本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥和微生物肥料
技術領域：
，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和一株死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)及其微生物菌劑和應用。
背景技術：
：隨著化學農(nóng)藥的大量、頻繁使用，環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和增加抗性等問題也越來越嚴重，植物病害的生物防治成為了研究熱點，其中尤以植物內(nèi)生菌作為拮抗菌的研究得到眾多學者的觀注。植物內(nèi)生細菌是指生活在植物的根、莖、葉、花、果實和種子中，但對植物沒有任何實質(zhì)性傷害的細菌，其具有多種生物學功能，特別是抑菌功能成為生防菌資源的有力支撐。研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌對植物有促進生長的作用，這些促生作用主要體現(xiàn)在內(nèi)生細菌通過產(chǎn)iaa、固氮作用和通過解磷或溶磷作用使植物能夠盡可能的得到養(yǎng)分的補充，從而使植物對生物量進行了積累；植物內(nèi)生細菌也可以通過分泌抑菌物質(zhì)、與病原菌競爭營養(yǎng)空間及誘導植物獲得抗病性阻止或降低病原菌對植物的侵染或造成的危害。以內(nèi)生細菌為菌種資源研制的微生物農(nóng)藥不易產(chǎn)生抗藥性，不傷害天敵，且能利用農(nóng)副產(chǎn)品甚至工業(yè)廢水廣泛生產(chǎn)，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)后為生產(chǎn)綠色或無公害農(nóng)產(chǎn)品提供了一個新的途徑。大量使用化學氮肥、磷肥和鉀肥會導致重金屬在土體中累積、資源與能源大量消耗、環(huán)境污染，且其利用率低，未被吸收利用的氮肥在農(nóng)田中流失或揮發(fā)，對地下水資源、土壤和空氣造成了嚴重污染，使農(nóng)畜產(chǎn)品的有毒物質(zhì)超標，給人類健康帶來了極大的危害，同時化肥的長期大量施用破壞土壤團粒結(jié)構(gòu)，造成土壤板結(jié)，肥力下降。微生物肥料作為一種新型肥料，施入土壤后，通過其特定菌株的快速繁殖，能固定大氣中的氮素、釋放土壤中固定態(tài)的磷、鉀元素，使得環(huán)境的養(yǎng)分潛力得以充分發(fā)揮，并為作物生長營造一個良好的土壤微生物環(huán)境，在減少化肥用量、降低環(huán)境污染、提高農(nóng)作物品質(zhì)等方面具有重要意義。尤其是集抑菌、固氮、解磷、解鉀和作物生長素于一身的復合微生物肥料的研發(fā)，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中有舉足輕重的作用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中化學農(nóng)藥和化肥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全性差的缺陷，提供一株解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和一株死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)及其微生物菌劑和應用，所述解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)具有廣譜殺菌活性和促生能力，可用來制備環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安全性好的內(nèi)生芽孢桿菌微生物菌劑。另外，所述菌株和菌劑能夠作為微生物農(nóng)藥和肥料使用，能夠抑制鐮刀菌（fusariumsolani），其抑菌率在72.2%以上；對馬鈴薯有促進作用，可以作為防治根腐病專用微生物農(nóng)藥和微生物肥料使用，從而可以克服現(xiàn)有技術中化學農(nóng)藥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全性差的缺陷，以實現(xiàn)環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安全性好的優(yōu)點。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：本發(fā)明從高寒草地珠芽蓼(polygonumviviparum)、紫花針茅(stipapurpurcagriseb)，線葉嵩(kobreasiacapillifolia)，秦艽(gentianamacrophypall)和乳白香青(anaphalislacteamaxin)等的內(nèi)生細菌中篩選獲得對馬鈴薯病原菌具有抑菌和對馬鈴薯具促生作用的內(nèi)生細菌：解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)菌株，并對其生物學功能進行了研究，優(yōu)化了其培養(yǎng)條件及發(fā)酵條件，并進行了防治試驗，提供了2株生物防治和生物菌肥的菌種資源和其菌劑的制備方法。一種解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)，所述解淀粉芽孢桿菌的保藏編號為cgmccno.13718。一種死谷芽孢桿菌（b.vallismortis），所述死谷芽孢桿菌的保藏編號為cgmccno.13719。一種微生物菌劑，所述微生物菌劑含有上述的解淀粉芽孢桿菌的活菌體和死谷芽孢桿菌的活菌體。進一步的，以所述微生物菌劑的總重量為基準，所述解淀粉芽孢桿菌的活菌體和死谷芽孢桿菌的活菌體的含量共為6.6×1011cfu/g~6.6×1012cfu/g。進一步的，所述微生物菌劑中還含有發(fā)酵基質(zhì)，所述發(fā)酵基質(zhì)為草炭、有機肥、骨粉的混合物。進一步的，以所述微生物菌劑的總重量為基準，所述菌體的質(zhì)量百分比含量為5-15%，其余為發(fā)酵基質(zhì)。