技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，具體來(lái)說(shuō)是一種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及其制備方法。

背景技術(shù)：
：

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes，lm)是一種營(yíng)細(xì)胞內(nèi)寄生的人畜共患的食源性致病菌，廣泛存在于生鮮或即食食品中。lm可穿透人體的三大屏障——腸道屏障、血腦屏障和胎盤(pán)屏障，導(dǎo)致腸炎、腦膜炎、流產(chǎn)，因此是研究胞內(nèi)寄生菌與宿主之間的相互作用的重要模式菌。在寄生及繁殖的不同階段中，lm有多個(gè)毒力因子來(lái)協(xié)助其進(jìn)行機(jī)體的感染繼而發(fā)揮致病作用，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與lm致病性與毒力相關(guān)因子其中多是表面蛋白或者是分泌蛋白。編碼這些蛋白的毒力基因(hly，plca，plcb，mpl，acta，inla和inlb)主要位于細(xì)菌染色體上的兩個(gè)毒力島上。其中hly基因編碼的溶菌素(listeriolysiono，llo)是一個(gè)主要毒力因子。

llo是一種由529個(gè)氨基酸組成具有溶血活性的成孔蛋白，屬膽固醇依賴(lài)性溶細(xì)胞素家族的成員。它在lm從初級(jí)和次級(jí)吞噬體逃逸中以及在宿主細(xì)胞質(zhì)中的增殖中都起到關(guān)鍵的作用?；趆ly基因在lm致病性中起到的重要作用，構(gòu)建lm的hly缺失減毒菌株不僅對(duì)于研究開(kāi)發(fā)lm減毒疫苗研究等有重要意義。而且，對(duì)于研究llo在細(xì)胞內(nèi)囊泡逃逸過(guò)程及其在lm在細(xì)胞與細(xì)胞間的感染機(jī)理具有一定指導(dǎo)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及其制備方法，所述的這種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及其制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的沒(méi)有合適的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌用于減毒疫苗的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供了一種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，所述的這種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌缺失hly基因。

進(jìn)一步的，所述的基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的保藏編號(hào)為：cctccm2016523。

本發(fā)明還提供了一種疫苗，含有上述的一種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

本發(fā)明還提供了一種抗體，由上述的一種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌免疫產(chǎn)生。

本發(fā)明還提供了上述基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的制備方法，包括如下步驟：

1)分別使用hly5′f、hly5′r、hly3′f和hly3′r引物以egd-e基因組為模板擴(kuò)增hly基因的上游片段p1/p2、下游片段p3/p4；

2)得到的pcr片段電泳后割膠回收，使用酶xbali對(duì)片段進(jìn)行單酶切，并電泳割膠回收，產(chǎn)物使用t4dna連接酶連接，得到的上下游連接產(chǎn)物與pmd19-tvector連接并轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，得到的菌懸液涂布于含100μl/mlamp平板上，37℃培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行pcr鑒定，對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆菌液使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒；

3)將連有同源臂的pmd19-tvector與pksv7質(zhì)粒使用相同的限制性?xún)?nèi)切酶smai和sali進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物使用t4dna連接酶連接并導(dǎo)入lm感受態(tài)細(xì)胞，將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒抽提后進(jìn)行smai和sali限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切，獲得hly基因缺失的lm減毒菌株。

本發(fā)明在構(gòu)建單核細(xì)胞增生李斯特氏菌減毒菌株菌株的過(guò)程中，首先利用同源重組技術(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株egd-e進(jìn)行減毒得到李斯特減毒菌株egd-e△hly。然后并從生長(zhǎng)狀態(tài)、溶血、毒力基因轉(zhuǎn)錄水平、宿主致死率等方面研究hly基因缺失菌株的生物特性，為食源性致病菌lm致病機(jī)理研究提供基礎(chǔ)。

