本發(fā)明涉及一種微生物菌株及其發(fā)酵制備高純酶制劑的工藝，特別涉及一種高效分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌株及制備高純納豆激酶酶制劑的工藝。
背景技術(shù)：
：納豆是黃豆經(jīng)過納豆枯草桿芽孢桿菌發(fā)酵制成的發(fā)酵豆制品食品。納豆激酶(nk)是一種由納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，存在于納豆中。nk除在體內(nèi)外有強(qiáng)烈的纖維蛋白溶解活性外，還有促進(jìn)血液流動(dòng)、防血小板凝聚和降血壓等功效。nk于1980年首次由須見洋行博士發(fā)現(xiàn)，其相對(duì)分子質(zhì)量(mr)為27000，等電點(diǎn)為8.6±0.3。由血栓引起的心血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，目前溶栓劑包括注射類降解藥物(尿激酶、鏈激酶和組織型纖維蛋白原激活劑)和類組織纖維蛋白酶的蛋白(納豆激酶和蚓激酶)兩大類。注射類降解藥物高度依賴體內(nèi)組織纖維蛋白酶原的水平，存在一定毒性，半衰期短且成本高。而nk屬于天然發(fā)酵產(chǎn)物，安全性高，具有體內(nèi)作用時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格低廉、有預(yù)防作用及易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已發(fā)展為保健食品，其臨床應(yīng)用已得到美國fda認(rèn)可。提高nk工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)量和純度，對(duì)治療血栓疾病有重要意義。采用優(yōu)化啟動(dòng)子和信號(hào)肽、選用蛋白酶缺失的菌株以降低nk降解或者直接改造nk基因序列等技術(shù)手段以達(dá)到提高nk產(chǎn)量的目的。nk在枯草芽孢桿菌中可實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，wus等構(gòu)建了枯草芽孢桿菌工程菌，并通過優(yōu)化啟動(dòng)子使nk的表達(dá)量增加了136％，達(dá)1999u/ml(平板法)。其他細(xì)菌，例如大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸鏈球菌和酵母菌等也通過基因工程發(fā)酵nk。但這些技術(shù)也存在一些需要解決的問題，如在大腸桿菌中表達(dá)出沒有活性的包涵體；在其他工程菌中nk雖然能夠可溶性表達(dá)，但酶產(chǎn)量低，純化回收過程復(fù)雜，有待進(jìn)一步改進(jìn)工程菌構(gòu)造。nishitoy等人已經(jīng)證明，納豆發(fā)酵菌屬于枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種?？莶菅挎邨U菌無致病性、無明顯的密碼子偏好性，具備包含轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和分泌等機(jī)制，常常作為工程菌株構(gòu)建載體。本實(shí)驗(yàn)前期驗(yàn)證b.subtilis168含有nk基因序列，但不能表達(dá)有活性的nk。采用分子生物學(xué)方法，依據(jù)b.subtilis168的基因密碼子偏好性，優(yōu)化nk-aprn基因編碼前30個(gè)氨基酸的序列，并加入六個(gè)組氨酸標(biāo)記，以pht01為表達(dá)載體，成功構(gòu)建工程菌，優(yōu)化發(fā)酵條件后最高酶活可達(dá)289u/ml，高密度發(fā)酵發(fā)酵液中最高酶活達(dá)到7778u/ml，經(jīng)親和柱層析制備高純納豆激酶酶制劑最高酶活為981731u/g，為納豆激酶基因工程進(jìn)一步研究和納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服天然菌種發(fā)酵性能的不足，提供一株可以高效分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌工程菌株和工程菌株用于發(fā)酵制備高純納豆激酶酶制劑的工藝。本研究利用pcr技術(shù)擴(kuò)增納豆枯草芽孢桿菌的aprn基因，并依據(jù)枯草芽孢桿菌的密碼子偏愛性優(yōu)化了起始30個(gè)氨基酸的密碼子，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pht01-aprn，經(jīng)限制性酶切、pcr擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證了其正確性。通過電擊法將pht01-aprn導(dǎo)入枯草芽孢桿菌168(bacillussubtilis168)，利用氯霉素抗性篩選獲得工程菌。經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)最高酶活為289u/ml，高密度發(fā)酵發(fā)酵液中最高酶活達(dá)到7778u/ml，經(jīng)親和柱層析制備高純納豆激酶酶制劑最高酶活為981731u/g。為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一株可以高效分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌工程菌株，其特征在于，所述菌株的分類命名為：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，保藏編號(hào)為cgmccno：13496，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年12月26日。