本發(fā)明涉及微生物肥料領(lǐng)域，尤其涉及一種利迪鏈霉菌菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，隨著化肥、農(nóng)藥的大量施用及作物復(fù)種指數(shù)的提高，我國(guó)土壤板結(jié)、酸化、次生鹽漬化、有機(jī)質(zhì)減少、地力下降等現(xiàn)象日益加劇，植物病害越顯嚴(yán)重，其病蟲害耐藥、抗藥性程度亦日益增強(qiáng)，從而形成不多施肥、施藥就減產(chǎn)的惡性循環(huán)。植物病害的發(fā)生主要源于三大類，分別為細(xì)菌、真菌、病毒，其中由真菌引起的病害約占植物病害的70～80％，每年因真菌病害導(dǎo)致的玉米、小麥、水稻、馬鈴薯和黃豆減產(chǎn)達(dá)1.25億噸。目前，植物真菌病害的防治多以化學(xué)農(nóng)藥為主，雖見(jiàn)效快，但作用時(shí)間短，污染環(huán)境，且病害易產(chǎn)生抗藥性，不利于我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的安全保障，有必要研發(fā)新型環(huán)保的藥物進(jìn)行防治。
我實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選分離得到一株利迪鏈霉菌(streptomyceslydicus)cgmccno.13106，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵液具有廣譜的抗真菌作用，可用于制備防治植物真菌病害的生物制劑。目前，市場(chǎng)上或?qū)＠絮r見(jiàn)利用利迪鏈霉菌制成的生物菌劑。為彌補(bǔ)此類菌劑市場(chǎng)空缺，開(kāi)發(fā)出利迪鏈霉菌潛在的市場(chǎng)價(jià)值，本發(fā)明利用草炭為吸附載體，添加利迪鏈霉菌為生物功能菌，制備成生物菌劑，且該生物菌劑已在甜瓜枯萎病害實(shí)驗(yàn)上表現(xiàn)出較好的防治效果。。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種利迪鏈霉菌菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種利迪鏈霉菌菌劑，包括質(zhì)量份的原料：草炭75～85份、礦物質(zhì)5～10份，以草炭和礦物質(zhì)的質(zhì)量總量計(jì)，該利迪鏈霉菌菌劑還包括80～150ml/kg的利迪鏈霉菌發(fā)酵液，所述利迪鏈霉菌的保藏號(hào)為：cgmccno.13106，于2016年10月12日保藏至北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)。
進(jìn)一步的，所述利迪鏈霉菌發(fā)酵液含有效活菌數(shù)大于或等于4.5×109/ml。
進(jìn)一步的，所述礦物質(zhì)為沸石粉、蛭石粉、硅藻土、白炭黑、輕質(zhì)碳酸鈣中的一種或幾種。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利迪鏈霉菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：
(1)制備利迪鏈霉菌發(fā)酵液；
(2)稱量：按照質(zhì)量百分比稱量以下組分：草炭75～85份、礦物質(zhì)5～10份，以草炭和礦物質(zhì)的質(zhì)量總量計(jì)，該利迪鏈霉菌菌劑還包括80～150ml/kg的利迪鏈霉菌發(fā)酵液。
(3)將稱量好的草炭、利迪鏈霉菌發(fā)酵液倒入混拌機(jī)里進(jìn)行吸附、混勻，逐步加入礦物質(zhì)，攪拌均勻后將物料進(jìn)行粉碎，過(guò)100目篩，調(diào)整物料水分含量少于30％，ph為6.5～7.5，即得利迪鏈霉菌菌劑。
進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述利迪鏈霉菌發(fā)酵液制備步驟為：
(1)將保存在-4℃環(huán)境下的利迪鏈霉菌菌株接種至高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上38℃培養(yǎng)72h，挑取單菌落接種至高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，38℃培養(yǎng)72h后得到所需接種液；
(2)將接種液接種于裝有種子培養(yǎng)基的30l種子罐中，接菌量為8～10％，接菌后進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)24h后即得種子培養(yǎng)液，初始ph值為7.2～7.7，溫度為35～40℃，轉(zhuǎn)速為180～220r/min。
(3)將種子培養(yǎng)液按8～10％接種量加入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的300l發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵，控制條件同種子罐，培養(yǎng)104～120小時(shí)，即得利迪鏈霉菌發(fā)酵液。
進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉20g、硝酸鉀1g、磷酸氫二鉀0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸鎂0.5g和硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4。
進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述種子培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉10.0g、葡萄糖20.0g、豆粕粉20.0g、蛋白胨5.0g、mgso4·7h2o1.0g、kh2po40.2g、nacl4.0g和caco310.0g，ph7.0～7.4。