上述構(gòu)建的基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的保藏編號(hào)為：cctccno:m2016523；菌株名稱(chēng)為：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌egd-e(hly基因缺失)listeriamonocytogenesegd-e(hly基因缺失)，保藏日期：2016年9月26日，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址為：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編：430072。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明構(gòu)建的hly基因缺失菌株生長(zhǎng)速率與egd-e無(wú)差異；hly基因缺失后，該缺失菌株與egd-e有顯著性差異，溶血性降低。hly基因敲除還導(dǎo)致inlc和prfa基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，基因plcb，vip的上調(diào)。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，hly基因敲除后的突變菌株毒性下降。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了egd-e△hly的構(gòu)建原理。

圖2顯示了hly上下游片段的克隆圖，其中a為hly5′片段和3′片段的pcr擴(kuò)增結(jié)果；b為5′片段與3′片段連接到pmd-19t后的菌落pcr鑒定結(jié)果。

圖3顯示了pksv7重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果(m：marker)。

圖4顯示了egd-e△hly的鑒定結(jié)果(m：marker；1-9為鑒定菌株，10為陽(yáng)性對(duì)照)。

圖5為egd-e△hly的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果。

圖6為溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果(nc為陰性對(duì)照，pc為陽(yáng)性對(duì)照pc)。

圖7為毒力基因realtime-pcr測(cè)定結(jié)果。

圖8為egd-e△hly與egd-e的毒力測(cè)定結(jié)果，其中a為細(xì)胞侵襲效率；b為小鼠存活率(其中pbs組小鼠存活率始終為100％)。

具體實(shí)施方式

各個(gè)實(shí)驗(yàn)采用的試劑盒用量如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1.基因組dna的去除

2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

realtime-pcr反應(yīng)

實(shí)施例1一種基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的構(gòu)建

挑取egd-e(atccbaa-679)單菌落過(guò)夜搖床培養(yǎng)，使用天根生化科技(北京)有限公司細(xì)菌基因組提取試劑盒(no：dp302-02)獲得egd-e基因組，分別使用hly5′f、hly5′r、hly3′f和hly3′r引物以egd-e基因組為模板擴(kuò)增hly基因的上游片段p1/p2(seqidno.27)、下游片段p3/p4(seqidno.28)。得到的pcr片段電泳后割膠回收，使用酶xbali對(duì)片段進(jìn)行單酶切，并電泳割膠回收。產(chǎn)物使用t4dna連接酶連接，得到的上下游連接產(chǎn)物與pmd19-tvector連接并轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，得到的菌懸液涂布于含100μl/mlamp平板上，37℃培養(yǎng)。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行pcr鑒定，對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆菌液使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。

將上述連有同源臂的pmd19-tvector與pksv7質(zhì)粒使用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶smai和sali進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物使用t4dna連接酶連接并導(dǎo)入lm感受態(tài)細(xì)胞。將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒抽提后進(jìn)行smai和sali限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切鑒定并測(cè)序，測(cè)序過(guò)程由華大基因公司完成，將序列比對(duì)正確的脫鹽質(zhì)粒與lm感受態(tài)混勻，每200μllm(1×1011cfu/ml)感受態(tài)的質(zhì)粒用量約1μg，電轉(zhuǎn)化條件2.25kv/cm，4ms。

電轉(zhuǎn)后將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入3-5ml的bhi培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)約2h，離心收集菌體后涂布于含10μg/mlcam的bhi平板于30℃培養(yǎng)，挑取菌落進(jìn)行鑒定，將含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到bhi(含10μg/mlcam)液體培養(yǎng)基中41℃按1：100連續(xù)轉(zhuǎn)接10次，將末代細(xì)菌培養(yǎng)物劃線于bhi(含10μg/mlcam)平板上41℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取bhi(含10μg/mlcam)平板上的單菌落于bhi液體培養(yǎng)基中30℃連續(xù)培養(yǎng)并按1:100轉(zhuǎn)接8次，取末代培養(yǎng)物劃線于bhi平板，30℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落進(jìn)行pcr鑒定將疑似突變株分別劃線于抗性平板和非抗性平板，含cam的抗性bhi平板上不生長(zhǎng)，無(wú)抗性bhi平板上可生長(zhǎng)的為疑似突變株，對(duì)疑似變株使用引物hlykof、hlykor進(jìn)行鑒定以確定突變株。減毒株egd-e△hly的構(gòu)建原理如圖1所示。