本發(fā)明公開了構(gòu)造高效分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌工程菌株的方法、搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶條件以及酶活測(cè)定方法，操作如下：步驟一：nk-aprn基因片段的擴(kuò)增及優(yōu)化以b.subtilis168菌液為第一次擴(kuò)增的模版，以表1所列f1-r1引物對(duì)為第一次擴(kuò)增引物，凝膠電泳驗(yàn)證；膠回收產(chǎn)物為第二次pcr擴(kuò)增模版，以表1所列f2-r1引物對(duì)為第二次擴(kuò)增引物，凝膠電泳驗(yàn)證；第二次膠回收產(chǎn)物為第三次pcr擴(kuò)增模版，以表1所列f3-r2his引物對(duì)為第三次擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出優(yōu)化了前30個(gè)密碼子的aprn基因片段。步驟二：目的基因克隆步驟一擴(kuò)增出的nk基因片段與pmd19-t載體連接，將連接產(chǎn)物采用熱擊方法轉(zhuǎn)化到e.colidh5α感受態(tài)中，涂布amp抗性平板。步驟三：重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證質(zhì)粒pht01和提取步驟二中陽性菌的克隆質(zhì)粒雙酶切，用膠回收試劑盒回收純化目的片段，t4連接酶低溫過夜酶連，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞。菌落pcr鑒定后，取正確的陽性克隆活化培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測(cè)序。步驟四：工程菌的構(gòu)建及鑒定制備b.subtilis168的感受態(tài)細(xì)胞，將步驟四中提取的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取氯霉素抗性平板上長(zhǎng)出的5-8個(gè)單菌落，菌落pcr鑒定，取正確的陽性克隆活化培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測(cè)序。步驟五：工程菌發(fā)酵活化工程菌培養(yǎng)種子液，以氯霉素作為抗生素，種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，od600在0.8-1.0降溫至25℃至30℃，加入終濃度為0.2-1.0mm的iptg誘導(dǎo)培養(yǎng)。步驟六：納豆激酶酶活的測(cè)定本發(fā)明采用四肽底物法檢測(cè)納豆激酶酶活。制作對(duì)硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。nk活性單位被定義為nk每分鐘釋放1nmol硝基苯胺的含量。本發(fā)明還公開了工程菌高密度發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)酶條件和高純納豆激酶酶制劑的制備工藝，操作如下：(1)高密度發(fā)酵接種：活化菌種，在37℃、200rpm培養(yǎng)條件下制備一級(jí)種子液和二級(jí)種子液，種齡為12h的二級(jí)種子液按照10％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(氯霉素終濃度為5μg/ml、消泡劑0.01％)。發(fā)酵培養(yǎng)基(1l)：葡萄糖28.5g，甘油57g，酵母提取物60g、吡啶二羧酸0.167g、nh4cl3g、k2hpo4·3h2o1g、mnso4·h2o0.032g、feso4·7h2o0.05g、cocl2·6h2o0.01g、zncl20.01g、mgso4·7h2o2g、cacl2·2h2o5g，補(bǔ)水至1000ml。發(fā)酵：攪拌速率初始設(shè)置為800rpm，通氣量為12l/min。設(shè)置參數(shù)，控制罐內(nèi)溫度為37℃、溶氧量為30％、發(fā)酵液的ph7.0，依據(jù)溶氧情況調(diào)整攪拌速率和通氣量。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：取樣檢測(cè)od600，至對(duì)數(shù)前期降溫至28℃，加入iptg開始誘導(dǎo)發(fā)酵。補(bǔ)料：補(bǔ)料培養(yǎng)基(1l)：甘油250g，酵母提取物100g，補(bǔ)水至1000ml。檢測(cè)發(fā)酵液od600和發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的消耗情況，分別采用一次補(bǔ)料和連續(xù)補(bǔ)料方式補(bǔ)料培養(yǎng)。終止發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)24-28h后，終止發(fā)酵。(2)高純納豆激酶酶制劑的制備發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心后收集上清液、(nh4)2so4沉淀去除雜蛋白并沉淀nk、鎳柱純化、脫鹽并濃縮、加冷凍保護(hù)劑和冷凍干燥等步驟，制成高純度納豆激酶酶制劑，納豆激酶酶活達(dá)到981713u/g。本發(fā)明具有如下的有益效果：構(gòu)造枯草芽孢桿菌的納豆激酶工程菌，實(shí)現(xiàn)納豆激酶在其胞外表達(dá)，經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，酶活高達(dá)289u/ml，可進(jìn)一步用于工業(yè)化液體發(fā)酵生產(chǎn)。