進(jìn)一步的，步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米粉39.08g、豆餅粉39.19g、磷酸氫二鉀0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸鎂0.5g和硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4。
本發(fā)明還提供利迪鏈霉菌菌劑在植物真菌病害防治中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：
1)本發(fā)明添加了利迪鏈霉菌，該菌對(duì)人畜無(wú)毒害，可調(diào)節(jié)作物微生物生態(tài)區(qū)系，改善作物品質(zhì)，且對(duì)植物枯萎病害表現(xiàn)出較強(qiáng)的防治效果。
2)目前，市場(chǎng)上或?qū)＠絮r見(jiàn)利用利迪鏈霉菌制成的生物菌劑，本發(fā)明開(kāi)發(fā)的利迪鏈霉菌菌劑可彌補(bǔ)此類菌劑市場(chǎng)空缺，開(kāi)發(fā)出利迪鏈霉菌潛在的市場(chǎng)價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例一
配方：利迪鏈霉菌發(fā)酵液80l、草炭850kg、沸石粉70kg。
制備方法：準(zhǔn)確稱取草炭、利迪鏈霉菌發(fā)酵液倒入混拌機(jī)里進(jìn)行吸附、混勻，逐步加入礦物質(zhì)，攪拌均勻后將物料進(jìn)行粉碎，過(guò)100目篩，調(diào)整物料水分含量為26.8％，ph為6.9，即得利迪鏈霉菌菌劑。
利迪鏈霉菌的保藏號(hào)為：cgmccno.13106，于2016年10月12日保藏至北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)。
利迪鏈霉菌發(fā)酵液是通過(guò)以下方法制備得到的：
(1)將保存在-4℃環(huán)境下的利迪鏈霉菌菌株接種至高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上38℃培養(yǎng)72h。挑取單菌落接種至高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，38℃培養(yǎng)72h后的液體即為所需接種液。所述高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基為可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4；
(2)將步驟(1)中的接種液接種于裝有種子培養(yǎng)基的30l種子罐中，接菌量為8％，接菌后進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)24h后即得種子培養(yǎng)液。初始ph值為7.2，溫度為35℃，轉(zhuǎn)速為180r/min。所述種子培養(yǎng)基為可溶性淀粉10.0g，葡萄糖20.0g，豆粕粉20.0g，蛋白胨5.0g，mgso4·7h2o1.0g，kh2po40.2g，nacl4.0g，caco310.0g，ph7.0～7.4；
(3)將種子培養(yǎng)液按8％接種量加入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的300l發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵，控制條件同種子罐，培養(yǎng)104小時(shí)，即得利迪鏈霉菌發(fā)酵液，此時(shí)有效活菌數(shù)為6.8×109/ml。所述發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉39.08g，豆餅粉39.19g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4。
各培養(yǎng)基滅菌條件為：0.1～0.15mpa，121℃滅菌30分鐘；
實(shí)施例二：
配方：利迪鏈霉菌發(fā)酵液110l、草炭840kg、硅藻土50kg。
制備方法：準(zhǔn)確稱取草炭、利迪鏈霉菌發(fā)酵液倒入混拌機(jī)里進(jìn)行吸附、混勻，逐步加入礦物質(zhì)，攪拌均勻后將物料進(jìn)行粉碎，過(guò)100目篩，調(diào)整物料水分含量為25.6％，ph為6.5，即得利迪鏈霉菌菌劑。
利迪鏈霉菌發(fā)酵液是通過(guò)以下方法制備得到的：
(1)將保存在-4℃環(huán)境下的利迪鏈霉菌菌株接種至高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上38℃培養(yǎng)72h。挑取單菌落接種至高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，38℃培養(yǎng)72h后的液體即為所需接種液。高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基為可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4；
(2)將步驟(1)中的接種液接種于裝有種子培養(yǎng)基的30l種子罐中，接菌量為10％，接菌后進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)24h后即得種子培養(yǎng)液。初始ph值為7.7，溫度為40℃，轉(zhuǎn)速為220r/min。所述種子培養(yǎng)基為可溶性淀粉10.0g，葡萄糖20.0g，豆粕粉20.0g，蛋白胨5.0g，mgso4·7h2o1.0g，kh2po40.2g，nacl4.0g，caco310.0g，ph7.0～7.4；
(3)將種子培養(yǎng)液按10％接種量加入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的300l發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵，控制條件同種子罐，培養(yǎng)120小時(shí)，即得利迪鏈霉菌發(fā)酵液，此時(shí)有效活菌數(shù)為5.9×109/ml。所述發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉39.08g，豆餅粉39.19g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4。
