（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物催化劑制備l-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備l-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的方法。

（二）

背景技術(shù)：

l-抗壞血酸-2-葡萄糖苷,即2-o-α-d-吡喃型葡萄糖基-l-抗壞血酸（2-o-α-d-glucopyranosyl-l-ascorbidacid，aa-2g），是由日本林原生物化學(xué)研究所與岡山大學(xué)藥學(xué)系年共同發(fā)現(xiàn)的一種的l-抗壞血酸（即維生素c）的葡萄糖苷衍生物（j.biochem.107,222-227(1990)；agric.biol.chem.,54(7),1697-1703（1990）；us5084563（1992））。它具有抗壞血酸的生理活性，同時(shí)由于l-抗壞血酸的2位c上的羥基以α-1，4糖苷鍵與葡萄糖相連接形成穩(wěn)定的穩(wěn)定的糖苷鍵，顯著降低l-抗壞血酸的還原性，穩(wěn)定性大大提高。目前，aa-2g主要應(yīng)用于化妝品行業(yè)，具有抗uv、抑制黑色素等美白功效作用。

日本學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)aa-2g時(shí)，是采用來(lái)源于根霉屬或毛霉屬的a-葡萄糖苷酶（ec3.2.1.20，α-glucosidase）作為催化劑劑，但是aa-2g產(chǎn)物濃度極低，后來(lái)發(fā)現(xiàn)使用源自嗜熱脂肪芽孢桿菌（bacillusstearothermophilus）的環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（ec2.4.1.19，cyclomaltodextringlucanotransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)cgtase）作為催化劑，以環(huán)糊精和l-抗壞血酸為原料制備aa-2g，轉(zhuǎn)化率提高至45%（agric.biol.chem.,55(7),1751-1756,1991）。后來(lái)陸續(xù)報(bào)道一些其他糖基轉(zhuǎn)移酶也能以相應(yīng)糖基供體（如麥芽糖、低聚糊精、淀粉等）和l-抗壞血酸及鈉鹽為原料來(lái)生物催化合成aa-2g。所以，目前所報(bào)道的aa-2g生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（ec3.2.1.20，α-glucosidase）（us3763009（1973））、環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（ec2.4.1.19，cyclomaltodextringlucanotransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)cgtase）（us5084563（1992）、us5137723（1992）、和us5407812（1995）、us9265781b2（2016））、α-淀粉酶（ec3.2.1.1，α-amylase）、蔗糖磷酸化酶（ec2.4.1.7，sucrosephosphorylas）（biotechnollett29:611–615，2007）、葡聚糖蔗糖酶（ec2.4.1.5，dextransucrase）（microbiologicalresearch165：384-391，2010）、α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶（us20060216792（2006）、us8759030（2014）和cn201510179664（2015））等6類(lèi)酶。

目前aa-2g工業(yè)化生產(chǎn)上采用cgtase為生物催化劑，但是采用路線(xiàn)還存在以下不足之處：

一是生產(chǎn)所用的cgtase酶為商業(yè)化酶制劑，而不是采用最為直接的cgtase發(fā)酵液或者含cgtase酶的菌體細(xì)胞，究其原因是目前cgtase發(fā)酵酶活力普遍不高，酶活力低無(wú)法滿(mǎn)足制備aa-2g的酶活要求；另外，若采用cgtase發(fā)酵液或菌體為催化劑，則需要經(jīng)菌體破碎、濃縮等操作步驟達(dá)到制備aa-2g的酶活要求。

二是除生成目標(biāo)產(chǎn)物aa-2g外，還會(huì)生成一系列的二糖、三糖、四糖以及五糖等多糖基衍生物，還需額外添加a-糖化酶進(jìn)行水解多糖基衍生物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物aa-2g，增加工藝步驟。

三是糖基供體環(huán)糊精水溶性差、價(jià)格高等缺陷，不利于轉(zhuǎn)化，原料成本高。

四是生成10%左右的aa-5g（5-o-α-d-吡喃型葡萄糖基-l-抗壞血酸）和aa-6g（6-o-α-d-吡喃型葡萄糖基-l-抗壞血酸）混合副產(chǎn)物（us5272136（1993），us5468850（1995）），不利于后續(xù)分離純化。盡管后來(lái)美國(guó)專(zhuān)利us20060216792（2006）和us8759030（2014）報(bào)道了為了避免cgtase催化反應(yīng)中形成aa-5g和aa-6g副產(chǎn)物，采用來(lái)源于球狀節(jié)桿菌（arthrobacterglobiformisa19）α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶為催化劑制備aa-2g，但酶源不易獲得。

