促進(jìn)血管生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)及其用途
【專利摘要】一種用于刺激一哺乳動(dòng)物的一組織中的血管生成的方法，包括以一與丙酮酸激酶M2型同工酶(PKM2)實(shí)質(zhì)相似的蛋白質(zhì)接觸所述組織。
【專利說(shuō)明】促進(jìn)血管生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)及其用途 先前相關(guān)申請(qǐng)資料 本申請(qǐng)對(duì)在2012年3月15日提交的美國(guó)61/611，555號(hào)臨時(shí)專利申請(qǐng) (U.S. Provisional Patent Application Serial No. 61/611，555)提出優(yōu)先權(quán)要求，而且據(jù) 此通過(guò)引用將所述每一美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)全部并入本專利。 關(guān)于美國(guó)聯(lián)邦資助的研究或發(fā)展的聲明 本發(fā)明是在美國(guó)政府支持下由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)根據(jù)"CA118113號(hào)協(xié)議"（Agreement CA118113)作出的。美國(guó)政府擁有所述發(fā)明 的某些權(quán)利。 背景 本揭示涉及多種促進(jìn)血管生成的方法，包括使無(wú)血管位點(diǎn)血管化，或擴(kuò)展或加強(qiáng)現(xiàn)有 血管系統(tǒng)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0001] 詳細(xì)說(shuō)明詳細(xì)地提及附圖，其中：
[0002] 圖IA顯示，與以對(duì)照藥物處理的細(xì)胞相比，以一種丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2) 處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC cells)的內(nèi)皮血管生成增加，而且有更多的支化點(diǎn)及更 長(zhǎng)的血管。
[0003] 圖IB顯示，與以對(duì)照藥物處理的細(xì)胞相比，以一種丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2) 處理的內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成實(shí)驗(yàn)中其支化點(diǎn)增加。
[0004] 圖2顯示，與以對(duì)照藥物處理的創(chuàng)口相比，以一種丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2) 處理的創(chuàng)口區(qū)域更有效地縮小，而且其肉芽形成更早。
[0005] 圖3A顯示，與以對(duì)照藥物處理的創(chuàng)口相比，以一種丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2) 蛋白質(zhì)處理的創(chuàng)口更有效地縮小。
[0006] 圖3B顯示（從創(chuàng)口內(nèi)部），與以對(duì)照藥物處理的創(chuàng)口相比，以一種丙酮酸激酶M2 型同工酶（PKM2)蛋白質(zhì)處理的創(chuàng)口更有效地縮小。
[0007] 圖4顯示，與以對(duì)照藥物處理的創(chuàng)口相比，以一種丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2) 蛋白質(zhì)處理的創(chuàng)口的血管生成增加。
[0008] 圖5A顯示提取的基質(zhì)膠蝕斑的一代表性圖片。
[0009] 圖5B顯示帶有丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)凝膠及重組丙酮酸激酶Ml型同工 酶（rPKMl)凝膠的基質(zhì)膠蝕斑中的血紅蛋白含量。
[0010] 圖6顯示，與那些以對(duì)照藥物處理的創(chuàng)口相比，以丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2) 蛋白質(zhì)處理的創(chuàng)口的愈合百分比明顯更高。
[0011] 定義
[0012] 提供以下定義的目的，是為了方便理解本說(shuō)明書中所使用的某些術(shù)語(yǔ)。