附圖說明表1nk-aprn基因pcr擴(kuò)增引物。表2nk-aprn基因pcr擴(kuò)增體系。圖1瓊脂糖凝膠電泳鑒定nk-aprn基因pcr擴(kuò)增電泳圖。圖2瓊脂糖凝膠電泳鑒定aprn基因克隆pcr擴(kuò)增電泳圖。圖3瓊脂糖凝膠電泳鑒定pmd19-t：aprn質(zhì)粒酶切電泳圖。圖4瓊脂糖凝膠電泳鑒定pht01質(zhì)粒酶切電泳圖。圖5瓊脂糖凝膠電泳鑒定pht01：aprn質(zhì)粒構(gòu)建電泳圖。圖6瓊脂糖凝膠電泳鑒定工程菌構(gòu)建電泳圖。圖7對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖8工程菌酶活和細(xì)胞生長(zhǎng)圖。圖9nk高密度發(fā)酵od600、酶活。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1步驟一：nk-aprn基因片段的擴(kuò)增及優(yōu)化lb液體培養(yǎng)基：10g/l蛋白胨、10g/l氯化鈉、5g/l酵母提取物。lb固體培養(yǎng)基：lb液體培養(yǎng)基、15g/l瓊脂糖。amp溶液：100mg/ml。根據(jù)genbank收錄納豆激酶基因序列(gi:608796180)，依據(jù)宿主菌b.subtitle密碼子偏好(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝1423)，利用生物軟件oligo設(shè)計(jì)引物(表1)，擴(kuò)增aprn基因并優(yōu)化它的前30個(gè)氨基酸密碼子。引物由生工生物工程有限公司合成。將保藏的b.subtilis168菌株活化后，按照2％的接種量接種于lb培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)12h。目的基因的克隆采用over-lappingpcr的方法，即以菌液為第一次pcr(德國eppendrof公司)擴(kuò)增模版，將凝膠電泳驗(yàn)證后的膠回收(德國eppendrof公司)產(chǎn)物作為第二次pcr擴(kuò)增模版，再以此次膠回收產(chǎn)物為模版進(jìn)行第三次pcr擴(kuò)增。引物依次為f1-r1、f2-r1和f3-r2his，擴(kuò)增并優(yōu)化源于b.subtilisnatto的aprn基因，如圖1。擴(kuò)增引物如表1，組合引物依次為引物依次為f1-r1、f2-r1和f3-r2his，擴(kuò)增體系如表2，擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，94℃變性40s，54℃退火40s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。步驟二：目的基因克隆基因克隆方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。試劑盒回收并純化第三次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物通過ta克隆連到質(zhì)粒pmd19-t。pmd19-t載體連接體系：dna4.5μl，pmd19-t0.5μl，緩沖溶液i5μl，合計(jì)10μl，4℃過夜連接。通過熱激轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)中，涂布amp抗性平板(終濃度100μg/ml)。提取陽性克隆菌落質(zhì)粒dna，通過限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和pcr產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證，將正確的攜帶pmd19-t:aprn的質(zhì)粒菌株置于甘油管-80℃保存。步驟三：重組質(zhì)粒的構(gòu)建及工程菌構(gòu)造pmd19-t：aprn由限制性內(nèi)切酶ecorv和bamhi酶切，切下的aprn基因片段插入pht01的smaⅰ和bamhi酶切位點(diǎn)之間，通過熱激轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)中，涂布amp抗性平板(終濃度100μg/ml)。提取陽性克隆菌落質(zhì)粒dna，通過限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和pcr產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證，將正確的攜帶pht01:aprn的質(zhì)粒菌株置于甘油管-80℃保存。步驟四：工程菌的構(gòu)建及鑒定b.subtilis168的感受態(tài)細(xì)胞制備和電擊轉(zhuǎn)化參考xue的方法。隨機(jī)挑取氯霉素抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落，提取陽性克隆菌落質(zhì)粒dna，通過限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和pcr產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證,將正確的攜帶pht01:aprn的質(zhì)粒菌株置于甘油管-80℃保存。步驟五：納豆激酶工程菌發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)基：20g/l葡萄糖、20g/l酵母提取物、2g/lk2hpo4·3h2o、1g/lmgso4·7h2o，2％甘油和1mm吡啶二羧酸，ph調(diào)至7.0-8.0。