基于上述存在不足之處，我們使用蔗糖磷酸酶作為生物催化劑來(lái)制備aa-2g，因?yàn)椴捎谜崽橇姿崦缸鳛榇呋瘎幸韵聝?yōu)勢(shì)潛力：

一是蔗糖磷酸化酶（spase）分布廣泛，存在于絕大多數(shù)細(xì)菌等微生物中，發(fā)酵酶活高，不需采用商業(yè)用酶制劑或者菌體破壁、濃縮處理，可以直接使用發(fā)酵液或菌體作為生物催化劑。

二是蔗糖磷酸化酶采用蔗糖為糖基供體，原料易溶于水，而且價(jià)廉易得。

三是產(chǎn)物單一，反應(yīng)產(chǎn)物主要為aa-2g和果糖，不需額外添加糖化酶處理。

四是反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)溫度為30-37℃，熱能耗較低。

（三）

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于目前aa-2g工業(yè)化生產(chǎn)上存在的不足之處，以及目前所報(bào)道的采用蔗糖磷酸化酶制備aa-2g的不成熟現(xiàn)況，提供了一種制備l-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的方法，其采用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建新的蔗糖磷酸化酶高產(chǎn)工程菌株，采用該重組工程菌株生物催化制備aa-2g，產(chǎn)物單一，收率高，不需額外添加糖化酶處理，生產(chǎn)成本低。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種重組蔗糖磷酸化酶的工程菌株，其特殊之處在于：重組蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏號(hào)為：cctccm2016496，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。

蔗糖磷酸化酶dna人工序列：

taattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatca50

tcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggcta100

gcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccatgaaaaacaaagt150

gcagctcatcacatacgccgatcgtctcggcgatggcactcttagctcga200

tgaccgacatcctgcgcacccgcttcgacggcgtgtatgacggcgtgcat250

atcctgccgttcttcactccgttcgatggtgcggatgcaggcttcgaccc300

gatcgaccataccaaagtcgacgaacgtctcggcagctgggacgacgtc350

gccgaactctccaagacccacaacatcatggtcgacgccatcgtcaacca400

catgagttgggaatccaagcagttccaagacgtgcttgaaaaaggtgag450

gaatccgagtattacccgatgttcctgaccatgagctccgtcttcccgaa500

cggcgccaccgaagaagacctggccggcatctaccgcccgcgcccgggc550

ctgccgttcacccactacaagttcgccggcaagacgcgcttggtctgggt600

gagcttcaccccgcagcaggtggacatcgacactgattccgccaagggtt650

gggaatacctgatgtcgatcttcgatcagatggccgccagccacgtgcgc700

tacatccgtctcgacgccgtgggctacggcgccaaggaagccggcacca750

gctgcttcatgacccccaagacctttaagctcatctcccgtctgcgcgag800

gagggcgtcaagcgcggccttgaaatcctcatcgaggttcacagctacta850

caagaagcaggtggaaatcgcctccaaggtggaccgcgtctacgatttc900

gccctgccgccgctgcttctgcactcgctgttcaccggtcacgtcgaacc950

cgtggcccactggaccgagatccgcccgaacaacgccgtcaccgtgctc1000

gatacgcacgatggcatcggcgtgatcgacatcggctccgaccagctcg1050

accgctccctcaagggcctcgtgcccgacgaggacgtcgacaacctggtc1100

aacaccatccatgccaacacccacggcgaatcccaggccgccaccggtg1150

ccgccgcgtccaacctcgacctctaccaggtcaactccacgtactactcg1200

gccctcggctgcaacgaccagcactacttggccgcccgcgccgtgcagtt1250

cttcctgccgggcgtgccgcaggtctactacgtgggcgcgctcgccggcc1300

gcaacgacatggaactgctgcgccgcaccaacaacggccgcgacatcaa1350

ccgccactactactccaccgccgaaatcgatgaaaacctcgaacgcccg1400

gtggtcaaggccctgaacgccctggccaagttccgcaacgaactgcctgc1450

attcgatggcgagttcagctacgaggtcgatggcgacacgtccatcacct1500

tccgctggaccgccgccgacggcacgtccacggccgccctcaccttcgag1550

cccggacgcggcctcggcacagacaacgccaccccggttgccagccttgc1600

ctggagcgatgccgccggcgaccacgaaacccgcgatctgctcgccaacc1650

cgccgattgccgatatcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccac1700

caccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaa1738。

蔗糖磷酸化酶prt序列：

mknkvqlityadrlgdgtlssmtdilrtrfdgvydgvhilpfftpfdgadagfdpidhtkvderlgswddvaelskthnimvdaivnhmsweskqfqdvl100

