔霉素0.1g/l；余量：去離子水，調(diào)節(jié)ph到7.2，121℃滅菌30min，備用；
初篩固態(tài)培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基組分，添加瓊脂15g/l同樣條件下滅菌即得初篩固態(tài)培養(yǎng)基，備用；
復(fù)篩液態(tài)培養(yǎng)基：豆粉8%，蔗糖5%，余量：去離子水，ph=7.2，115℃滅菌20min，備用；
復(fù)篩固態(tài)培養(yǎng)基：大豆蛋白胨30g/l，酵母粉10g/l，氯化鈉10g/l，瓊脂15g/l；ph=7.2，121℃滅菌25min，備用；
（2）初篩
按照微生物的無(wú)菌操作規(guī)范，在96或384深孔板內(nèi)各加入1ml液體培養(yǎng)基，將來(lái)自自然或經(jīng)理化等因子處理的在普通lb培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的典型單菌落分別接種到每個(gè)深孔內(nèi)，37℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)32h，然后離心取上清液200ul于96或384微孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀法測(cè)其光密度od680nm，選取od680nm值較大的數(shù)株作為候選高產(chǎn)菌株；
（3）復(fù)篩
a.雙碟培養(yǎng)將獲得的候選高產(chǎn)菌株原種再各取一份分別接種到初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)36h；生長(zhǎng)旺盛的單菌落即為納豆激酶高產(chǎn)菌株，挑取幾個(gè)單菌落，備檢；
b.復(fù)驗(yàn)將得到的初篩固態(tài)培養(yǎng)良好的納豆激酶高產(chǎn)菌株按1%接種量接到50ml復(fù)篩液體培養(yǎng)基上，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h，離心取上清液即為粗酶液，采用folin-酚法和瓊脂糖-纖維蛋白平板法比較其酶活力大小，酶活力最大者即為納豆激酶高產(chǎn)菌株；
c.斜面培養(yǎng)保藏將選取的納豆激酶高產(chǎn)菌株從對(duì)應(yīng)的初篩固態(tài)雙碟培養(yǎng)基上挑取一環(huán)接種到復(fù)篩固態(tài)試管斜面培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)48h后即得所述高產(chǎn)菌株，置4℃冰箱中保藏。
本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，所有在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。