本領(lǐng)域?qū)儆谖⑸锛鞍l(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株發(fā)酵生產(chǎn)(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙偶姻(acetoin)，又名3-羥基-2-丁酮(3-hydroxybutanone)，是一種重要的天然香料，在白酒、蜂蜜、草莓、黃油等物質(zhì)中都存在。由于手性碳原子的存在，乙偶姻具有兩種立體異構(gòu)體，(3r)-乙偶姻和(3s)-乙偶姻。單一的乙偶姻異構(gòu)體在不對(duì)稱合成領(lǐng)域具有廣泛用途，可作為藥物合成的中間體，也可用于合成具有光學(xué)活性的α-羥基酮類衍生物。

乙偶姻的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。根據(jù)國標(biāo)的規(guī)定，化學(xué)法合成得到的乙偶姻為合成香料，微生物發(fā)酵法獲得的乙偶姻屬于天然香料，二者的市場(chǎng)價(jià)格存在巨大差距。而且，化學(xué)合成的乙偶姻為外消旋混合物，而微生物發(fā)酵法可以獲得以某一異構(gòu)體為主的產(chǎn)物，所以近年來微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻的研究頗受關(guān)注。

自然界可產(chǎn)乙偶姻的微生物很多，其中產(chǎn)量較高且生物安全的菌種主要有芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌?？偹苤?，天然菌株具有遺傳性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，工業(yè)上用的菌種大部分都是天然菌種或是自然突變篩選得到的菌種。因此，近年來發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻的研究主要集中于天然菌株的篩選及其改造，目標(biāo)以提高乙偶姻總產(chǎn)量為主，而單一構(gòu)型乙偶姻的生產(chǎn)研究較少。以葡萄糖為碳源，利用生物安全的天然菌株或基因工程改造菌株發(fā)酵乙偶姻時(shí)高產(chǎn)菌株的乙偶姻產(chǎn)量通常在70g/l以上。例如，b.amyloliquefaciense-11發(fā)酵可產(chǎn)71.5g/l乙偶姻，生產(chǎn)強(qiáng)度1.63g/(l·h)(processbiochem.2014,49：1223–1230)；2,3-丁二醇脫氫酶過表達(dá)的b.subtilisjna3-10發(fā)酵可產(chǎn)73.6g/l乙偶姻，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.77g/(l·h)(plosone2014,9(3):e91187)。但是所述菌株生產(chǎn)的乙偶姻為兩種構(gòu)型的混合物，目前還沒有能夠發(fā)酵生產(chǎn)高純度、高含量單一構(gòu)型乙偶姻的天然菌株。

在單一構(gòu)型乙偶姻的生產(chǎn)方面，已有一些基因改造菌或人工構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵的相關(guān)專利，例如cn101565685b、cn102296094b、cn103388009b。這些菌生產(chǎn)的單一構(gòu)型的乙偶姻濃度不高，普遍低于40g/l。2015年xu等發(fā)文報(bào)道了一株人工構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌，將來自serratiamarcescens的budrab基因和lactobacillusbrevis的nadh氧化酶基因?qū)氪竽c桿菌，(3r)-乙偶姻的最高濃度為60.3g/l，立體異構(gòu)體純度為97.3％(j.chem.technol.biotechnol.2015,90:93–100)，但這些菌株均為基因工程菌，存在遺傳性不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。

綜上所述，目前缺少產(chǎn)單一構(gòu)型乙偶姻的天然菌株，獲得產(chǎn)高濃度、高立體異構(gòu)體純度的乙偶姻的天然生物安全菌株對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一株高產(chǎn)(3r)-乙偶姻的天然菌株。

本發(fā)明提供一株高產(chǎn)(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11，已于2016年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，菌株dl11-11的保藏號(hào)為cgmccno.13141。

本發(fā)明以來自大連海域的海泥為土樣，從中篩選到一株產(chǎn)(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌，再經(jīng)乙偶姻馴化，最終得到一株高產(chǎn)(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11，利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)高純度(3r)-乙偶姻，發(fā)酵液中(3r)-乙偶姻純度高達(dá)96.5％，(3r)-乙偶姻生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.1g/(l·h)，乙偶姻總濃度最高可達(dá)78.7g/l。

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11具有下述性質(zhì)：

1、菌落形態(tài)學(xué)特征：在lb營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h出現(xiàn)直徑為1.5～2.5mm的菌落，菌落呈圓形、光滑、透明；繼續(xù)培養(yǎng)至48h，菌落直徑增加至6～8mm，表面透明、光滑，邊緣不整齊；繼續(xù)培養(yǎng)，菌落逐漸變呈白色，表面變得粗糙、干燥，中央凸起有褶皺。

