本發(fā)明涉及硫氫化鈉的新用途，確切地說(shuō)是硫氫化鈉在促進(jìn)大腸桿菌外源蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

iptg誘導(dǎo)大腸桿菌外源基因表達(dá)是分子生物學(xué)和基因工程結(jié)合的經(jīng)典方法，為促進(jìn)分子生物學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的幫助。大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物純化過(guò)程簡(jiǎn)單、產(chǎn)物穩(wěn)定性好、不易污染以及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種重組蛋白表達(dá)。目前，人們已經(jīng)利用大腸桿菌表達(dá)了多種蛋白產(chǎn)品，如抗生素、激素、免疫制劑、抗腫瘤藥物、蛋白酶制劑等。

盡管大腸桿菌蛋白表達(dá)體系優(yōu)點(diǎn)眾多，但由于基因結(jié)構(gòu)、mrna穩(wěn)定性和翻譯效率、蛋白質(zhì)折疊等差異，以及宿主細(xì)胞蛋白酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的降解等原因，并非每一種蛋白質(zhì)都能被有效表達(dá)。因此，促進(jìn)外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中有效表達(dá)的方法具有重要意義。

硫氫化鈉溶于水會(huì)釋放硫化氫，硫化氫作為氣體信號(hào)分子，在動(dòng)物體內(nèi)具有抑制細(xì)胞增殖、降低血壓、調(diào)節(jié)血管及神經(jīng)系統(tǒng)等功能；在植物體中，硫化氫可以調(diào)節(jié)植物氣孔運(yùn)動(dòng)、緩解氧化傷害、提高植物對(duì)干旱、低溫、重金屬等脅迫的耐受。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供硫氫化鈉在促進(jìn)大腸桿菌外源蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用，提高外源蛋白質(zhì)的含量。

本發(fā)明提供硫氫化鈉在促進(jìn)大腸桿菌外源蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用。以分別含有外源gfp，rfp基因的大腸桿菌bl21菌株為實(shí)驗(yàn)材料，在iptg誘導(dǎo)gfp，rfp外源基因表達(dá)的體系中，加入一定濃度的硫氫化鈉可以促進(jìn)外源基因表達(dá)。

所述硫氫化鈉濃度為10mmol/l，現(xiàn)配現(xiàn)用。誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)外源基因時(shí)，將配置的硫氫化鈉水溶液與iptg同時(shí)加入到大腸桿菌培養(yǎng)液lb中，硫氫化鈉在lb培養(yǎng)液中的終濃度分別為5μmol/l、10μmol/l、15μmol/l。優(yōu)選濃度為10μmol/l

試驗(yàn)結(jié)果表明本處理方法可以促進(jìn)外源gfp，rfp基因的表達(dá)，gfp和rfp蛋白質(zhì)含量升高。

附圖說(shuō)明

圖1是0、5μmol·l^-1、10μmol·l^-1和15μmol·l^-1終濃度的硫氫化鈉對(duì)三種iptg濃度誘導(dǎo)下(0.1mmol·l^-1，0.5mmol·l^-1，1mmol·l^-1)，大腸桿菌表達(dá)gfp蛋白的情況，a是利用酶標(biāo)儀檢測(cè)gfp的熒光值；b結(jié)果示意圖。

圖2是0、5μmol·l^-1、10μmol·l^-1和15μmol·l^-1終濃度的硫氫化鈉對(duì)三種iptg濃度誘導(dǎo)下(0.1mmol·l^-1，0.5mmol·l^-1，1mmol·l^-1)，大腸桿菌表達(dá)rfp蛋白的情況，a是利用酶標(biāo)儀檢測(cè)rfp的熒光值；b結(jié)果示意圖。

圖3是三種濃度的iptg誘導(dǎo)大腸桿菌bl21菌株表達(dá)gfp/rfp蛋白時(shí)，5μmol·l^-1、10μmol·l^-1和15μmol·l^-1終濃度的硫氫化鈉相對(duì)于不加硫氫化鈉誘導(dǎo)時(shí)，促進(jìn)gfp/rfp蛋白表達(dá)的百分比。

