本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌株、菌劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會發(fā)展，人們對食品安全性的要求越來越高，但是，化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染和農(nóng)藥殘留等問題，植物病害的生物防治成為了研究熱點，其中尤以植物內(nèi)生細菌作為拮抗菌的研究得到眾多學(xué)者的觀注。植物內(nèi)生細菌是指生活在植物體內(nèi)，但對植物沒有任何實質(zhì)性傷害的細菌，其具有多種生物學(xué)功能，特別是抑菌功能使其成為生防菌資源的有力支撐。植物內(nèi)生細菌除可以通過分泌抑菌物質(zhì)及與病原菌競爭營養(yǎng)空間等直接作用與病原菌外，還可以誘導(dǎo)植物獲得抗病性阻止對植物的侵染或造成的危害。以拮抗內(nèi)生細菌為菌種資源研制的微生物農(nóng)藥不易產(chǎn)生抗藥性，不傷害天敵，且能利用農(nóng)副產(chǎn)品等廣泛生產(chǎn)，更重要的是內(nèi)生細菌可以定殖于作物體內(nèi)，甚至可以通過種子(苗木)傳播于下一代，長期起作用，省時省力，高效，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)后為生產(chǎn)綠色或無公害農(nóng)產(chǎn)品提供了一個新的途徑。

中國作為番茄栽培大國，番茄果實及其加工產(chǎn)品用于鮮食和出口，然而番茄病害同樣為其生產(chǎn)帶來了顯著影響，特別是近年來番茄丁香假單胞葉斑病在番茄栽培區(qū)有快速蔓延趨勢，給生產(chǎn)造成較大的損失。目前，對于該病害的防治主要通過選育抗病品種以及噴施化學(xué)藥劑的方式，但農(nóng)業(yè)防治方法耗時耗力，見效慢，且防治效果不太理想，而長期進行化學(xué)防治將對人畜和生態(tài)環(huán)境等的安全造成嚴重威脅，特別是農(nóng)藥殘留影響鮮食番茄的安全性。所以，既高效又安全的生物防治方法迅速引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中最常的一個種，其數(shù)量多，且很多菌株具有抑菌功能，現(xiàn)有枯草芽孢桿菌報道的是該菌株對香蕉枯萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌和西瓜枯萎病菌等具有良好抑制作用，但對于番茄病害尚無報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高寒草地牧草內(nèi)生細菌枯草芽孢桿菌菌株。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種微生物菌劑，以解決現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性以及安全性差的問題。

本發(fā)明的第三個目的是提供了一種微生物菌劑的制備方法。

本發(fā)明的第四個目的是提供了一種微生物菌劑的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048，分離自極端環(huán)境條件下的高寒草地針茅體內(nèi)，具有抑制病原菌的能力。

優(yōu)選地，所述病原菌包括有番茄丁香假單胞葉斑病菌(pseudomonassyringapv.tomato)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)和番茄枯萎病菌(fusarium.oxysporum)。

一種微生物菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004的菌體，菌株qly004的活菌數(shù)為2.48×10¹⁰cfu/ml-6.43×10¹²cfu/ml。

優(yōu)選地，菌株的活菌數(shù)為4.65×10¹²cfu/ml。

優(yōu)選地，所述微生物菌劑中草芽孢桿菌菌株qly004的重量百分含量為10-18％，余量為培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成，牛肉膏2-4g，玉米淀粉20-30g，cacl22-4g，酵母膏6-8g，蒸餾水或無離子水1000ml，所述培養(yǎng)基的ph值為7.5-8.5。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成，牛肉膏3g、玉米淀粉25g、cacl23g、酵母膏7g，蒸餾水或無離子水1000ml，所述培養(yǎng)基的ph值為8.0。

上述的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：將枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004菌株接入至培養(yǎng)基中發(fā)酵，接入量為10-18％，發(fā)酵時間為35-43h，發(fā)酵溫度為28-36℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為170-250r/min，發(fā)酵溶氧量為75％-85％。

優(yōu)選地，發(fā)酵時間為39h，發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為210r/min，發(fā)酵溶氧量為80％。

上述的一種微生物菌劑在制備農(nóng)藥中的應(yīng)用。

本發(fā)明枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048，已于2016年09月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。

