本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，涉及一種乳桿菌，具體涉及一種具有抗氧化功能的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101，同時，本發(fā)明還涉及該乳桿菌的篩選方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前我國規(guī)定可用于食品的益生菌僅有雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、嗜熱鏈球菌。開菲爾發(fā)酵乳具有眾多的益生功能，開菲爾粒含多種生理性有益菌，黏附定植于腸道中與病原菌競爭黏附位點、營養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)物乳酸、醋酸降低腸道ph值；產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)過氧化氫、細(xì)菌素等。作為開菲爾發(fā)酵乳中的微生物成份，高加索酸奶乳桿菌具有很好的作為益生菌的潛力，由于具有益生功能的開菲爾發(fā)酵乳由于其生產(chǎn)步驟繁瑣、易導(dǎo)致污染且生產(chǎn)批次間差異較大。因此開發(fā)一株具有良好益生特性的菌株有著非常重要的現(xiàn)實意義。研究表明，氧化反應(yīng)是人體衰老機能衰退的一大誘因，因此開發(fā)一款具有能夠抗氧化能力的益生菌是具有重要意義的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株高加索酸奶乳桿菌jmcc0101，該菌株是從我國云南大理傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選而來，是一株具有很好的耐酸耐膽鹽特性、抗氧化能力、良好的存活性能、弱后酸和發(fā)酵風(fēng)味的菌株。
本發(fā)明的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101，已于2015年12月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：cgmccno.11772，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
本發(fā)明的另一個目的是提供高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的篩選方法，依次通過樣品的采集、富集、分離、純化、鑒定、保存等實驗，最終篩選出高加索酸奶乳桿菌jmcc0101。
本發(fā)明還有一個目的是提供了高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的應(yīng)用，高加索酸奶乳桿菌jmcc0101應(yīng)用于制備益生菌菌粉或乳酸菌飲料。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
一種高加索酸奶乳桿菌(lactobacilluskefiri)jmcc0101，它是從我國云南大理傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出來的益生菌，該菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：cgmccno.11772。
進(jìn)一步的，其16srrna的基因序列如下：
ccatctcctgatcaccttagacggctggtccccgaaggttacctcaccggctttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtggcatgctgatccacgattactagcgattccaacttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactgagaacggctttaagagattagcttgacctcgcggtttcgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttgctagagtgcccaactgaatgctggcaactaacaataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattctgtccccgaagggaacgcctaatctcttaggttggcagaagatgtcaagaccctggtaagggttcttcgcgtagcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgatctccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtctcctggtttccgatgcacttctccggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcaagatgtcaacagttactctgacacctgttcttctccaacaacagagttttacgagccgaaacccttcatcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtgggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccttggtaggccattaccttaccaacaagctaatacgccgcgggtccatcctaaagtgatagccgaagccatcttttaaaccaaaaccatgtggttttggttgttatacggtattagcacctgtttccaagtgttatcccctacttcaagggcaggttacccacgtgttactcaccagttcgccactcgtttcgtgttaaatcatttaaatgcaagcatctaaaatcaataacggaaacgcgttcgacttgcatgtatagcacgccgcacagtca。
進(jìn)一步的，其phes的基因序列如下：
