本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種菌株，具體涉及一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卷煙的生產(chǎn)從種植到出品有著非常復(fù)雜的工藝，一般來(lái)說(shuō)要經(jīng)過(guò)五大工序，其中包括煙葉初烤；打葉復(fù)烤；煙葉陳化；卷煙配方；卷煙制絲。其中煙葉復(fù)烤后的陳化是個(gè)相當(dāng)重要的環(huán)節(jié)，其對(duì)煙葉的品質(zhì)有很大的影響。復(fù)烤后或者是經(jīng)過(guò)陳化一年以下的煙葉，稱為新煙。新煙有較重的青雜氣、刺激性，純凈度較低，煙氣也相對(duì)粗糙不舒適，香味未能顯露等。低等級(jí)新煙葉更加會(huì)出現(xiàn)苦、辣、澀等缺點(diǎn)。因此，一般不直接用新煙進(jìn)行卷煙加工和制造。陳化后的煙葉顏色變深、青色減少，雜氣和刺激都有所減弱，香味得到顯現(xiàn)，達(dá)到了煙葉生產(chǎn)的工業(yè)要求。這一過(guò)程就是葉陳化，是提高煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵途徑。

西柏三烯二醇主要來(lái)源于成熟的新鮮煙葉的表面分泌物，其中以(1s,2e,4s,6r,7e,11e)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（α–cbd）以及(1s,2e,4r,6r,7e,11e)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（β–cbd）含量較高。西柏三烯-4,6-二醇是煙草中重要的致香前體物，其降解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物茄酮、降茄二酮、茄尼呋喃等多種重要中性香味成分能與煙香協(xié)調(diào)，醇和煙氣，增加煙草本香。因此，在煙草調(diào)制、陳化及加工過(guò)程中如何有效利用西柏三烯-4,6-二醇降解轉(zhuǎn)化產(chǎn)生煙草香味成分，充分挖掘煙草自身潛質(zhì)，對(duì)于提高煙葉品質(zhì)及使用價(jià)值、增加卷煙香氣、凸現(xiàn)卷煙風(fēng)格特征和提高卷煙的安全性具有重要價(jià)值。

關(guān)于西柏三烯-4,6-二醇類化合物的降解一般認(rèn)為有兩種起始模式，一種是在光或氧化劑作用下進(jìn)行，另一種是在酶催化作用下。經(jīng)過(guò)一系列的轉(zhuǎn)化，西柏三烯-4,6-二醇類物質(zhì)可以轉(zhuǎn)化為c8～c18不同碳原子數(shù)的香味成分。利用cro3在硫酸水溶液中和丙酮水溶液氧化西柏三烯-4,6-二醇，得到主要產(chǎn)物為包括降茄二酮在內(nèi)的八種產(chǎn)物。光催化西柏三烯-4,6-二醇后容易發(fā)生在11,12-號(hào)位雙鍵的環(huán)氧化。生物催化降解西柏三烯二醇方面：雷公藤(tripterygiumwilfordii)的植物細(xì)胞催化降解西柏三烯-4,6-二醇后發(fā)11,12-位雙鍵容易被環(huán)氧化，同時(shí)10-、12-和13-號(hào)位的羥基化也被發(fā)現(xiàn)。利用美花煙草(nicotianasylvestris)的植物細(xì)胞、細(xì)胞均質(zhì)體、無(wú)細(xì)胞提取物和細(xì)胞小球分別作為催化劑降解西柏三烯-4,6-二醇后，其產(chǎn)物和雷公藤的降解產(chǎn)物相似。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決西柏三烯-4,6-二醇降解的技術(shù)難題，提供了一株新鞘氨醇桿菌及其作為降解西柏三烯-4,6-二醇的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)難題，采用以下技術(shù)方案：

一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇桿菌（novosphingobiumpanipatense），所述新鞘氨醇桿菌已于2016年12月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，其cgmccno：13436。

所述新鞘氨醇桿菌大小為0.6～0.8μm×1.5～1.9μm，呈細(xì)桿狀，無(wú)鞭毛，在lb平板上為黃色圓斑狀。

降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇桿菌的培養(yǎng)方法，步驟如下：將新鞘氨醇桿菌菌液按1%的接種量，接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為ph5～9，溫度28～35℃，轉(zhuǎn)速120~170rpm，培養(yǎng)72h即可。

所述培養(yǎng)基配方為：k2hpo41g/l，mgso4?7h2o0.5g/l，feso4?7h2o0.005g/l，nacl0.5g/l，kh2po40.65g/l，mnso40.001g/l，(nh4)2?so40.5g/l，cacl2?2h2o0.1g/l，na2moo4?2h2o0.005g/l，西柏三烯-4,6-二醇0.3g/l。

一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇桿菌作為降解西柏三烯-4,6-二醇的應(yīng)用。

所述新鞘氨醇桿菌降解西柏三烯-4,6-二醇的降解率為70.58%。

本發(fā)明的有益效果在于：在煙葉的陳化期間，一個(gè)重要的作用是將西柏三烯-4,6-二醇類物質(zhì)降解成香味物質(zhì)，從而增加煙葉香味。新鞘氨醇桿菌可以在72h內(nèi)將70.58%的西柏三烯-4,6-二醇降解，說(shuō)明未來(lái)該菌可用于煙葉的發(fā)酵。