本發(fā)明枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004為內(nèi)生菌，一方面由于內(nèi)生枯草芽孢桿菌可定殖于植物體內(nèi)，受外界環(huán)境影響小，生防作用穩(wěn)定持久，甚至通過種子等途徑傳播于下一代，另一方面本發(fā)明內(nèi)生枯草芽孢桿菌不僅對番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌等病原真菌有拮抗作用，且對番茄丁香假單胞葉斑病菌等細菌也有較好抑制作用；其中，對番茄丁香假單胞葉斑病菌抑菌帶寬達到0.67cm以上，對番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)的抑菌達60％，對番茄枯萎病菌抑菌率達61％。可以一菌多防，且克服現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)農(nóng)藥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全性差的缺陷，具有環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安全性好的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是草芽孢桿菌菌株qly004的菌落形態(tài)圖；

圖2是草芽孢桿菌菌株qly004的菌體形態(tài)圖；

圖3是草芽孢桿菌菌株qly004對番茄丁香假單孢葉斑病菌的抑菌作用圖；

圖4是草芽孢桿菌菌株qly004的碳源篩選圖；

圖5是草芽孢桿菌菌株qly004的氮源篩選圖；

圖6是草芽孢桿菌菌株qly004的無機鹽篩選圖。

具體實施方式

下面的實施例可以進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實施例1：微生物菌劑

其活性成分為枯草芽孢桿菌菌株(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048的菌體，其中，枯草芽孢桿菌qly004的重量百分含量為10％，余量為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成：牛肉膏2g、玉米淀粉20g、cacl22g、酵母膏6g，蒸餾水或無離子水1000ml，所述培養(yǎng)基的ph值為7.5，枯草芽孢桿菌qly004的活菌數(shù)為2.48×10¹⁰cfu/ml。

上述微生物菌劑的制備方法，是將枯草芽孢桿菌菌株qly004接入至培養(yǎng)基中發(fā)酵，接入量為10％，發(fā)酵時間為35h，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為170r/min，發(fā)酵溶氧量為75％。

實施例2：一種微生物菌劑

其活性成分為枯草芽孢桿菌菌株qly004的菌體，其中，枯草芽孢桿菌菌株qly004的重量百分含量為14％，培養(yǎng)基余量，培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成：牛肉膏3g、玉米淀粉25g、cacl23g、酵母膏7g，蒸餾水或無離子水1000ml，所述培養(yǎng)基的ph值為8.0，草芽孢桿菌菌株qly004(cgmccno.13048)的活菌數(shù)為4.65×10¹²cfu/ml。

上述微生物菌劑的制備方法，是草芽孢桿菌菌株qly004接入至培養(yǎng)基中發(fā)酵，接入量為14％，發(fā)酵時間為39h，發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為210r/min，發(fā)酵溶氧量為80％。

實施例3：一種微生物菌劑

活性成分為草芽孢桿菌菌株qly004的菌體，其中，枯草芽孢桿菌qly004的重量百分含量為18％，培養(yǎng)基余量，培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成：牛肉膏4g、玉米淀粉30g、cacl24g、酵母膏8g，蒸餾水或無離子水1000ml，所述培養(yǎng)基的ph值為8.5，草芽孢桿菌菌株qly004的活菌數(shù)為6.43×10¹¹cfu/ml。

上述微生物菌劑的制備方法，是將草芽孢桿菌菌株qly004接入至培養(yǎng)基中發(fā)酵，接入量為18％，發(fā)酵時間為43h，發(fā)酵溫度為36℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為250r/min，發(fā)酵溶氧量為85％。

實施例1-3的微生物菌劑可用作制備農(nóng)藥。

下面通過試驗一至試驗二，分別對本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004菌株在形態(tài)、16srdna基因序列進行鑒定。

試驗一：對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004菌株的形態(tài)鑒定：

將枯草芽孢桿菌菌株qly006接種于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d的培養(yǎng)性狀為：菌落圓形，邊緣隆起和光滑，中心下陷，淡紅色，大小1.5-2.5mm(圖1)；qly004(cgmccno.13048)菌體呈蘭氏陽性，桿狀(圖2)，大小為0.53～1.07μm×0.61～1.90μm。

試驗二：對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004菌株的16srdna基因序列鑒定：

將枯草芽孢桿菌菌株qly006的16srdna基因序列在genebank中與枯草芽孢桿菌(b.subtilis)(hq443223和hq143563)的同源性在99％以上，并在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，結(jié)合形態(tài)特征，將qly004鑒定為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。

下面通過試驗三和試驗四對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004菌株的室內(nèi)抑菌活性和田間防治效果進行測定。