caaacctcaccaatgcaggctcgtactttggaaaagcatgatttctcaaagggacctttgaagatgatctcaccaggaatcgtttaccgtcgtgatactgatgatccaacccattcacatcaattccatcaggttgaaggactctttattgatgagcacgtgacaatggctgatttaaagggaactttgattaccatggctcaaaacatttttggcaataaatttgatattcgtttacgaccaagttatttcccatttaccgaaccttctgttgaagtggatgttacctgctttaactgtatgggaaagggttgtgacgtctgcaaacataccggctggattgaagtcttaggtgccggcatggttcatcctaatgtgctcgatatggctggcgttgattcaaagaagtatggcg。
本發(fā)明的所述的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的篩選方法，按以下步驟順序進(jìn)行：
①樣品采集
取25ml云南大理傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品，加入到250ml生理鹽水中，充分混勻，得到樣品；
②樣品的富集
取樣品2ml，加入到100ml的lc液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)72h，得到培養(yǎng)液；
③菌株的分離、純化；
a、菌株分離
取培養(yǎng)液1ml，用0.9％(重量與體積的百分比)無菌的生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌懸液；
取mrs瓊脂培養(yǎng)基，融化后，倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻、完全凝固后，吸取0.1ml菌懸液涂布到培養(yǎng)基上；
置35℃環(huán)境下厭氧培養(yǎng)72h(h2：co2：n2＝5：10：85)，觀察菌落生長情況；
待平板出現(xiàn)典型菌落后，挑選出相應(yīng)的菌落，進(jìn)行下一步的菌株純化；
b、菌株的純化
挑取選中的單菌落，將菌落培養(yǎng)物劃線接種到mrs瓊脂培養(yǎng)基上，35℃有氧環(huán)境培養(yǎng)72h；然后，再將培養(yǎng)皿上長出的單菌落，繼續(xù)劃線接種到mrs瓊脂培養(yǎng)基上，35℃有氧環(huán)境培養(yǎng)72h；連續(xù)培養(yǎng)三次；
④菌株的鑒定
將上述菌株進(jìn)行革蘭氏染色、顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、桿狀菌株，然后通過dna提取、pcr擴增，16srrna基因序列，phes基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析，鑒定結(jié)果為高加索酸奶乳桿菌；
⑤菌株的保存
將菌落培養(yǎng)物置于無菌的20％甘油中在-70℃保存，同時接種mrs瓊脂培養(yǎng)基試管斜面用于臨時保存。
進(jìn)一步的，步驟②中l(wèi)c液體培養(yǎng)基由以下成分組成：
蛋白胨：10g，酵母膏：1g，牛肉膏：4g，k2hpo4：2g，乙酸鈉：3g，檸檬酸銨：1g，mgso4·7h2o：0.2g，mnso4·7h2o：0.05g，干酪素酸性水解物：1g，吐溫-80：1g，蒸餾水：1000ml；
該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)ph6.0±0.1。
進(jìn)一步的，步驟③中mrs瓊脂培養(yǎng)基由以下成分組成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸鈉：5g；檸檬酸二胺：2g；吐溫-80：1g；k2hpo4：2g；mgso4·7h2o：0.2g；mnso4·7h2o：0.05g；瓊脂：15g；蒸餾水：1000ml；
該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)ph6.8±0.1。
本發(fā)明采用的菌株具有很好的抗氧化作用，因此具有很好的抗衰老的作用。
所述高加索酸奶乳桿菌jmcc0101應(yīng)用于制備益生菌菌粉或乳酸菌飲料。
進(jìn)一步的，上述的益生菌菌粉由以下重量百分含量的原料制成：
高加索酸奶乳桿菌jmcc01012％-4％，植物乳桿菌2％-4％、嗜酸乳桿菌0.5％-1.5％、乳雙歧桿菌0.5％-1.5％、干酪乳桿菌1％-2％，低聚果糖70％-90％、草莓提取物9％-11％。
進(jìn)一步的，上述的乳酸菌飲料由以下重量份數(shù)的原料制成：
純牛奶40-60份，水20-40份，蔗糖3-6份，105-107cfu/ml的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101，105-107cfu/mlcfu/ml的副干酪乳桿菌，105-107cfu/mlcfu/ml的嗜熱鏈球菌。
具體實施方式
實施例1高加索酸奶乳桿菌jmcc0101及其篩選方法
一種高加索酸奶乳桿菌(lactobacilluskefiri)jmcc0101，它是從我國云南大理傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出來的益生菌，該菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：cgmccno.11772。
所述的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的篩選方法，按以下步驟順序進(jìn)行：
①樣品采集
取25ml云南大理傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品，加入到250ml生理鹽水中，充分混勻，得到樣品；
②樣品的富集
取樣品2ml，加入到100ml的lc液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)72h，得到培養(yǎng)液；
③菌株的分離、純化；
a、菌株分離
取培養(yǎng)液1ml，用0.9％(重量與體積的百分比)無菌的生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌懸液；
取mrs瓊脂培養(yǎng)基，融化后，倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻、完全凝固后，吸取0.1ml菌懸液涂布到培養(yǎng)基上；
置35℃環(huán)境下厭氧培養(yǎng)72h(h2：co2：n2＝5：10：85)，觀察菌落生長情況；