表1引物序列

注：hly5′f和hly5′r為hly基因上游片段引物，hly3′f和hly′r為hly基因下游片段引物；下劃線標(biāo)注酶切位點(diǎn)序列。

對(duì)上述構(gòu)建的基因敲除減毒單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了保藏，保藏編號(hào)為：cctccno:m2016523；菌株名稱(chēng)為：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌egd-e(hly基因缺失)listeriamonocytogenesegd-e(hly基因缺失)，保藏日期：2016年9月26日，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)。

實(shí)施例2對(duì)菌株的鑒定

使用hly5′f、hly5′r、hly3′f、hly3′r(表1)引物擴(kuò)增同源臂p1/p2、p3/p4(序列見(jiàn)seqidno.27和seqidno.28)，連接pmd-19t，pcr鑒定hly(p1/p4)片段與質(zhì)粒pmd-19t的連接；使用smai和sali對(duì)擴(kuò)增得到pmd-19t以及pksv7質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，得到的hly(p1/p4)與酶切后的pksv7連接、鑒定，鑒定為陽(yáng)性的克隆由上海華大基因科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為pksv7-hly(p1/p4)。電轉(zhuǎn)化后利用引物hlykof與hlykor(表1)及涂布無(wú)抗性平板對(duì)突變株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌株命名為egd-e△hly。

實(shí)施例3本發(fā)明菌株的鑒定結(jié)果如下：

1.上下游同源臂的擴(kuò)增及連接pmd-19t鑒定結(jié)果：

使用hly5′和hly3′引物擴(kuò)增同源臂pcr凝膠電泳結(jié)果如圖2a，hly5′片段條帶位置在900bp左右，hly3′片段條帶位置在700左右。按照ncbi上提供的序列，兩個(gè)條帶應(yīng)分別為880bp，724bp，結(jié)果符合預(yù)期。圖2b為hly5′和hly3′片段連接到pmd-19t后導(dǎo)入大腸桿菌的菌落pcr鑒定結(jié)果，共挑取6個(gè)菌落，其中4、5泳道出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，條帶位置與預(yù)期目標(biāo)條帶1604bp相符，說(shuō)明連接成功。

2.重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果：

鑒定實(shí)驗(yàn)使用引物hly5′f和hly3′r，鑒定結(jié)果如圖3，1-4泳道以及6、7泳道有明顯擴(kuò)增條帶，條帶位置在1600bp左右，與理論值為1604bp相符，說(shuō)明hly上下游連接片段hly(p1/p4)已經(jīng)成功插入質(zhì)粒pksv7中。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果也表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3.減毒菌株egd-e△hly的鑒定結(jié)果

使用hly基因上引物hlykof與hlykor，經(jīng)pcr擴(kuò)增、鑒定，hly基因缺失菌株無(wú)擴(kuò)增條帶，而沒(méi)有發(fā)生重組的菌株經(jīng)擴(kuò)增、凝膠電泳會(huì)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的理論值為535bp的條帶。如圖4所示，1、5、9泳道無(wú)擴(kuò)增條帶，其對(duì)應(yīng)的菌株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其中10泳道為陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別涂布于抗性平板和非抗性平板，在含氯霉素的抗性平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，在無(wú)氯霉素抗性的bhi平板上有菌落生長(zhǎng)。

綜合以上鑒定結(jié)果說(shuō)明質(zhì)粒攜帶的外源基因已經(jīng)與自身基因組完成基因重組，且質(zhì)粒已經(jīng)丟失，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為egd-e△hly。