所述的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：1）制備種子液：分別將所述解淀粉芽孢桿菌和死谷芽孢桿菌兩種菌的單個拮抗菌株在lb平板上劃線培養(yǎng)，48h后挑取單菌落接入50mlnb培養(yǎng)液中，28℃，150r/min下培養(yǎng)12h得種子液，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)od600為0.5后，以2%的接種量接入50ml/150ml搖瓶，28℃，150r/min培養(yǎng)36h，分別制得兩種菌的發(fā)酵種子液；2）制備發(fā)酵液：所述解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)的發(fā)酵條件為：牛肉胨3.0g、酵母膏3.0g、乳糖22.0g、cacl23.0g、ph7.0，接種量10%，溫度28℃，轉(zhuǎn)速210r/min，得到解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液；所述死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的發(fā)酵條件為：牛肉胨3.0g、酵母膏3.0g、乳糖20.0g、nacl3.0g、ph7.0，接種量14%，溫度28℃，轉(zhuǎn)速180r/min，得到死谷芽孢桿菌發(fā)酵液；3）將發(fā)酵的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)按質(zhì)量百分比含量為5-15%接種，其余為發(fā)酵基質(zhì)，溫度為24℃~32℃條件下，進行固體發(fā)酵96h~192h，制得微生物菌劑。進一步的，所述的解淀粉芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌及所述的微生物菌劑，可應用于制備根腐病專用微生物農(nóng)藥。進一步的，所述的解淀粉芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌及所述的微生物菌劑，可應用于制備根腐病專用微生物肥料。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術的有益效果為：1、本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌，及利用所述兩株菌株制備得到的微生物菌劑，具有抑菌作用和促生作用，能夠作為微生物農(nóng)藥和肥料使用，能夠抑制根腐病菌（fusariumsolani），其抑菌率在72%以上；2、本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌，及利用所述兩株菌株制備得到的微生物菌劑，對馬鈴薯有促生作用，可以作為微生物農(nóng)藥和微生物肥料使用，從而可以克服現(xiàn)有技術中化學農(nóng)藥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全性差的缺陷，以實現(xiàn)環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安全性好的優(yōu)點。附圖說明圖1解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株的菌落形態(tài)；圖2為死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的菌落形態(tài)。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。生物保藏：本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)，于2017年3月2日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101）（保藏單位的縮寫為cgmcc），保藏編號為cgmccno.13718。本發(fā)明的死谷芽孢桿菌（b.vallismortis），于2017年3月2日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101）（保藏單位的縮寫為cgmcc），保藏編號為cgmccno.13719。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例1解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的獲得和鑒定一、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的獲得。本發(fā)明從高寒草地珠芽蓼(polygonumviviparum)、紫花針茅(stipapurpurcagriseb)，線葉嵩(kobreasiacapillifolia)，秦艽(gentianamacrophypall)和乳白香青(anaphalislacteamaxin)等的內(nèi)生細菌中，利用對峙培養(yǎng)法即培養(yǎng)皿中央接入病原菌，四周2.5厘米處等距離接種內(nèi)生細菌，培養(yǎng)5-7天后十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，以抑菌率為依據(jù)篩選獲得2株對根腐病原菌具有抑菌和對馬鈴薯具促生作用的內(nèi)生細菌：解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)，本申請人將其保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為cgmccno.13718和cgmccno.13719，保藏時間為2017年3月2日。二、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的鑒定。（1）對解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的形態(tài)鑒定。將解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)接種于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d的培養(yǎng)性狀為：菌落白色，不規(guī)則形，大小6-9mm，邊緣波紋狀，表面褶皺，中間隆起，干燥，菌體0.45~0.80×0.89~4.19μm。將死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)接種于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d的培養(yǎng)性狀為：菌落乳白色，圓形，大小5-8mm，邊緣不規(guī)則，表面褶皺，干燥，0.32~0.57×0.81~2.81μm。（2）對解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的16srdna基因序列鑒定。將解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)的16srdna基因序列在genebank中與b.amyloliquefaciens(kj149810.1)聚合，結(jié)合形態(tài)特征鑒定為b.amyloliquefaciens。死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的16srdna基因序列在genebank中與b.vallismortis(kf818642.1)聚合，結(jié)合形態(tài)特征鑒定為b.vallismortis。