附圖說(shuō)明

圖1為菌源的平板涂布圖。

圖2為菌種的純化平板圖。

圖3為菌種的顯微鏡照片。

圖4為新鞘氨醇桿菌對(duì)西柏三烯-4,6-二醇的降解曲線圖。

具體實(shí)施方式

一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇桿菌（novosphingobiumpanipatense），所述新鞘氨醇桿菌已于2016年12月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，其cgmccno：13436。

所述新鞘氨醇桿菌大小為0.6～0.8μm×1.5～1.9μm，呈細(xì)桿狀，無(wú)鞭毛，在lb平板上為黃色圓斑狀。

降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇桿菌的培養(yǎng)方法，步驟如下：將新鞘氨醇桿菌菌液按1%的接種量，接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為ph5～9，溫度28～35℃，轉(zhuǎn)速120~170rpm，培養(yǎng)72h即可。

所述培養(yǎng)基配方為：k2hpo41g/l，mgso4?7h2o0.5g/l，feso4?7h2o0.005g/l，nacl0.5g/l，kh2po40.65g/l，mnso40.001g/l，(nh4)2?so40.5g/l，cacl2?2h2o0.1g/l，na2moo4?2h2o0.005g/l，西柏三烯-4,6-二醇0.3g/l。

一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇桿菌作為降解西柏三烯-4,6-二醇的應(yīng)用。

所述新鞘氨醇桿菌降解西柏三烯-4,6-二醇的降解率為70.58%。

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

缺碳富西柏三烯-4,6-二醇培養(yǎng)基的配方：

k2hpo41g/l，mgso4?7h2o0.5g/l，feso4?7h2o0.005g/l，nacl0.5g/l，kh2po40.65g/l，mnso40.001g/l，(nh4)2?so40.5g/l，cacl2?2h2o0.1g/l，na2moo4?2h2o0.005g/l，在此培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加0.3g/l西柏三烯-4,6-二醇。

細(xì)菌lb培養(yǎng)基的公開配方：

10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，蒸餾水1l，ph至7.0。

一、西柏三烯-4,6-二醇降解菌的篩選

稱取新鮮成熟煙葉10g，剪碎煙葉，放入250ml三角瓶中，加入100ml無(wú)菌水浸泡過(guò)夜，移取200μl加到20ml的lb培養(yǎng)基內(nèi)，30℃、轉(zhuǎn)速150r/min條件下培養(yǎng)兩天，得到菌源。

移取1ml經(jīng)富集培養(yǎng)得到的菌源到100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不加菌源的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)7d，通過(guò)gc-ms檢測(cè)，與空白對(duì)照的gc-ms檢測(cè)圖進(jìn)行對(duì)比。挑選出能降解西柏三稀-4,6-二醇的菌源，再?gòu)闹幸迫?ml依次進(jìn)行梯度稀釋，選擇10^-2，10^-4這兩個(gè)濃度梯度在缺碳富西柏三烯-4,6-二醇培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布如圖1所示。將涂布好的平板于培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)2-4d，挑選出形態(tài)較好的菌落反復(fù)劃線分離純化，直到平板上無(wú)雜菌落出現(xiàn)，再經(jīng)顯微鏡鏡檢如圖2、顯微鏡照片如圖3所示，即可確認(rèn)為純培養(yǎng)。

二、種子液的制備

將保存在斜面中的新鞘氨醇桿菌(novosphingobiumpanipatensey3-1)接種到30ml的lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h后備用。

三、西柏三烯-4,6-二醇的細(xì)菌降解特性

將新鞘氨醇桿菌種子液按1%的接種量，接種到含有0.3g/l西柏三烯-4,6-二醇的細(xì)菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72h，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速，150rpm。同時(shí)做空白對(duì)照。每6h取樣一次每次取樣30ml，利用gc-ms測(cè)定發(fā)酵液中西柏三烯-4,6-二醇的含量。

經(jīng)過(guò)72h培養(yǎng)后，原300mg/l的培養(yǎng)基中的西柏三烯-4,6-二醇的殘留濃度為90mg/l，對(duì)照為300mg/l。

四、樣品測(cè)定前的準(zhǔn)備

取10ml發(fā)酵液，在12000r/min條件下對(duì)其進(jìn)行離心30min，取上清液與等體積的ch2cl2，在分液漏斗中進(jìn)行萃取，緩緩搖晃，使兩相混合均勻，靜置10min后，收集下層有機(jī)相，重復(fù)以上步驟5次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去ch2cl2后，加入1ml色譜純ch2cl2溶解，過(guò)0.45μm有機(jī)系濾膜后，上gc-ms分析檢測(cè)。

降解菌的理化試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移西柏三烯-4,6-二醇的殘留量逐漸降低，在30%以內(nèi)處達(dá)到穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果證明西柏三烯-4,6-二醇的降解率為74.58％。