實(shí)施例4

本發(fā)明為考察egd-e△hly基因缺失菌株的生長(zhǎng)狀況變化，以egd-e為對(duì)照測(cè)定了egd-e△hly的生長(zhǎng)曲線。具體方法如下：挑取egd-e與egd-e△hly單菌落于bhi液體培養(yǎng)基中搖床過(guò)夜培養(yǎng)，按1:100轉(zhuǎn)接至裝100ml新鮮bhi培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、200r/min培養(yǎng)，每1h取200μl于酶標(biāo)板中測(cè)定od600光密度值，共記錄12h，得到的數(shù)據(jù)繪制生長(zhǎng)曲線。

測(cè)定結(jié)果如下：如圖5，egd-e△hly突變菌株與egd-e生長(zhǎng)曲線基本重合，前3小時(shí)為生長(zhǎng)初期，后經(jīng)歷對(duì)數(shù)期，并在第10小時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期各時(shí)期的生長(zhǎng)速率無(wú)差異。說(shuō)明hly基因的缺失對(duì)egd-e的生長(zhǎng)不造成影響。

實(shí)施例5

本發(fā)明為考察egd-e△hly缺失菌株的溶血活性變化，對(duì)溶血活性進(jìn)行測(cè)定。具體方法如下：挑取egd-e、egd-e△hly、英諾克李斯特菌(listeriainnocua，li)的單菌落于bhi中培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)早期(od600≈0.6)。將lm培養(yǎng)物5500rmp4℃離心10min。取0.1ml上清液樣品加入到1ml溶血素緩沖液(0.145mol/lnacl，0.02mol/lcacl2)中，并加入0.025ml脫纖維羊血。設(shè)置陰性對(duì)照(negativecontrol,nc)和陽(yáng)性對(duì)照(positivecontrol，pc)，其中將0.1ml培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照，0.1ml1％triton-100x作為陽(yáng)性對(duì)照。將混合物于37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘，5500r/min離心10min。使用分光光度計(jì)測(cè)定上清液的od540值。

如圖6所示，測(cè)定結(jié)果如下：如圖egd-e△hly與egd-e有顯著性差異，溶血性降低。

實(shí)施例6

本發(fā)明為考察hly基因缺失后對(duì)其他毒力基因的影響，使用realtime-pcr方法在轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平對(duì)其他毒力基因進(jìn)行了測(cè)定。具體方法如下：取5ml過(guò)夜培養(yǎng)的egd-e、egd-e△hly菌液中加入1ml預(yù)冷的苯酚乙醇混合液(苯酚：乙醇＝1:9)，冰浴30min；離心收集菌體后加入50μl變?nèi)芫?250u/ml)和50μl溶菌酶(25mg/ml)37℃水浴30min；然后加入1mltrizol，離心后轉(zhuǎn)移上清并加入200μl三氯甲烷，手搖震蕩15s呈乳濁液后室溫放置2min；離心轉(zhuǎn)移上層水相并加入等體積異丙醇后緩慢搖動(dòng)，室溫放置5-10min；離心棄上清后加入1ml75％乙醇清洗沉淀，晾干乙醇，用30-60μldepc水溶解沉淀。獲得的rna根據(jù)takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒(takaracode：drr047a)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cdna(其中包括基因組dna的去除反應(yīng))，以cdna為模板進(jìn)行sybrgreen熒光染料法realtime-pcr。各毒力基因轉(zhuǎn)錄水平變化計(jì)算方法為：以lm的16s核糖體rna為內(nèi)參基因，假設(shè)擴(kuò)增效率統(tǒng)一為100％，各毒力基因的ct值減去內(nèi)參基因16s的ct得到△ct，突變菌株的△ct減去野生型菌株△ct得到△△ct，則各基因相對(duì)表達(dá)量增高了2^-△△ct倍?；蛎Q(chēng)及引物詳細(xì)序列見(jiàn)表2。