取甘油管中工程菌以2％接種量接種于lb培養(yǎng)基(含5μg/ml氯霉素)中，200rpm、37℃過夜培養(yǎng)。以2％接種量將種子液接種于25ml發(fā)酵培養(yǎng)基a中，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)，至od600在0.8-1.0之間，降溫至25℃。接入終濃度為0.5mm的誘導(dǎo)劑iptg，在不同發(fā)酵時(shí)間測(cè)定菌液的od600和nk酶活，如圖8。步驟六：四肽底物法檢測(cè)酶活首先制作對(duì)硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制對(duì)硝基苯胺樣品溶液，濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.06和0.08mmol，在405nm下測(cè)定不同濃度硝基苯胺樣品溶液的吸光值，以水作為空白對(duì)照。發(fā)酵液4℃、8000r/min離心1min，將上清稀釋成不同濃度作為檢測(cè)樣品液。檢測(cè)方法在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上加以改進(jìn)：取100μl樣品稀釋液與50μl終濃度為0.5mm的四肽底物(d-val-leu-lys-對(duì)硝基苯胺)混合并在37℃水浴下反應(yīng)1min，加入75μl50％的冰醋酸終止反應(yīng)，在405nm下測(cè)定反應(yīng)液吸光值。nk活性單位被定義為nk每分鐘釋放1nmol硝基苯胺的含量。實(shí)施例2接種：活化菌種，在37℃、200rpm培養(yǎng)條件下制備一級(jí)種子液和二級(jí)種子液，種齡為12h的二級(jí)種子液按照10％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(氯霉素終濃度為5μg/ml、消泡劑0.01％)。發(fā)酵培養(yǎng)基(1l)：葡萄糖28.5g，甘油57g，酵母提取物60g、吡啶二羧酸0.167g、nh4cl3g、k2hpo4·3h2o1g、mnso4·h2o0.032g、feso4·7h2o0.05g、cocl2·6h2o0.01g、zncl20.01g、mgso4·7h2o2g、cacl2·2h2o5g，補(bǔ)水至1000ml。發(fā)酵：攪拌速率初始設(shè)置為800rpm，通氣量為12l/min。設(shè)置參數(shù)，控制罐內(nèi)溫度為37℃、溶氧量為30％、發(fā)酵液的ph7.0，依據(jù)溶氧情況調(diào)整攪拌速率和通氣量。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：檢測(cè)od600，當(dāng)od600等于10時(shí)降溫至28℃加入終濃度為0.2-1.0mmiptg進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)。補(bǔ)料：補(bǔ)料培養(yǎng)基(1l)：甘油250g，酵母提取物100g，補(bǔ)水至1000ml。連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)，設(shè)置補(bǔ)料程序?yàn)椋喊l(fā)酵3h，od600＝10開始補(bǔ)料，11-14h補(bǔ)料速率為250ml/h補(bǔ)料4h，15-18h再以170ml/h的速率補(bǔ)料4h，19-20h最后以170ml/h的速率補(bǔ)料2h。終止發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)24h后，終止發(fā)酵。經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵20h酶活可達(dá)到7778.02iu/ml(rsd％＝0.8)，od600為173.5±0.85，見圖9。實(shí)施例3發(fā)酵液經(jīng)4℃、9000r/m冷凍離心10min，取上清液；將研細(xì)的(nh4)2so4按照20％的飽和度加入發(fā)酵上清液中，4℃下保存過夜，10000r/m離心30min，棄去沉淀；繼續(xù)向發(fā)酵上清液中加硫酸銨至60％飽和度，4℃下保存過夜，10000r/m離心30min，棄去上清液，回收率達(dá)到72％。實(shí)施例4平衡鎳柱：吸取1ml含鎳填料至純化柱中，先用8倍體積去離子水清洗2遍，再用8倍體積結(jié)合液清洗三次。孵育：結(jié)合液將近流盡時(shí)，加入60ml發(fā)酵上清液，至4℃垂直旋轉(zhuǎn)冰箱孵育4h，帶有histag標(biāo)簽的nk與填料結(jié)合。漂洗：下端排盡未與鎳柱結(jié)合的液體，加入10倍柱體積的漂洗液洗雜蛋白，在冰上垂直反轉(zhuǎn)5min，重復(fù)4次。洗脫：用移液槍吸取1.5ml洗脫液垂直攝入填料正中間將填料充分垂懸，冰上靜置2min，收集流出液。重復(fù)洗脫10次左右。洗脫液采用5kd的超濾管，300g離心，以純水作為稀釋液，以達(dá)到濃縮納豆激酶和除鹽的目的。向濃縮納豆激酶溶液中加入一定濃度冷凍保護(hù)劑，冷凍干燥即制得高純度納豆激酶酶制劑，經(jīng)檢測(cè)納豆激酶酶活達(dá)到981713u/g。表1nk-aprn基因pcr擴(kuò)增引物注：加下劃線和波浪線部分表擴(kuò)增重復(fù)；黑體加粗并加下劃線部分表示酶切位點(diǎn)；斜體加下劃線部分表示加入六個(gè)組氨酸。表2nk-aprn基因pcr擴(kuò)增體系組分體積(μl)基因組dna模板2引物-f1引物-r1dntp210×buffer2.5taqdna聚合酶0.25h2o16.25total25當(dāng)前第1頁12