[0013] "氨基酸"一詞指的是天然存在氨基酸及非天然氨基酸，以及以相似于天然存在氨 基酸的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物及氨基酸模擬物。天然編碼氨基酸是20種常見的氨 基酸（丙胺酸、精氨酸、天冬酰胺酸、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、氨基乙酸、 組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨 酸、酪氨酸及纈氨酸）、焦賴氨酸以及硒代半胱氨酸。氨基酸類似物一詞指的是基本化學(xué)結(jié) 構(gòu)與天然存在氨基酸相同的化合物，例如其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為一 α -碳原子與一個(gè)氫原子、 一個(gè)羧基、一個(gè)氨基及一個(gè)R基鍵合。這樣的類似物可能帶有修飾R基（例如正亮氨酸） 或可能帶有修飾肽骨架，還保留與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸類似物的 非限制性例子包括高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍等等。
[0014] 本文中所用的"有效量"一詞指的是正在施用的、將在某種程度上減輕正在治療或 處理的疾病或狀況的癥狀的一藥劑或化合物的足夠用量。藥劑或化合物的施用結(jié)果可能是 疾病的征候、癥狀或病因減輕及/或緩和，或生物系統(tǒng)發(fā)生任何其他預(yù)期的變化。例如，正 在施用的一藥劑或化合物包括但不限于天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、修飾的天然 氨基酸多肽或修飾的非天然氨基酸多肽。
[0015] 含有這樣的天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、修飾的天然氨基酸多肽或修飾 的非天然氨基酸多肽的組合物可以施用來(lái)進(jìn)行預(yù)防性治療、加強(qiáng)及/或藥物性治療。
[0016] 在任何個(gè)別情況下，可以使用例如劑量遞增研究的方法來(lái)確定一適當(dāng)?shù)?有效" 量。
[0017] 本文中所用的"核酸序列"一詞指的是包含一個(gè)核酸分子的多種核苷酸的排列順 序及同一性。
[0018] 除非另作說(shuō)明，一特定核酸序列也含蓄地包括保守性修飾變體（例如退化密碼子 替換體）及互補(bǔ)序列，以及明確指示的序列。明確地說(shuō)，可以通過(guò)產(chǎn)生其一個(gè)或多個(gè)選定 (或全部）密碼子的第三位置以混合基的殘基及/或脫氧肌苷殘基來(lái)替換的序列，來(lái)獲得退 化密碼子替換體。"核酸"一詞可與基因、互補(bǔ)脫氧核糖核酸（CDNA)、信使核糖核酸（mRNA)、 寡核苷酸及多核苷酸互換地使用。
[0019] 在本文中可互換地使用的"多肽"、"肽"及"蛋白質(zhì)"等詞指的是由多個(gè)氨基酸殘 基組成的聚合物。這些詞適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是一對(duì)應(yīng)天然存在氨基酸的人 工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及適用于天然氨基酸聚合物及非天然氨基酸的聚合物。
[0020] 本文中使用的"在藥學(xué)上可接受的"一詞指的是不消除化合物的生物活性或性質(zhì) 而且相對(duì)無(wú)毒性的材料，包括但不限于鹽、載體或稀釋劑，即所述材料可以在不會(huì)造成不良 生物效應(yīng)或不會(huì)以有害方式與組合物中含有的任何成分相互作用的情況下施用于人體。
[0021] 本文中使用的"有效預(yù)防量"一詞指的是預(yù)防性地施用于一病人的、將在某種程度 上減輕其正在治療的疾病、狀況或紊亂的一個(gè)或多個(gè)癥狀的、含有至少一種非天然氨基酸 多肽或至少一種修飾非天然氨基酸多肽的組合物的有效量。在這樣的預(yù)防性應(yīng)用中，這樣 的有效量可能取決于病人的健康狀況、體重等因素。具有本領(lǐng)域的技能的人員當(dāng)能通過(guò)常 規(guī)實(shí)驗(yàn)（包括但不限于劑量遞增臨床試驗(yàn)）來(lái)確定這樣的有效預(yù)防量。
[0022] 在兩種核酸或多肽的語(yǔ)境下，本文中使用的"實(shí)質(zhì)相似"一詞指的是在為最大對(duì)應(yīng) 進(jìn)行比對(duì)及對(duì)齊而使用一序列比對(duì)算法（例如以下描述的那些序列比對(duì)算法）測(cè)量或通過(guò) 目視檢查時(shí)，兩個(gè)或多個(gè)具有至少75%、或至少85%、或至少90%、95%或更高的或它們之 間的任何整數(shù)值的核苷酸或氨基酸殘基同一'丨生的序列或子序列。一實(shí)質(zhì)同一'丨生在所述這些 序列的一個(gè)長(zhǎng)度為至少大約10個(gè)殘基、或至少大約20個(gè)殘基、或至少大約40-60個(gè)殘基或 這些殘基數(shù)量之間的任何整數(shù)量的殘基的長(zhǎng)度的區(qū)域存在，優(yōu)選在一個(gè)長(zhǎng)度大于60-80個(gè) 殘基的區(qū)域存在，更優(yōu)選在一個(gè)長(zhǎng)度為至少大約90-100個(gè)殘基的區(qū)域存在，最優(yōu)選這些序 列正被比對(duì)的序列的全長(zhǎng)的區(qū)域（例如核苷酸序列的編碼區(qū)）范圍實(shí)質(zhì)全同。