表2realtime-pcr引物序列

測(cè)定結(jié)果如下：如圖7，其中hly基因信號(hào)值較低，與對(duì)照組有顯著差異(p<0.001)，驗(yàn)證hly基因成功敲除，同時(shí)hly敲除還導(dǎo)致inlc和prfa基因的下調(diào)，數(shù)值分別降為0.19和0.24，下降了4.2倍和3倍。相反的，基因plcb，vip表現(xiàn)上調(diào)，與對(duì)照組有顯著性差異(p<0.001)，表達(dá)量分別是對(duì)照組的2.8倍和4倍。

實(shí)施例7

本發(fā)明為考察hly基因缺失后毒力變化對(duì)egd-e△hly進(jìn)行了caco-2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)以及小鼠致死率測(cè)定。具體方法如下：1)caco-2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)胰酶消化下的caco-2細(xì)胞，使用含20％fbs的dmem重懸，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)后均勻平鋪12孔板底部，2.0×10⁵cells/孔，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，2.5％co2)過(guò)夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，按moi＝100:1接種于孔板中共培養(yǎng)2h。每孔更換0.5ml200μg/ml含20％fbs的dmem配置的的慶大霉素溶液，于37℃培養(yǎng)箱中30min以清除胞外菌。吸出慶大霉素溶液，使用pbs洗2次，每孔加入1ml1％triton^tmx-100充分吹打，收集于1.5ml無(wú)菌離心管中，稀釋后取100μl涂布于bhi固體培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。2)小鼠致死率測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的egd-e、egd-e△hly離心收集，使用無(wú)菌pbs重懸配置成濃度為10⁷cells/ml菌懸液。3組6-8周齡balb/c小鼠，每組8只，每只腹腔注射200μl菌懸液，其中對(duì)照組注射200μlpbs，每天記錄小鼠死亡狀況。

測(cè)定結(jié)果如下：egd-e△hly缺失菌株細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8a所示，egd-e△hly小鼠致死結(jié)果如圖8b，hly基因敲除后，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的菌落顯著降低，小鼠致死結(jié)果與對(duì)照組(pbs注射組)一致，均未出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象。說(shuō)明hly基因敲除后，egd-e的毒性下降。

實(shí)施例8

毒力因子李斯特菌溶素o(llo)缺失使得lm的菌株毒性降低，安全性提高。使用單核增生性李斯特氏菌hly基因缺失菌株免疫小鼠，2×10⁵cell/只，靜脈注射。感染后7天，檢測(cè)小鼠體內(nèi)的ifn-γ和cd8+t細(xì)胞，結(jié)果顯示ifn-γ量增加，cd8+t細(xì)胞數(shù)量大量增加，說(shuō)明小鼠體內(nèi)的細(xì)胞免疫被激發(fā)。同時(shí)使用野生型egde菌株感染小鼠，小鼠的死亡率降低，說(shuō)明lmδhly可以用于毒性lm引發(fā)的小鼠感染，對(duì)lm具有抗性?；趌mδhly的保護(hù)性免疫，可開(kāi)發(fā)lmδhly用于疫苗載體。

序列表

<110>上海理工大學(xué)

<120>一種基因敲除減毒單增李斯特菌及其制備方法

<160>28

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>hly5′f

<400>1

attcccgggccgcggacatcttttaatgt29

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>hly5′r

<400>2

atttctagatttgttgcgcaattggtaga29

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>hly3′f

<400>3

atttctagacaccacgctttatccgaaat29

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>hly3′r

<400>4

attgtcgacaagctgtccttgctgcaaat29

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>hlykof

<400>5

tgacgaaatggcttacagtg20

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>hlykor

<400>6

aatgggaactcctggtgtt19

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>16s正向引物

<400>7

acatcctttgaccactctgga21

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>16s反向引物

<400>8

caacatctcacgacacgagc20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>prfa正向引物