待平板出現(xiàn)典型菌落后，挑選出相應(yīng)的菌落，進(jìn)行下一步的菌株純化；
b、菌株的純化
挑取選中的單菌落，將菌落培養(yǎng)物劃線接種到mrs瓊脂培養(yǎng)基上，35℃有氧環(huán)境培養(yǎng)72h；然后，再將培養(yǎng)皿上長出的單菌落，繼續(xù)劃線接種到mrs瓊脂培養(yǎng)基上，35℃有氧環(huán)境培養(yǎng)72h；連續(xù)培養(yǎng)三次；
④菌株的鑒定
將上述菌株進(jìn)行革蘭氏染色、顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、桿狀菌株，然后通過dna提取、pcr擴增，16srrna基因序列，phes基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析，鑒定結(jié)果為高加索酸奶乳桿菌；
其16srrna的基因序列如下：
ccatctcctgatcaccttagacggctggtccccgaaggttacctcaccggctttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtggcatgctgatccacgattactagcgattccaacttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactgagaacggctttaagagattagcttgacctcgcggtttcgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttgctagagtgcccaactgaatgctggcaactaacaataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattctgtccccgaagggaacgcctaatctcttaggttggcagaagatgtcaagaccctggtaagggttcttcgcgtagcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgatctccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtctcctggtttccgatgcacttctccggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcaagatgtcaacagttactctgacacctgttcttctccaacaacagagttttacgagccgaaacccttcatcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtgggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccttggtaggccattaccttaccaacaagctaatacgccgcgggtccatcctaaagtgatagccgaagccatcttttaaaccaaaaccatgtggttttggttgttatacggtattagcacctgtttccaagtgttatcccctacttcaagggcaggttacccacgtgttactcaccagttcgccactcgtttcgtgttaaatcatttaaatgcaagcatctaaaatcaataacggaaacgcgttcgacttgcatgtatagcacgccgcacagtca。
其phes的基因序列如下：
caaacctcaccaatgcaggctcgtactttggaaaagcatgatttctcaaagggacctttgaagatgatctcaccaggaatcgtttaccgtcgtgatactgatgatccaacccattcacatcaattccatcaggttgaaggactctttattgatgagcacgtgacaatggctgatttaaagggaactttgattaccatggctcaaaacatttttggcaataaatttgatattcgtttacgaccaagttatttcccatttaccgaaccttctgttgaagtggatgttacctgctttaactgtatgggaaagggttgtgacgtctgcaaacataccggctggattgaagtcttaggtgccggcatggttcatcctaatgtgctcgatatggctggcgttgattcaaagaagtatggcg。
⑤菌株的保存
將菌落培養(yǎng)物置于無菌的20％甘油中在-70℃保存，同時接種mrs瓊脂培養(yǎng)基試管斜面用于臨時保存。
所述的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的篩選方法，步驟②中l(wèi)c液體培養(yǎng)基由以下成分組成：
蛋白胨：10g，酵母膏：1g，牛肉膏：4g，k2hpo4：2g，乙酸鈉：3g，檸檬酸銨：1g，mgso4·7h2o：0.2g，mnso4·7h2o：0.05g，干酪素酸性水解物：1g，吐溫-80：1g，蒸餾水：1000ml；
該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)ph6.0±0.1。
所述的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的篩選方法，步驟③中mrs瓊脂培養(yǎng)基由以下成分組成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸鈉：5g；檸檬酸二胺：2g；吐溫-80：1g；k2hpo4：2g；mgso4·7h2o：0.2g；mnso4·7h2o：0.05g；瓊脂：15g；蒸餾水：1000ml；
該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)ph6.8±0.1。
本發(fā)明高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的生物學(xué)特性如下：
1、細(xì)胞形態(tài)和理化實驗結(jié)果
高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的細(xì)胞形態(tài)和理化實驗結(jié)果如下表1所示：
表1jmcc0101的細(xì)胞形態(tài)和理化實驗結(jié)果
由表1可知，高加索酸奶乳桿菌jmcc0101為革蘭氏染色陽性、桿狀、接觸酶和氧化酶實驗陰性的菌株。碳水化合物產(chǎn)酸特性中，“+”表示發(fā)酵利用，“－”表示不發(fā)酵利用。