[0023] 本文中使用的"有效治療量"一詞指的是施用于一已患有疾病、狀況或紊亂的病人 的、足以治愈或至少部分地抑制或在某種程度上減輕其正在治療的疾病、狀況或紊亂的一 個(gè)或多個(gè)癥狀的、含有至少一種非天然氨基酸多肽及/或至少一種修飾非天然氨基酸多肽 的組合物的有效量。這樣的組合物的有效性取決于多種條件，包括但不限于所述疾病、狀況 或紊亂的嚴(yán)重性及病因、先前的治療、病人的健康狀況及對(duì)藥物的反應(yīng)以及主治醫(yī)生的判 斷。例如，有效治療量可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)（包括但不限于劑量遞增臨床試驗(yàn)）來(lái)確定。丙 酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)蛋白質(zhì)或其變體的有效治療量將包括可以促進(jìn)血管生成的一 個(gè)量。
[0024] 本文中使用的"受治療者" 一詞包括哺乳動(dòng)物或人類。
[0025] "有效量"一詞的意思包括（特別是在施用于一動(dòng)物受治療者或人類受治療者時(shí)） 足以帶來(lái)預(yù)期治療效果的丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)或其變體的任何量。
[0026] 本文中使用的"劑量"一詞指的是施用于一動(dòng)物受治療者或人類受治療者的丙酮 酸激酶M2型同工酶（PKM2)或其變體的量。用于本發(fā)明的方法中的合適劑量單位介于"mg/ kg受體體重"與"mg/kg"之間。治療藥劑可以通過(guò)推注或緩釋（連續(xù)釋放或間歇釋放）釋 放到受體。

【具體實(shí)施方式】 [0027]
[0028] 丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)或與丙酮酸激酶實(shí)質(zhì)相似的蛋白質(zhì)的血管生成 活性及/或內(nèi)皮細(xì)胞增生性或徙動(dòng)電位，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)及方法學(xué)進(jìn)行評(píng)定。所述丙酮酸激 酶蛋白質(zhì)可以是任何脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的丙酮酸激酶，而且可以是天然丙酮酸激酶或重 組蛋白質(zhì)或其他合成蛋白質(zhì)。人丙酮酸激酶的氨基酸序列（例如）是由"基因銀行編號(hào) MP0011193727 丙酮酸激酶"（GenBank Accession No. MP0011193727 pyruvate kinase)提 供的。丙酮酸激酶的氨基酸序列同一性（例如）在不同物種之間高度保持，人類與小鼠、倉(cāng) 鼠及大鼠之間有98%的氨基酸序列同一性。本文揭示人丙酮酸激酶的氨基酸序列。在一個(gè) 特定具體實(shí)施例中，具血管生成活性的丙酮酸激酶蛋白質(zhì)為二聚物，即M2子類型。范圍廣 泛的與丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)實(shí)質(zhì)相似的蛋白質(zhì)對(duì)多個(gè)特定具體實(shí)施例有用。
[0029] 其天然丙酮酸激酶蛋白質(zhì)被提純的動(dòng)物（例如）可以是?？苿?dòng)物、綿羊、豬科動(dòng) 物、馬科動(dòng)物、犬科動(dòng)、貓科動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒科動(dòng)物或其他哺乳動(dòng)物家族。至少在一 些形式中，所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)將是通過(guò)細(xì)菌生產(chǎn)提純的人丙酮酸激酶蛋白質(zhì)。
[0030] 重組丙酮酸激酶蛋白質(zhì)可能具有與天然丙酮酸激酶蛋白質(zhì)全同的氨基酸序列，或 重組丙酮酸激酶蛋白質(zhì)與所述天然蛋白質(zhì)相比，可能有一個(gè)或多個(gè)氨基酸差異。所述氨基 酸變化可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、刪除及/或替換。也包括氨基酸的倒位及其他 導(dǎo)致天然丙酮酸激酶蛋白質(zhì)序列的修飾的突變。此外，重組蛋白質(zhì)可以包含未由基因密碼 編碼的一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸。