各培養(yǎng)基滅菌條件為：0.1～0.15mpa，121℃滅菌30分鐘；
實(shí)施例三：
配方：利迪鏈霉菌發(fā)酵液150l、草炭750kg、蛭石粉100kg。
制備方法：準(zhǔn)確稱取草炭、利迪鏈霉菌發(fā)酵液倒入混拌機(jī)里進(jìn)行吸附、混勻，逐步加入礦物質(zhì)，攪拌均勻后將物料進(jìn)行粉碎，過(guò)100目篩，調(diào)整物料水分含量為27.1％，ph為7.5，即得利迪鏈霉菌菌劑。
利迪鏈霉菌發(fā)酵液是通過(guò)以下方法制備得到的：
(1)將保存在-4℃環(huán)境下的利迪鏈霉菌菌株接種至高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上38℃培養(yǎng)72h。挑取單菌落接種至高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，38℃培養(yǎng)72h后的液體即為所需接種液。所述高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基為可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4；
(2)將步驟(1)中的接種液接種于裝有種子培養(yǎng)基的30l種子罐中，接菌量為9％，接菌后進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)24h后即得種子培養(yǎng)液。初始ph值為7.5，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200r/min。所述種子培養(yǎng)基為可溶性淀粉10.0g，葡萄糖20.0g，豆粕粉20.0g，蛋白胨5.0g，mgso4·7h2o1.0g，kh2po40.2g，nacl4.0g，caco310.0g，ph7.0～7.4；
(3)將種子培養(yǎng)液按9％接種量加入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的300l發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵，控制條件同種子罐，培養(yǎng)112小時(shí)，即得利迪鏈霉菌發(fā)酵液，此時(shí)有效活菌數(shù)為6.5×109/ml。所述發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉39.08g，豆餅粉39.19g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，ph7.2～7.4。
各培養(yǎng)基滅菌條件為：0.1～0.15mpa，121℃滅菌30分鐘。
下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)方案對(duì)本發(fā)明的技術(shù)效果進(jìn)行說(shuō)明：
選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3葉甜瓜幼苗移栽到盆缽中，移栽7天后，對(duì)甜瓜苗進(jìn)行接菌處理。處理1：先接種枯萎病病原菌，隔1天再分別施入實(shí)施例1、2、3中制備的菌劑，標(biāo)記為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3；處理2：先分別施入實(shí)施例1、2、3中制備的菌劑，隔1天再接種枯萎病病原菌，標(biāo)記為實(shí)施例ⅰ、實(shí)施例ⅱ、實(shí)施例ⅲ；對(duì)照處理：只接種枯萎病病原菌，標(biāo)記為ck。每個(gè)處理20盆，每盆1株甜瓜苗。病原菌接種量均為107cfu/ml孢子懸浮液10ml，利迪鏈霉菌菌劑施用量菌為1g/盆。接菌7天之后，記錄甜瓜發(fā)病情況，計(jì)算其發(fā)病情況、病情指數(shù)及相對(duì)防治效果，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。
甜瓜枯萎病發(fā)病情況按標(biāo)準(zhǔn)劃分為5級(jí)：0級(jí)：全株無(wú)??；1級(jí)：植株1/4以下葉面表現(xiàn)萎蔫癥狀；2級(jí)：植株1/4到1/2葉面表現(xiàn)萎蔫癥狀；3級(jí)：植株1/2以上葉面表現(xiàn)萎蔫癥狀：4級(jí)：全株萎蔫死亡。
病情指數(shù)＝[σ(病級(jí)株數(shù)×病害級(jí)數(shù))/(該處理盆栽苗總和×發(fā)病最重級(jí)的代表數(shù)值)]×100。
相對(duì)防治效果＝[(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100％。
表1本發(fā)明每盆甜瓜枯萎病發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)
表2本發(fā)明利迪鏈霉菌菌劑對(duì)甜瓜枯萎病的防治效果
以上結(jié)果表明，先施入利迪鏈霉菌菌劑后接病原菌處理的甜瓜病情指數(shù)要小于先接病原菌后施入菌劑的處理，說(shuō)明在一定程度上利迪鏈霉菌菌劑對(duì)甜瓜枯萎病的發(fā)生有一定的預(yù)防作用。另外，不管是先病原菌之前或是之后施入菌劑，均高于對(duì)照防治效果?？梢?jiàn)，本發(fā)明的利迪鏈霉菌菌劑對(duì)甜瓜枯萎病有一定的預(yù)防及防治效果。
本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(yǔ)(包括技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ))具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語(yǔ)應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會(huì)用理想化或過(guò)于正式的含義來(lái)解釋。
最后所應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。