2、抗生素敏感實驗結(jié)果
表2jmcc0101的抗生素敏感實驗結(jié)果
測定了高加索酸奶乳桿菌jmcc0101對30種抗生素的敏感性，由表2可知，該菌種對測試的27種抗生素敏感。
3、耐酸耐膽鹽特性實驗
將高加索酸奶乳桿菌jmcc0101和本實驗室保存的其他乳桿菌(kd18，kd33，kl01，ku15，kl07，kl24，kl22，kl03)分別挑取1接種環(huán)純化菌株接種到mrs培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，取出計數(shù)；同時，各取1ml該培養(yǎng)基，分別加入到ph為2.5的磷酸鹽緩沖液和3‰含牛膽鹽的mrs培養(yǎng)溶液中37℃孵育，于0h、3h進(jìn)行菌數(shù)的測定，并計算其存活率。
表3耐酸耐膽鹽特性實驗數(shù)據(jù)
4、活菌數(shù)測試和后酸測試
將高加索酸奶乳桿菌jmcc0101、ku15、kl22三株菌在mrs液體培養(yǎng)基活化后3％接種量至脫脂奶中放置于37℃，每周測試活菌數(shù)、酸度。最終，在四周的測試中，jmcc0101和ku15活菌數(shù)始終保持在1×107cfu/ml以上同時酸度均在60t°以內(nèi)。
表4活菌數(shù)數(shù)據(jù)
表5酸度數(shù)據(jù)
5、發(fā)酵風(fēng)味實驗
a)使用10％脫脂奶，不加糖的情況下，jmcc0101、ku15、kl22三株菌以2％的接種量分別與基礎(chǔ)發(fā)酵劑1213(丹尼斯克公司提供，添加量為0.07g/kg)混合發(fā)酵5小時，同時設(shè)置只有基礎(chǔ)菌的對照組，ph達(dá)到4.4左右停止發(fā)酵攪拌后4℃放置，24小時后選則專業(yè)的感官評鑒人員品嘗進(jìn)行排序和描述。結(jié)果口味由好到壞依次為jmcc0101＝kl22＞ku15＞空白。
b)純牛奶加如7％的糖為基料進(jìn)行重復(fù)a試驗，為使3株乳桿菌風(fēng)味散發(fā)采用長時間發(fā)酵的基礎(chǔ)發(fā)酵劑1209(丹尼斯克公司提供，添加量0.07g/kg)，發(fā)酵20小時后，攪拌放于4℃，24小時后品評。結(jié)果口味由好到壞依次為jmcc0101>ku15>kl22>空白。
6、抗氧化能力實驗
活化菌株，在mrs液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)傳代3次后，接種于mrs液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，收集菌液于4000rpm，4℃離心10min，收集菌體，生理鹽水洗滌1次。用生理鹽水將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×108cfu/ml，備用；
a)羥自由基清除能力檢測(fenton法)
在10ml試管中依次加入1ml5mmol/l水楊酸-乙醇溶液，1ml5mmol/l硫酸亞鐵，1ml3mmol/l過氧化氫和不同菌液混合均勻。用雙蒸水補足10ml，37℃水浴15min，于4℃、6000rpm離心10min，取上清液在510nm處測定吸光度(以雙蒸水為參比)。
ho·清除率(％)＝[(ao-as)/ao]×100％
ao為無樣品的od值；as為有樣品的od值。
b)超氧陰離子清除能力檢測(鄰苯酚自氧化法)
在不同菌液樣品中加入4.5mltris-hcl(ph8.2150mmol/l)，25℃水浴20min，加入0.4ml1.2mmol/l鄰苯三酚，25℃水浴5min，立即加入2滴8mol/lhcl終止反應(yīng)。取上清液在325nm處測定吸光度(以雙蒸水為參比)。
o2—清除率(％)＝[1-(ao/as)]×100％
ao為無樣品的od值；as為有樣品的od值。
c)dpph清除能力檢測
在不同菌液樣品中加入1ml0.2mmol/ldpph·無水乙醇溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30min，并在6000rpm離心10min，取上清液在517nm處測定吸光度(以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液為參比)?？瞻捉M以等體積無水乙醇代替dpph溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液。
清除率＝[1-(as-aj)/ao]×100％
ao為對照品的od值；as為有樣品的od值；aj為空白組的od值。
表6抗氧化性能測試數(shù)據(jù)
實施例2含高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的益生菌菌粉的制備
原料組成：高加索酸奶乳桿菌jmcc01013％，植物乳桿菌3％、嗜酸乳桿菌1％、乳雙歧桿菌1％、干酪乳桿菌2％，低聚果糖80％、草莓提取物10％；該益生菌菌粉制備工藝為：按配方比例稱取菌粉、低聚果糖、草莓提取物進(jìn)行混合，在真空分裝機上進(jìn)行分裝，2g/袋，貼標(biāo)入庫，冷藏保存。
制備得到的益生菌粉具有抗氧化功能且產(chǎn)品中活性乳酸菌總數(shù)≥4×1010cfu/袋。
實施例3含高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的乳酸菌飲料的制備
將純牛奶50份，水30份，蔗糖5份混合均勻于110℃下滅菌15min制備培養(yǎng)基液；
將106cfu/ml的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101、106cfu/ml的副干酪乳桿菌和106cfu/ml的嗜熱鏈球菌接入培養(yǎng)基液中混勻，37℃發(fā)酵至ph至4.2-4.6，終止發(fā)酵，冷卻灌裝，冷藏保存。
制備得到的含高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的乳酸菌飲料具有抗氧化功能。
sequencelisting
<110>石家莊君樂寶乳液有限公司
<120>具有抗氧化功能的高加索酸奶乳桿菌jmcc0101、其篩選方法及應(yīng)用
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<213>高加索酸奶乳桿菌jmcc0101的16srrna基因序列
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