[0031] 氨基酸的替換可以是保守性替換或非保守性替換。"保守性氨基酸替換"一詞應(yīng)在 一般認(rèn)可意義上被視為以具有相似特性的、實(shí)質(zhì)上不會(huì)負(fù)面影響所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)的 血管生成及/或創(chuàng)口愈合活性的一個(gè)氨基酸來(lái)替換另一個(gè)氨基酸。例如，保守性氨基酸替 換可能涉及以一基本氨基酸（比如賴氨酸）替換另一基本氨基酸。同樣地，例如可以以絲 氨酸替換一個(gè)半胱氨酸殘基，或可以以一非極性氨基酸（比如丙氨酸）替換另一非極性氨 基酸?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)所述序列與密切相關(guān)的多種丙酮酸激酶蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，以及通過(guò)進(jìn)行 收件人的【技術(shù)領(lǐng)域】?jī)?nèi)已知的常規(guī)試驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)來(lái)識(shí)別非保守氨基酸，從而確定適合在一丙酮 酸激酶蛋白質(zhì)序列中替換或刪除的氨基酸。通過(guò)在編碼所述天然蛋白質(zhì)的核酸序列中引入 核苷酸變化，使得在所述核酸于一宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)實(shí)現(xiàn)所預(yù)期的氨基酸變化，從而可以 提供一修飾重組丙酮酸激酶蛋白質(zhì)。
[0032] 在本發(fā)明具體實(shí)施的一種方法中有用的重組丙酮酸激酶蛋白質(zhì)或其他合成丙酮 酸激酶蛋白質(zhì)將與天然丙酮酸激酶之間有大約60%或更高的氨基酸序列同一性，而且它們 之間的氨基酸序列同一性較常為至少大約70%、80%、90%、95%、98%或更高、或100%， 并明確包括以上列舉的那些蛋白質(zhì)中的所有序列同源性及序列同源性范圍。為比對(duì)目的， 通過(guò)在最佳對(duì)齊時(shí)對(duì)所述序列中每一位置的氨基酸進(jìn)行比對(duì)，確定多個(gè)氨基酸序列之間的 序列同一性。如果在某一位置的多個(gè)氨基酸全同，則所述多個(gè)序列被視為在該位置全同。 "裂隙"是在一個(gè)序列中存在一個(gè)氨基酸殘基的情況下一序列對(duì)齊中的一位置（而不是另一 個(gè)位置），被當(dāng)成一帶有非全同殘基的位置。序列的對(duì)齊可以通過(guò)使用合適的程序或算法來(lái) 進(jìn)行。計(jì)算機(jī)輔助程序?qū)R可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)軟件程序方便地進(jìn)行。
[0033] 所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)也可以化學(xué)合成。本發(fā)明也明確包括本文中描述的結(jié)合一 種丙酮酸激酶蛋白質(zhì)的多種融合蛋白質(zhì)的提供及使用?？梢酝ㄟ^(guò)連接編碼所述丙酮酸激酶 蛋白質(zhì)的多個(gè)不同的脫氧核糖核酸（DNA)片段，以及（例如）根據(jù)需要，通過(guò)使用鈍性末 端及寡核苷酸接頭來(lái)加強(qiáng)所述蛋白質(zhì)的親脂性的親脂性氨基酸序列、燒煮（以提供交錯(cuò)末 端）及結(jié)扎黏性末端，從而提供編碼一融合蛋白質(zhì)的核酸。
[0034] 本文中描述的可以為重組丙酮酸激酶蛋白質(zhì)及融合蛋白質(zhì)的表達(dá)而轉(zhuǎn)染的的宿 主細(xì)胞包括細(xì)菌-比如大腸桿菌（Escherichia coli)、芽胞桿菌菌株（例如枯草芽胞桿 菌 Bacillus subtilis)、鏈霉菌（Streptomyces)菌株及假單胞菌（Pseudomonas)菌株；酵 母-比如酵母菌屬（Sacchromyces)及皮奇真菌屬（Pichia);昆蟲細(xì)胞；鳥類細(xì)胞及哺乳動(dòng) 物細(xì)胞-比如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO)、源自非洲綠猴腎臟并運(yùn)載類人猿病毒基因材料的 (COS)細(xì)胞、海拉（HeLa)細(xì)胞、HaRas基因細(xì)胞、WI38細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系（SW480)細(xì) 胞及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系（NIH3T3)細(xì)胞。