<400>9

ggctctatttgcggtcaact20

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>prfa反向引物

<400>10

gctatgtgcgatgccactt19

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>hly正向引物

<400>11

cagcattgatttgccaggtat21

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>hly反向引物

<400>12

tcactgtaagccatttcgtca21

<210>13

<211>19

<212>dna

<213>inla正向引物

<400>13

tgtggacggcaaagaaaca19

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>inla反向引物

<400>14

ccaaccaacaaatgtgtgacc21

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>inlb正向引物

<400>15

gcaggcatctacaaacttcca21

<210>16

<211>19

<212>dna

<213>inlb反向引物

<400>16

gccatttcgggcttctcta19

<210>17

<211>22

<212>dna

<213>plca正向引物

<400>17

actacaatggtccgagtgtgaa22

<210>18

<211>21

<212>dna

<213>plca反向引物

<400>18

cagcatactgacgaggtgtga21

<210>19

<211>19

<212>dna

<213>plcb正向引物

<400>19

gcaaatgcctgttgtgatg19

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>plcb反向引物

<400>20

cgtcagtatttgtcgggttatc22

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>acta正向引物

<400>21

aggcggtagaccaacatctg20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>acta反向引物

<400>22

cccgcatttcttgagtgttt20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>srta正向引物

<400>23

cgcagttccatctgtagacg20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>srta反向引物

<400>24

aacgcatagttgttgctcca20

<210>25

<211>18

<212>dna

<213>sigb正向引物

<400>25

tttggattgccgcttacc18

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>sigb反向引物

<400>26

tcgggcgatggactctacta20

<210>27

<211>880

<212>dna

<213>p1/p2序列

<400>27

ccgcggacatcttttaatgtagggattttattgctcgtgtcagttctgggagtagtgtaa60

aaataatctttataaatgttgattagtggttggatccgataatcaaaactatcgttgctg120

ttttgctcgtcttttaaacgcataataatggtttcttttggatttttctttaaaaattga180

gtaatcgtttctaatacacctgaaagtgatgcatttaaaaaaattggcccatggtaaatg240

ttgagattgtcttttgctctaatatcgatgtaccgtattcctgcttctagttgttggtac300

aatgacatcgtttgtgtttgagctagtggtttggttaatgtccatgttatgtctccgtta360

tagctcatcgtatcatgtgtacctggtatagagagcgctgctaggtttgttgtgtcaggt420

agagcggacatccattgttttgtagttacagagttctttattggcttattccagttatta480

agcgaatatgcttttccgcctaatgggaaagtaaaaaagtataaaataaaacagagtaat540

aaaactaatgtgcgttgcaaataattcttatacaaaatggccccctcctttgattagtat600

attcctatcttaaagtgacttttatgttgaggcattaacatttgttaacgacgataaagg660

gacagcaggactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttaga720

agcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcat780

tattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagttttt840

attacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaa880

<210>28

<211>724

<212>dna

<213>p3/p4序列

<400>28

caccacgctttatccgaaatatagtaataaagtagataatccaatcgaataattgtaaaa60

gtaataaaaaattaagaataaaaccgcttaacacacacgaaaaaataagcttgttttgca120

ctcttcgtaaattattttgtgaagaatgtagaaacaggcttattttttaatttttttaga180

agaattaacaaatgtaaaagaatatctgactgtttatccatataatataagcatatccca240

aagtttaagccacctatagtttctactgcaaaacgtataatttagttcccacatatacta300

aaaaacgtgtccttaactctctctgtcagattagttgtaggtggcttaaacttagtttta360

cgaattaaaaaggagcggtgaaatgaaaagtaaacttatttgtatcatcatggtaatagc420

ttttcaggctcatttcactatgacggtaaaagcagattctgtcggggaagaaaaacttca480

aaataatacacaagccaaaaagacccctgctgatttaaaagctttgccagattcctgcga540

agcaaaagatttttataaaaattttaaaattcttgatatgacaaaagataagctaggcgt600

tacgcattatacgctcgcgctaagttctggtggttacttgaccgataatgatgaaatcaa660

ggtccacgtcacaccggataataaaatcactttcataaatggagatttgcagcaaggaca720

gctt724