2、生理與生化特性：a.革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢，好氧；b.耐較高濃度的葡萄糖和氯化鈉；c.培養(yǎng)溫度：25～39℃，最適溫度為37℃；d.可在ph5.5～7.2范圍內(nèi)生長(zhǎng)。

3、菌種16srdna鑒定：經(jīng)過對(duì)該菌的16srdna序列的測(cè)定，通過與ncbi數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果顯示與已知芽孢桿菌屬的同源性大于99％，結(jié)合生理生化特性鑒定該菌為枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明還提供利用所述的枯草芽孢桿菌dl11-11發(fā)酵生產(chǎn)(3r)-乙偶姻的方法，其具體的步驟為：將菌株接種于種子培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12～20h，然后接種于含碳源、氮源和無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)(3r)-乙偶姻。其中，所述種子培養(yǎng)基含有20～40g/l葡萄糖、0.5～1.5g/l酵母粉、2～6g/l(nh4)2hpo4、2～8g/lk2hpo4、0.05～0.2g/lmgso4。發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖或糖蜜，其濃度為100～180g/l，優(yōu)選120～140g/l；氮源包括有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，其中的有機(jī)氮源為玉米漿干粉、酵母粉、蛋白胨中的一種或幾種，其濃度為1～5g/l，優(yōu)選1.5～3g/l，無機(jī)氮源為硫酸銨、磷酸氫二銨、尿素中的一種或幾種，濃度為3～15g/l，優(yōu)選5～10g/l；無機(jī)鹽為磷酸鹽和硫酸鹽中任意一種或幾種，其中磷酸鹽的濃度為1～10g/l,優(yōu)選2～8g/l；硫酸鹽的濃度為0.05～5g/l，優(yōu)選0.2～1g/l。

在上述利用菌株dl11-11發(fā)酵生產(chǎn)(3r)-乙偶姻的方法中，所述的發(fā)酵生產(chǎn)條件為：菌株種子培養(yǎng)液的接種量5～20％(v/v)，優(yōu)選10～15％(v/v)；發(fā)酵初始ph為5.5～7.2，優(yōu)選6.5～7.0；通氣量0.15～0.35vvm，優(yōu)選0.2～0.3vvm；發(fā)酵溫度30～39℃，優(yōu)選35～38℃；培養(yǎng)時(shí)間55～80h，優(yōu)選58～72h。

本發(fā)明的有益效果：

1)本發(fā)明的菌株dl11-11為枯草芽孢桿菌，屬于生物安全菌種，該菌從海泥中篩選得到，屬于天然菌株，具有遺傳穩(wěn)定性高、不易丟失的優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)化應(yīng)用。

2)本發(fā)明篩選到的菌株dl11-11生產(chǎn)(3r)-乙偶姻時(shí)發(fā)酵液中(3r)-乙偶姻的立體異構(gòu)體純度達(dá)96.5％，(3r)-乙偶姻濃度達(dá)到63.8g/l，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.1g/(l·h)，目前還沒有如此高立體異構(gòu)體純度、產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的產(chǎn)(3r)-乙偶姻的天然生物安全菌株。

3)本發(fā)明篩選到的菌株dl11-11也可用于生產(chǎn)乙偶姻，其濃度高于已知的天然菌株。

4)本發(fā)明篩選到的菌株dl11-11在發(fā)酵過程中所需的通氣量為0.15～0.35vvm，遠(yuǎn)低于常規(guī)枯草芽孢桿菌1.0vvm左右的通氣量，降低了設(shè)備需求，有利于工業(yè)化。

附圖說明

圖1為利用菌株dl11-11發(fā)酵生產(chǎn)(3r)-乙偶姻58小時(shí)時(shí)發(fā)酵液的氣相色譜圖。按照出峰先后順序，圖中的5個(gè)峰依次為：溶劑、內(nèi)標(biāo)、(3r)-乙偶姻(10.156min)、meso-2,3-丁二醇(11.278min)、(3s)-乙偶姻(12.421min)。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從化學(xué)或生物試劑公司購買。

以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

以下實(shí)施例中使用的分析方法如下：

乙偶姻采用agilent7890agc分析，gc條件為：氫火焰檢測(cè)器220℃，進(jìn)樣口溫度210℃，載氣n2，程序升溫。色譜柱：bgb-174,30m×0.25mmi.d.0.25μmdf(p/n:27430-025)。發(fā)酵液中葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀(sba-50，山東省科學(xué)院生物研究所)分析。