在按需要使用標(biāo)準(zhǔn)提純方法從宿主細(xì)胞及/ 或上清液中提純表達(dá)產(chǎn)物之前，所述宿主細(xì)胞在所引入的核酸的表達(dá)（一般在一合適的表 達(dá)載體中表達(dá)）條件下，在一合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0035] 本文中描述的多種丙酮酸激酶蛋白質(zhì)也可以通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)部分或非 蛋白質(zhì)部分與所述蛋白質(zhì)耦合來(lái)修飾，以改進(jìn)可溶性、親脂性、穩(wěn)定性、生物半衰期，或（例 如）作為一標(biāo)記供隨后檢測(cè)或作類似用途。修飾也可以通過(guò)轉(zhuǎn)譯后修飾或合成后修飾來(lái)實(shí) 現(xiàn)，比如通過(guò)連結(jié)碳水化合物部分、或通過(guò)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)修飾（例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的 烷化或乙?；蚱渌婕盎瘜W(xué)鍵的形成的變化）的化學(xué)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)修飾。例如，所述丙酮 酸激酶蛋白質(zhì)可以經(jīng)受從包含酪氨酸及/或色氨酸殘基的甲基化、磷酸化、氧化，糖基化及 S-甲基半胱氨酸共價(jià)結(jié)合的群中選擇的一種或多種修飾。
[0036] 所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)的大小可以偏離完全蛋白質(zhì)的范圍。然而，所述丙酮酸激 酶的長(zhǎng)度應(yīng)足以使得能夠形成二聚物。
[0037] 多種天然丙酮酸激酶蛋白質(zhì)的C-末端及N-末端延伸涉及四級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化及所 述蛋白質(zhì)的聚集體的產(chǎn)生。因此，缺乏這樣的C-末端及N-末端延伸的丙酮酸激酶欠佳地 形成聚集體。丙酮酸激酶蛋白質(zhì)形成大聚集體。丙酮酸激酶的聚集體形成也涉及丙酮酸激 酶蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，而且酸堿度低于PH7的組氨酸殘基的離子化可能破壞所述 聚集體。一般上，在本發(fā)明具體實(shí)施的一種方法中使用的丙酮酸激酶蛋白質(zhì)將是二聚物形 式。
[0038] 在本發(fā)明的多個(gè)具體實(shí)施例中有用的丙酮酸激酶蛋白質(zhì)的完整形式及截短形式， 可能以轉(zhuǎn)譯后修飾為條件，所述轉(zhuǎn)譯后修飾不限于天然丙酮酸激酶蛋白質(zhì)中的乙?；?、甲 基化、乙基化、磷酸化、氧化及糖基化修飾。堿性磷酸酶活性的合適條件包括合適的含鋅、含 鎂或含鈣的緩沖液。
[0039] 可以通過(guò)任何合適的提純方法（例如過(guò)濾及色譜方法）提純多種部分水解形式的 丙酮酸激酶蛋白質(zhì)，用于本發(fā)明的實(shí)施例中。
[0040] 可以根據(jù)本發(fā)明的方法處理的組織位點(diǎn)及創(chuàng)口包括急性及慢性創(chuàng)口、灼傷（包括 因暴露于電離輻射而造成的灼傷）、化學(xué)性創(chuàng)口、手術(shù)創(chuàng)口、口腔創(chuàng)口、皮膚及肌肉外傷、開 放性皮膚創(chuàng)口、糖尿病皮膚疼痛（包括糖尿病足部潰瘍、糖尿病神經(jīng)病變性足部潰瘍）、缺 血性組織（包括缺血性神經(jīng)病變性足部潰瘍、靜脈停滯潰瘍、褥瘡性潰瘍及乏氧組織）。缺 血性及乏氧組織的例子包括缺血性心臟組織及與腦卒中有關(guān)的乏氧組織。可以通過(guò)施用丙 酮酸激酶蛋白質(zhì)來(lái)促進(jìn)創(chuàng)口愈合過(guò)程的情況，包括在愈合被（例如）組織缺氧、重復(fù)損傷或 系統(tǒng)性原因（比如糖尿病及血管疾病）損害或阻止時(shí)傷口愈合遲滯的情況。根據(jù)本發(fā)明， 可以由丙酮酸激酶蛋白質(zhì)誘導(dǎo)而增殖及/或遷移的內(nèi)皮細(xì)胞類型的例子包括人臍靜脈內(nèi) 皮細(xì)胞、人血管內(nèi)皮細(xì)胞及主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。
[0041] 可以將所述丙酮酸激酶蛋白施用于一受治療者，以穩(wěn)定所述受治療者體內(nèi)的干細(xì) 胞及組織培養(yǎng)物。通過(guò)施用所述蛋白質(zhì)，所述培養(yǎng)物或細(xì)胞可以進(jìn)行血管生成。