試驗三：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004菌株室內(nèi)抑菌活性測定：

首次篩選出內(nèi)生細菌枯草芽孢桿菌菌株(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048拮抗菌株，將該拮抗菌株接種于qly004培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；同時，將番茄丁香假單胞葉斑病菌接種于牛肉膏蛋白胨(即na)平板培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。當(dāng)拮抗菌株和指示菌株在各自的培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化后，在100ml溶解后冷卻至45℃左右的na培養(yǎng)基中加入lml指示菌(病原菌菌液)(含菌量cfu/10⁸ml)混勻，后在含菌平板上分別等距離接種拮抗菌株，3次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)，48h后用十字法重復(fù)測量其抑菌透明圈寬度并記錄數(shù)據(jù)，在本試驗中重復(fù)測定3次。將番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌接種于馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基(即pda培養(yǎng)基)進行活化。當(dāng)拮抗菌株、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌在各自的培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化后，分別用打孔器打成直徑為6mm的菌餅。選取番茄灰霉病菌的菌餅一塊，置于pda培養(yǎng)基中；具體的，可以將該菌餅接種于盛裝pda培養(yǎng)基的平皿的中央位置(平皿直徑9cm)；再選取由拮抗菌株得到的菌餅四塊，根據(jù)對峙法，將該四塊菌餅等距接種于距該平皿中央位置為2.5cm的圓周上。將該培養(yǎng)皿在25℃的環(huán)境溫度下培養(yǎng)5天后，測定該pda培養(yǎng)基中上述菌株的抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)，在本試驗中重復(fù)測定3次。

枯草芽孢桿菌菌株qly004對番茄丁香假單胞葉斑病菌的抑菌帶寬為0.67cm(圖3)，且拮抗效果強且穩(wěn)定，對番茄灰霉病菌的抑菌率達60％，對番茄枯萎病菌的抑菌率達61％，說明枯草芽孢桿菌菌株qly004具有開發(fā)為防治番茄細菌性葉斑病、番茄灰霉病和番茄枯萎病的生物農(nóng)藥的潛力。

試驗四：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048菌劑對番茄細菌性葉斑病的的防治效果測定：

在室內(nèi)將枯草芽孢桿菌菌株qly004和番茄丁香假單胞葉斑病菌分別經(jīng)na搖瓶液體培養(yǎng)24h后，先將番茄丁香假單胞葉斑病菌通過傷口接種法接種于健康的番茄植株葉片上，24h后再接種枯草芽孢桿菌菌株qly004菌懸液，保濕48h后在室內(nèi)條件下待其發(fā)病，12d后觀察發(fā)病情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)及枯草芽孢桿菌菌株qly004對番茄葉斑病的相對防治效果。葉斑病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級：葉片無病斑；1級：0＜病斑面積占總?cè)~片面積≤10％；2級：10％＜病斑面積占總?cè)~片面積≤25％；3級：25％＜病斑面積占總?cè)~片面積≤50％；4級：50％＜病斑面積占總?cè)~片面積≤75％；5級：75％＜病斑面積占總?cè)~片面積≤100％。計算方法如下：

發(fā)病率＝發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100％

病情指數(shù)＝∑(各級發(fā)病數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高代表值)×100

防病效果＝(病原菌對照的病情指數(shù)-生防菌處理的病情指數(shù))/病原菌對照的病情指數(shù)

×100％

結(jié)果表明，將枯草芽孢桿菌菌株qly004發(fā)酵液接種12d后，番茄丁香假單孢葉斑病的病情指數(shù)為28.33％，對照組病情指數(shù)55.06％，枯草芽孢桿菌菌株qly004對番茄丁香假單孢葉斑病的防效為59％，說明枯草芽孢桿菌菌株qly004對番茄丁香假單孢葉斑病表現(xiàn)出較好的防治效果，具備良好的開發(fā)潛力。

下面通過試驗五和實驗六對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048菌株的最適培養(yǎng)基及其微生物菌劑的性能進行檢測。

試驗五：確定枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)菌株qly004的最適培養(yǎng)基：

1.種子液制備

將已活化的新鮮枯草芽孢桿菌菌株qly004菌株接至na培養(yǎng)液(80ml/150ml三角瓶)中，振蕩培養(yǎng)(210r/min，28℃)32h，制得種子液。

2.碳、氮源及無機鹽離子的篩選

供試碳源為a蔗糖；b玉米淀粉；c水溶性淀粉；d麥芽糖；e乳糖；f不加糖；ck基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將以上碳源分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)液(40ml/150ml三角瓶)中的葡萄糖，滅菌后接入種子液2ml，振蕩培養(yǎng)(180r/min，28℃)24h，每處理設(shè)3次重復(fù)，測定發(fā)酵液吸光度值(od600)，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌菌株qly004(cgmccno.13048)菌株的最適碳源為玉米淀粉，促生作用顯著大于其他碳源(p<0.05)(圖4)。