以下實(shí)施例中采用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基如下：

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40g/l；酵母粉1.5g/l；(nh4)2hpo46g/l；k2hpo48g/l；mgso40.2g/l；微量元素溶液3ml(feso40.4g/l；mncl2·4h2o5g/l；znso4·7h200.1g/l；h3bo30.8g/l；cuso4·5h2o0.04g/l；namoo4·2h2o0.04g/l；cocl2·6h2o0.06g/l；cacl20.75g/l)；ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖120g/l；酵母粉1.5g/l；(nh4)2hpo49g/l；k2hpo48g/l；mgso40.2g/l；微量元素溶液3ml(組成同種子培養(yǎng)基)；ph7.0。

種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基均在115℃高壓滅菌鍋中滅菌15min，且葡萄糖與無機(jī)鹽分開滅菌。

實(shí)施例1菌株的篩選

從遼寧省大連市黑石礁、星海公園、金石灘等地區(qū)采集海泥樣品。將上述樣品分別加入到無菌水中，快速攪拌并自然沉降10min，然后取上清液接入上述種子培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，37℃、200rpm搖瓶培養(yǎng)72h。對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布到添加瓊脂的上述種子培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)24h。挑取單菌落，分別接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃搖瓶培養(yǎng)48h，氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物，得到一株產(chǎn)(3r)-乙偶姻的菌株。該菌株用含10g/l乙偶姻的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行馴化，37℃、200rpm搖瓶培養(yǎng)24h，然后梯度稀釋涂布到添加瓊脂的上述種子培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)24h。挑取單菌落，分別接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，其中高產(chǎn)的菌株經(jīng)多次劃線分離純化得到純的菌株，命名為dl11-11。采用斜面?zhèn)鞔ā⒌蜏馗视头ǖ瘸Ｒ?guī)方法保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2菌株的鑒定

將實(shí)施例1得到的菌株dl11-11生理生化檢驗(yàn)結(jié)果如下：

1、菌落形態(tài)學(xué)特征：在lb營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h出現(xiàn)直徑為1.5～2.5mm的菌落，菌落呈圓形、光滑、透明；繼續(xù)培養(yǎng)至48h，菌落直徑增加至6～8mm，表面透明、光滑，邊緣不整齊；繼續(xù)培養(yǎng)，菌落逐漸變呈白色，表面變得粗糙、干燥，中央凸起有褶皺。

2、生理與生化特性：a.革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢，好氧；b.耐較高濃度的葡萄糖和氯化鈉；c.培養(yǎng)溫度：25～39℃，最適溫度為37℃；d.可在ph5.5～7.2范圍內(nèi)生長(zhǎng)。

3、菌種16srdna鑒定：經(jīng)過對(duì)該菌的16srdna序列的測(cè)定，通過與ncbi數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果顯示與已知芽孢桿菌屬的同源性大于99％，結(jié)合生理生化特性鑒定該菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmcc-no.13141。

實(shí)施例3利用菌株dl11-11發(fā)酵生產(chǎn)(3r)-乙偶姻

將保存于20％甘油的菌株dl11-11菌液按2.5％接種于lb培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。將活化菌種按2％接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。將200ml液體種子接種于含1.8l發(fā)酵培養(yǎng)基的5l機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中進(jìn)行批式補(bǔ)料發(fā)酵，溫度37℃，轉(zhuǎn)速250rpm，通氣0.2vvm，ph自動(dòng)降至ph5.9后維持恒定，在34小時(shí)補(bǔ)葡萄糖200g，58h發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液含2,3-丁二醇8.6g/l，(3r)-乙偶姻63.8g/l，(3s)-乙偶姻2.3g/l，(3r)-乙偶姻的立體異構(gòu)體純度為96.5％(氣相色譜圖見圖1)，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.1g/(l·h)。

實(shí)施例4利用菌株dl11-11發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻

將保存于20％甘油的菌株dl11-11菌液按2.5％接種于lb培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。將活化菌種按2％接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)12h。將200ml液體種子接種于含1.8l發(fā)酵培養(yǎng)基的5l機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中進(jìn)行批式補(bǔ)料發(fā)酵，溫度37℃，轉(zhuǎn)速250rpm，通氣0.2vvm，ph自動(dòng)降至ph5.9后維持恒定，在34h、58h分別補(bǔ)加葡萄糖200g和108g，72h發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液含2,3-丁二醇12.4g/l，(3r)-乙偶姻為70.9g/l，乙偶姻總濃度為78.7g/l，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.09g/(l·h)。