[0042] 在一個(gè)特定實(shí)施例中，可以以一丙酮酸激酶蛋白質(zhì)來(lái)處理干細(xì)胞，以助長(zhǎng)通往所 移植的干細(xì)胞的血管，以促進(jìn)所述干細(xì)胞的生存。所述干細(xì)胞的來(lái)源可以是脂肪基質(zhì)細(xì)胞、 胚胎干細(xì)胞及/或得自骨髓抽取物的干細(xì)胞。所述干細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，而且在 不同的的實(shí)施例中是人干細(xì)胞。干細(xì)胞可以緊在施用所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)之前應(yīng)用于所 述位點(diǎn)，而且干細(xì)胞可以與干細(xì)胞混合以進(jìn)行共移植。
[0043] 在另一個(gè)實(shí)施例中，可以通過(guò)以與丙酮酸激酶實(shí)質(zhì)相似的蛋白質(zhì)或以丙酮酸激酶 處理所移植的組織，從而促進(jìn)組織移植?？梢砸员峒っ傅鞍踪|(zhì)處理所移植的組織。可以 在組織缺損部位包括一包含、支撐或維持所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)以及其他材料的腳手架。 在一個(gè)例子中，一腳手架可以包含或支撐干細(xì)胞，以使得所述干細(xì)胞能夠在移植位點(diǎn)生長(zhǎng) 及/或維持。此外，所述腳手架可以促使內(nèi)原細(xì)胞遷移到所述施用位點(diǎn)中。可以在組織缺 損部位植入或施加于所述腳手架，接著是施用所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)。一個(gè)例子包括一用 于促進(jìn)組織移植及細(xì)胞移植的方法以一與丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)實(shí)質(zhì)相似的蛋白 質(zhì)接觸一移植位點(diǎn)。在有些例子中，所述將移植的細(xì)胞可以與一與丙酮酸激酶實(shí)質(zhì)相似的 蛋白質(zhì)混合。
[0044] 所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)可以獨(dú)自地施用于僅需要這樣的治療的受治療者，或與 一種或多種治療劑共同施用于所述受治療者。例如，所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)可以與在傳 統(tǒng)上用于促進(jìn)血管生成及/或創(chuàng)口愈合的治療劑結(jié)合而共同施用。"共同施用"的意思是 通過(guò)相同或不同的途徑同時(shí)施用相同的藥劑配方或同時(shí)施用兩種不同的藥劑配方，或通 過(guò)相同或不同的途徑連續(xù)施用，所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)及其他治療劑通過(guò)共同施用而顯 現(xiàn)交迭的治療窗。"連續(xù)施用"的意思是一種藥劑在另一種藥劑施用之后施用。這樣的可 以與所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)共同施用的進(jìn)一步的治療劑包括血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF)、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、血小板源創(chuàng)口愈合因子、胰島素生長(zhǎng)因子（IGF)、角化細(xì)胞生 長(zhǎng)因子（KGF)、抗炎劑及抗菌劑。其他進(jìn)一步的、可以與所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)共同施用 以促進(jìn)血管生成及/或創(chuàng)口愈合的治療劑例子包括吲哚胺2, 3-二加氧酶（indoleamine 2, 3-dioxygenase, ID0)、色氨酸二加氧酶（tryptophan dioxygenase, TD0)、鞘氨醇-1-憐 酸酯（sphingosine-l-phosphate, SIP)、N-醜基乙醇胺類（N-acylethanolamines, NAEs)、 葡萄柚萃取物及其他植物化學(xué)物質(zhì)，包括ascein、綠茶兒茶酚類、褪黑素、精氨酸及其他用 于支持血管生長(zhǎng)的氨基酸。
[0045] 所述丙酮酸激酶一般將配制為一包含所述蛋白質(zhì)及一在藥學(xué)上可接受的載體的 藥物組合物。合適的藥物組合物包括局部可接受制劑，比如軟膏、洗劑、油膏及凝膠，以及內(nèi) 用或外用的生物可降解凝膠或基質(zhì)。局部可接受組合物可以直接應(yīng)用于處理位點(diǎn)，包括 作為浸漬了所述制劑的敷料及類似物來(lái)應(yīng)用。包含一丙酮酸激酶蛋白質(zhì)沉淀物的凝膠 特別合適。本文中描述的凝膠及其他藥物組合物也可以包括鈣離子及/或鹽類。鈣在所述 組合物中的存在可以促進(jìn)創(chuàng)口愈合。