圖4是三種濃度的iptg誘導(dǎo)大腸桿菌bl21菌株表達(dá)gfp/rfp蛋白時(shí)，0、5μmol·l^-1、10μmol·l^-1和15μmol·l^-1終濃度的硫氫化鈉處理后，大腸桿菌bl21菌株表達(dá)gfp/rfp蛋白的sds-page電泳檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

以下給出本發(fā)明的非限定實(shí)施例。

誘導(dǎo)bl21菌株表達(dá)gfp/rfp的培養(yǎng)與處理?xiàng)l件

配制150ml的lb液體培養(yǎng)基，分裝在3個(gè)100ml的錐形瓶中，每瓶50ml，高壓蒸汽滅菌鍋滅。(lb培養(yǎng)基配方：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，用1l去離子水溶解)。

分別將外源表達(dá)gfp/rfp的大腸桿菌bl21菌種轉(zhuǎn)接到50mllb液體培養(yǎng)基，于37℃搖床培養(yǎng)，至od600＝0.6～0.8。在超凈臺(tái)分別將培養(yǎng)好的大腸桿菌分裝至2ml的ep管中，每管1.5ml菌液，分別加入不同濃度的iptg和nahs，其中不加iptg的為ck，其余nahs和iptg的濃度如下：

將ep管放入搖床(16℃，轉(zhuǎn)速160rpm)，14小時(shí)后離心集菌，去上清。收集的菌體在液氮和60℃水浴反復(fù)凍融5次，分別加入200μlpbs緩沖液(50mmol/l，ph7.0)，震蕩混勻后離心，取150μl上清液加入酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀檢測(cè)gfp或rfp的熒光值。

酶標(biāo)儀檢測(cè)gfp表達(dá)，結(jié)果如圖1，ck為不加iptg和nahs；ga、gb、gc分別表示iptg誘導(dǎo)gfp表達(dá)的工作濃度為0.1mmol/l、0.5mmol/l、1mmol/l；0/1/2/3表示nahs的終濃度分別為0、5μmol·l^-1、10μmol·l^-1和15μmol·l^-1。

酶標(biāo)儀檢測(cè)rfp表達(dá)，結(jié)果如圖2，ck為不加iptg和nahs；ra、rb、rc分別表示iptg誘導(dǎo)rfp表達(dá)的工作濃度為0.1mmol/l、0.5mmol/l、1mmol/l；0/1/2/3表示nahs的終濃度分別為0、5μmol·l^-1、10μmol·l^-1和15μmol·l^-1。

根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算nahs促進(jìn)gfp/rfp表達(dá)的百分比，gfp計(jì)算公式為(gn-g0)/g0·100％，gn表示不同濃度的iptg和nahs處理組合；rfp計(jì)算公式為(rn-g0)/r0·100％，rn表示不同濃度的iptg和nahs處理組合。結(jié)果見(jiàn)圖3，nahs促進(jìn)iptg誘導(dǎo)gfp/rfp表達(dá)。

nahs處理不同濃度iptg誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)gfp/rfp，大腸桿菌總蛋白的sds-page檢測(cè)結(jié)果如圖4，nahs促進(jìn)iptg誘導(dǎo)gfp/rfp表達(dá)，各樣品的總蛋白上樣量相等。

由以上結(jié)果可知，本發(fā)明能夠明顯促進(jìn)iptg誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的效率。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了硫氫化鈉在促進(jìn)大腸桿菌外源蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用。將硫氫化鈉配制成5～15μmol/L硫氫化鈉水溶液，加入到IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌外源蛋白質(zhì)表達(dá)的體系中，可促進(jìn)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)。

技術(shù)研發(fā)人員：劉志強(qiáng);裴雁曦
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山西大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.01.24
技術(shù)公布日：2017.08.18