實施例2解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)微生物菌劑的制備本實施例所述的微生物菌劑的生物活性組份和重量百分比含量包括：解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)5%（2菌株1：1比例）和發(fā)酵基質(zhì)余量。所述發(fā)酵基質(zhì)的組份和含量包括：草炭、有機肥、骨粉混合作為發(fā)酵基質(zhì)，占比分別為45%、45%、10%，含水量30-50%。所述微生物菌劑的制備方法為：將解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)按比例接種于發(fā)酵基質(zhì)中，在溫度為24℃的條件下，進行固體發(fā)酵96h，得到的發(fā)酵物即為微生物菌劑。經(jīng)測定，上述發(fā)酵液中解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的活菌數(shù)可以達到3.2×1010cfu/ml。實施例3解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)微生物菌劑的制備本實施例所述的微生物菌劑的生物活性組份和重量百分比含量包括：解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)10%（2菌株1：1比例）和發(fā)酵基質(zhì)余量。所述發(fā)酵基質(zhì)的組份和含量包括：草炭、有機肥、骨粉混合作為發(fā)酵基質(zhì)，占比分別為45%、45%、10%，含水量30-50%。所述微生物菌劑的制備方法為：將解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)按比例接種于發(fā)酵基質(zhì)中，在溫度為28℃，進行液體發(fā)酵144h，得到的發(fā)酵物即為微生物菌劑。經(jīng)測定，上述發(fā)酵液中解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的活菌數(shù)可以達到6.6×1012cfu/ml。實施例4解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)微生物菌劑的制備本實施例所述的微生物菌劑的生物活性組份和重量百分比含量包括：解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)15%（2菌株1：1比例）和發(fā)酵基質(zhì)余量。所述發(fā)酵基質(zhì)的組份和含量包括：草炭、有機肥、骨粉混合作為發(fā)酵基質(zhì)，占比分別為45%、45%、10%，含水量30-50%。微生物菌劑的制備方法為：將解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)按比例接種于發(fā)酵基質(zhì)中，在溫度為32℃條件下，進行液體發(fā)酵192h，得到的發(fā)酵液即為微生物菌劑。經(jīng)測定，上述發(fā)酵液中解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的活菌數(shù)可以達到4.51×1012cfu/ml。實施例5解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)的室內(nèi)抑菌活性和田間防治效果試驗一：解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)室內(nèi)抑菌活性測定。首次篩選出解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)拮抗菌株，將該拮抗菌株接種于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；同時，將指示菌株根腐病菌（fusariumsolani）接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（即pda）培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。當拮抗菌株和指示菌株在各自的培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化后，分別用打孔器打成直徑為6mm的菌餅。選取指示菌株的菌餅一塊，置于pda培養(yǎng)基中；具體的，可以將該菌餅接種于盛裝pda培養(yǎng)基的平皿的中央位置（平皿直徑9cm）；再選取由拮抗菌株得到的菌餅四塊，根據(jù)對峙法，將該四塊菌餅等距接種于距該平皿中央位置為2.5cm的圓周上。將該培養(yǎng)皿在28℃的環(huán)境溫度下培養(yǎng)5天后，用十字法多次重復測定該pda培養(yǎng)基中上述菌株的抑菌圈直徑，在本試驗中，重復測定3次。解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)，單獨抑菌率分別為72.2%和73%，但1：1復配后抑菌率為82%。試驗二：解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株和死谷芽孢桿菌(b.vallismortis)菌株對馬鈴薯增產(chǎn)、對干腐病的防治效果測定。于2015年5月~8月進行，地點為甘肅省白銀市景泰條山農(nóng)場。種植模式為壟寬與行距分別為1.35m和0.70m，株間距0.17m，種植密度為5605株/667m2。播種前一天對種薯進行1.5%高錳酸鉀浸泡消毒并切塊。4月下旬播種，播種時施基肥，過程中再無追肥，8月下旬收獲。試驗分處理和對照，約135m2，處理和對照間留一壟為保護行。2015年6月27日，用穴施的方法將發(fā)酵的微生物菌肥埋入馬鈴薯根際土壤，肥穴距根際15cm，每穴施肥5g。于2015年8月17日進行馬鈴薯采收，用隨機取樣方法采收面積為20m2的馬鈴薯，稱重，計算產(chǎn)量，并對采收的馬鈴薯儲藏于室內(nèi)，4個月后對馬鈴薯干腐病發(fā)病薯塊進行統(tǒng)計，并計算發(fā)病薯塊占總貯藏薯塊百分率。表1對馬鈴薯的促生作用菌肥ck折合畝產(chǎn)yieldpermu(kg)1135.5892.4增產(chǎn)率yeildincrease(%)27.2表1表明，菌肥對馬鈴薯的增產(chǎn)率達27.2%。對儲藏馬鈴薯干腐病的統(tǒng)計表明功舥處理的發(fā)病率10.4%，空白對照發(fā)病率為35%，防效為70.3%，效果良好。表2對馬鈴薯干腐病防效兩種菌（f2）ck干腐發(fā)病率(%)10.4%35%最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12