[0046] 本文中描述的一藥物組合物也可以結(jié)合一種或多種防腐劑，比如結(jié)合對(duì)羥基苯甲 酸酯類（parabens)、氯丁醇、山梨酸、粘合劑類（比如玉米淀粉或白明膠）、增稠劑、乳化劑、 表面活性劑、膠凝劑以及其他一般用于這樣的組合物中的成分。在藥學(xué)上可接受的載體包 括任何合適的傳統(tǒng)上已知的局部可接受的及在生理學(xué)上可接受的溶劑、分散介質(zhì)、等滲等 壓制劑及溶液。這樣的成分及介質(zhì)用于藥用活性物質(zhì)，廣為人知。除非任何傳統(tǒng)介質(zhì)或藥 劑與所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)有配伍禁忌，則本發(fā)明明確包括這些傳統(tǒng)介質(zhì)或藥劑的使用。 [0047] 本發(fā)明具體實(shí)施的多種藥物組合物包括供人及獸醫(yī)使用的治療組合物。典型地， 所述藥物組合物的酸堿度PH值將適合直接將所述組合物應(yīng)用于創(chuàng)口。一般上，所述酸堿度 PH值將高于5,而且通常大約為7或更高。本文中描述的丙酮酸激酶蛋白質(zhì)凝膠沉淀物，可 以是從一含有所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)及一在生理學(xué)上可接受的緩沖體系的溶液沉淀，而所 述沉淀物具有期望的酸堿度PH值?？蛇x擇地，可以通過(guò)對(duì)所述凝膠添加任何合適的酸堿度 (pH值）調(diào)節(jié)劑，以改變所述凝膠的pH值。
[0048] 本發(fā)明具體實(shí)施的一藥物組合物中的所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)含量，一般至少將 占所述組合物的大約〇. 001 %的重量，而其含量比率可高達(dá)所述組合物的大約80% w/w。 例如，所述藥物組合物可以含有大約〇. 05%、0. 01%、0. 1%、1%、10%、20%、30%、40%、 50 %、60 %、70 %或80 %重量的所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)或?qū)嵸|(zhì)相似的蛋白質(zhì)。在所述藥物組 合物中，所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)的量將會(huì)是：一適當(dāng)?shù)挠行┝繉⒏鶕?jù)擬議的施用方式釋 放到受治療者。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例施用的丙酮酸激酶劑量將取決于許多因素，這些因素包括 所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)是否是為疾病預(yù)防用途或治療用途施用、所述蛋白質(zhì)預(yù)定施用來(lái)治 療的疾病或情況、所述情況的嚴(yán)重性、受治療者的性別及年齡以及相關(guān)因素（包括受治療 者的體重及總體健康情況），而且所述施用的丙酮酸激酶劑量可以根據(jù)公認(rèn)的醫(yī)學(xué)原則來(lái) 確定。例如，最初可以給予低劑量，然后對(duì)受治療者的反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，接著在隨后的每次施 用時(shí)增加劑量。同樣地，施用頻率可以按同樣的方法確定，即在每一劑量之間不斷地監(jiān)視受 治療者的反應(yīng)，而如果其反應(yīng)合意，則提高施用頻率，或在其反應(yīng)不合意時(shí)減低施用頻率。
[0050] -般上，所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)將根據(jù)本揭示具體實(shí)施的一方法施用。以局部應(yīng) 用的情況而言，是通過(guò)以含有0.5%-0.01%重量的丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)的藥物 組合物覆蓋一組織或創(chuàng)口位點(diǎn)，將所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)施用到所述位點(diǎn)。
[0051] 施用途徑包括但不限于局部施用、經(jīng)呼吸道施用、經(jīng)靜脈施用、經(jīng)口服施用、經(jīng)腹 膜腔施用、經(jīng)皮下施用、經(jīng)肌肉施用、經(jīng)直腸施用、局部施用及通過(guò)植入施用。以靜脈途徑而 言，特別適合的途徑是通過(guò)注射到向靶組織供應(yīng)血液的血管內(nèi)。所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)也 可以釋放到腔內(nèi)（例如胸膜腔或腹膜腔、顱腔）或直接注射到需治療的組織內(nèi)。以口服施 用而言，所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)可以封成囊狀，或以其他方式提供在一腸道中，以使其通過(guò) 胃部及在小腸中釋放。任何這樣的合適的腸道配方或覆料都可以使用。