供試氮源為a尿素；b(nh4)2so4；ckno3；dnh4cl；e酵母膏；f不加氮；ck基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將以上氮源分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，滅菌后接入種子液2ml，振蕩培養(yǎng)(180r/min，28℃)24h，每處理設(shè)3次重復(fù)，測定發(fā)酵液吸光度值(od600)，結(jié)果表明，草芽孢桿菌菌株qly004(cgmccno.13048)菌株的最適氮源為酵母膏，且顯著高于其他氮源(p<0.05)，(圖5)。

無機鹽離子為amgso4；bkh2po4；cmnso4；dcuso4；ecacl2；f不加無機鹽離子；ck基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將以上無機鹽離子分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基的nacl，滅菌后接入種子液2ml，振蕩培養(yǎng)(180r/min，28℃)24h，每處理設(shè)3次重復(fù)，測定發(fā)酵液吸光度值(od600)，結(jié)果表明，草芽孢桿菌菌株qly004菌株的最適無機鹽為cacl2，且與其他無機鹽差異顯著(p<0.05)，(圖6)。

在確定玉米淀粉、酵母膏和cacl2為最適草芽孢桿菌菌株qly004的碳源、氮源和無機鹽的基礎(chǔ)上，進一步按不同濃度進行l(wèi)9(3³)正交試驗(表1)，28℃，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h，通過檢測發(fā)酵液吸光值(od600)確定枯草芽孢桿菌菌株qly004的最適碳源濃度為玉米淀粉20-30g/l，氮源酵母膏濃度為6-8g/l，無機鹽濃度分別為cacl22-4g/l，在此條件下的生物量(od600值)均顯著高于其他碳、氮源及無機鹽離子濃度條件下的(p<0.05)。

表1

3.發(fā)酵條件優(yōu)化

設(shè)定ph參數(shù)為6、6.5、7、7.5、8，溫度為20、24、28、32和36℃，搖床轉(zhuǎn)速為120、150、180、210、240和270r/min，接種量為2％、6％、10％、14％和18％，最佳供氧量為45％、55％、65％、75％和85％，在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以上各條件下培養(yǎng)生防菌株，通過檢測發(fā)酵液吸光度值(od600)確定最適ph值為7.5-8.5、最適溫度為28-36℃、最適的接種量為10％-18％、最適溶氧量為75％-85％和最適轉(zhuǎn)速為170-250r/min；在篩選得到的最佳培養(yǎng)基、溫度、轉(zhuǎn)速和供氧量等的基礎(chǔ)上，對草芽孢桿菌菌株qly004(cgmccno.13048)株進行連續(xù)培養(yǎng)，每隔3h取樣，3次重復(fù)處理，測定發(fā)酵液吸光度值(od600)，確定100l發(fā)酵罐中最佳發(fā)酵時間為35-43h。

試驗六：對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048微生物菌劑的活性進行檢測：

在上述試驗五中已確定草芽孢桿菌菌株qly004的最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將保存在斜面培養(yǎng)基中的草芽孢桿菌菌株qly004在營養(yǎng)瓊脂(nutrientagar，簡稱na)培養(yǎng)基的平皿上培養(yǎng)活化24h后，接種于營養(yǎng)肉湯(nutrientbroth，簡稱nb)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)24h之后，以1％的接種量接入種子發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h之后，轉(zhuǎn)接種于100l的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，以發(fā)酵液中活菌數(shù)為指標(biāo)，分別對溶氧量、轉(zhuǎn)速、ph值和接種量進行優(yōu)化，最終草芽孢桿菌菌株qly004(cgmccno.13048)在100l發(fā)酵罐中的最適發(fā)酵條件為：溫度28-36℃，ph值為7.5-8.5，轉(zhuǎn)速為170-250r/min，接種量10％-18％，溶氧量為75％-85％的條件下，進行液體發(fā)酵35-43h，活菌數(shù)為2.48×10¹⁰cfu/ml-4.65×10¹²cfu/ml。

將草芽孢桿菌菌株qly004(cgmccno.13048)在上述發(fā)酵條件的發(fā)酵罐中發(fā)酵，即可制得到具有良好防病能力的微生物菌劑。其中，在溫度為32℃，接種量為14％，ph值為8.0，溶氧量80％，轉(zhuǎn)速為210r/min和培養(yǎng)時間為39h的發(fā)酵條件下，發(fā)酵液中活菌數(shù)可以達到4.65×10¹²cfu/ml。

經(jīng)試驗驗證，上述草芽孢桿菌菌株qly004，cgmccno.13048微生物菌劑，適宜于防治番茄丁香假單孢葉斑病、番茄枯萎病和番茄灰霉病病。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。