[0052] 此外，也可以將一丙酮酸激酶蛋白質(zhì)涂覆到一導(dǎo)管（比如一血管成形術(shù)導(dǎo)管）或 其他外科器械的支架或球囊的表面，以在血管成形術(shù)或其他外科手術(shù)進(jìn)行期間施加到一血 管的內(nèi)壁。例如，所述丙酮酸激酶蛋白質(zhì)可以以凝膠或任何其他適當(dāng)?shù)呐浞降男问?，以這 個(gè)方式施加到所述血管的內(nèi)壁，以促進(jìn)創(chuàng)口愈合及/或血管生成或上皮細(xì)胞遷移到治療位 點(diǎn)。
[0053] 在本發(fā)明具體實(shí)施的組合物中有用的、合適的在藥學(xué)上可接受的載體及配方（例 如）可以在手冊(cè)及文本中找到。
[0054] 實(shí)施例
[0055] 實(shí)施例1
[0056] 以下為一例示性丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)序列。 丙酮酸激酶 M2 型同工酶（PKM2)編號(hào) NP 002645 (PKM2 Accession No. NP 002645)

【權(quán)利要求】
1. 一種用于刺激一受治療者的一組織中的血管生成或血管生長(zhǎng)的方法，包括以一與丙 酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)實(shí)質(zhì)相似的蛋白質(zhì)接觸所述組織。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)的一 突變體。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是來(lái)自一人的丙酮酸激酶M2型同工酶 (PKM2)。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是在一在藥學(xué)上可接受的載體中。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組織通過(guò)一包含所述蛋白質(zhì)的軟膏與所述蛋白 質(zhì)接觸。
6. -種促進(jìn)一哺乳動(dòng)物的一組織中的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，包括以一能刺激內(nèi)皮細(xì)胞 遷移的量的丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)來(lái)接觸所述組織。
7. -種通過(guò)向一受治療者施用包括一丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)的一藥物組合物 來(lái)治療需要治療的所述受治療者的皮膚損傷的方法。
8. -種用于促進(jìn)組織移植及細(xì)胞移植的方法，包括：以一與丙酮酸激酶M2型同工酶 (PKM2)實(shí)質(zhì)相似的蛋白質(zhì)來(lái)接觸一移植位點(diǎn)。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括：提供與所述蛋白混合的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞 是干細(xì)胞。
10. -種影響一細(xì)胞、細(xì)胞群或有機(jī)體中的血管生成的方法，包括：向所述細(xì)胞、細(xì)胞 群或有機(jī)體施用包含一與丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)實(shí)質(zhì)相似的蛋白質(zhì)的、一在藥學(xué) 上可接受的組合物，其中所述藥物組合物導(dǎo)致所述細(xì)胞、所述細(xì)胞群或所述有機(jī)體發(fā)生變 化，及其中所述有機(jī)體存在血管生成相關(guān)紊亂，比如黃斑退化、角膜潰瘍、腦卒中、缺血性心 臟病、不育、潰瘍、硬皮病、創(chuàng)口愈合、缺血、缺血性心臟病、心肌梗塞、非炎性心肌病、心絞 痛、不穩(wěn)定型心絞痛、腳手架、皮膚移植、組織工程學(xué)。
11. 一種包括一丙酮酸激酶M2型同工酶（PKM2)及一在藥學(xué)上可接受的載體的藥物組 合物。
【文檔編號(hào)】A61K38/45GK104379161SQ201380013389
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月15日
【發(fā)明者】劉志仁, 李良偉, 張銀偉 申請(qǐng)人:喬治亞州立大學(xué)研究基金會(huì)