ekgeeseyypmfltmssvfpngateedlagiyrprpglpfthykfagktrlvwvsftpqqvdidtdsakgweylmsifdqmaashvryirldavgygake200

agtscfmtpktfklisrlreegvkrgleilievhsyykkqveiaskvdrvydfalpplllhslftghvepvahwteirpnnavtvldthdgigvidigsd300

qldrslkglvpdedvdnlvntihanthgesqaatgaaasnldlyqvnstyysalgcndqhylaaravqfflpgvpqvyyvgalagrndmellrrtnngrd400

inrhyystaeidenlerpvvkalnalakfrnelpafdgefsyevdgdtsitfrwtaadgtstaaltfepgrglgtdnatpvaslawsdaagdhetrdlla500

nppiadid508。

一種重組蔗糖磷酸化酶的大腸菌株工程菌株制備l-抗壞血酸葡萄糖苷（aa-2g）的方法，采用以下步驟：

a、將源自長(zhǎng)雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶編碼基因進(jìn)行克隆表達(dá)，構(gòu)建重組蔗糖磷酸化酶的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，采用以下步驟：

a1、蔗糖磷酸化酶克隆菌株的構(gòu)建，包括以下步驟：

a1.1、將凍存的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)傳代2次，以該菌液為dna模板，并以ncbi上長(zhǎng)雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶基因序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物，然后進(jìn)行pcr、瓊脂凝膠分離純化回收獲得目標(biāo)基因dna片段。

a1.2、將獲得的目標(biāo)基因dna片段和pet28a(+)質(zhì)粒構(gòu)建雙酶切反應(yīng)體系，經(jīng)bamhⅰ和hindⅲ雙酶切后，再經(jīng)凝膠回收，最后經(jīng)dna連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。

a1.3、將將構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌trans5α感受態(tài)細(xì)胞中形成轉(zhuǎn)化克隆菌株pet28a(+)-spase，再經(jīng)驗(yàn)證獲得目標(biāo)重組質(zhì)粒。

a2、蔗糖磷酸化酶表達(dá)菌株的構(gòu)建，包括以下步驟：

a2.1、將含目標(biāo)重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌株于lb培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再經(jīng)提取獲得目標(biāo)重組質(zhì)粒。

a2.2、將提取獲得的目標(biāo)重組質(zhì)粒與感受態(tài)的大腸桿菌bl21(de3)表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)平板分離獲得克隆菌落，再經(jīng)pcr驗(yàn)證獲得目標(biāo)蔗糖磷酸化酶表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)，

a3、采用pcr定點(diǎn)突變技術(shù)，其步驟包括突變位點(diǎn)氨基酸的突變引物設(shè)計(jì)，然后進(jìn)行突變質(zhì)?？寺【甑臉?gòu)建、突變質(zhì)粒表達(dá)菌株的構(gòu)建，再經(jīng)pcr驗(yàn)證獲得定點(diǎn)突變陽(yáng)性表達(dá)菌株，該菌株于2016年9月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctccm2016496，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，名稱(chēng)為大腸桿菌pct28a（+）-spase，escherichiacolipet28a（+）-spase。

b、將采用重組蔗糖磷酸化酶的大腸桿菌工程菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)所得蔗糖磷酸化酶為生物催化劑，以蔗糖為糖基供體，l-抗壞血酸為糖基受體，進(jìn)行生物催化制備aa-2g，采用以下步驟：

b1、將獲得重組蔗糖磷酸化酶的大腸桿菌工程菌株接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行蔗糖磷酸化酶發(fā)酵生產(chǎn)獲得含重組蔗糖磷酸化酶的催化劑。

b2、將含重組蔗糖磷酸化酶的催化劑與緩沖液進(jìn)行混合，然后加入蔗糖和l-抗壞血酸原料，再調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph值，最后在一定轉(zhuǎn)化溫度下進(jìn)行生物催化合成aa-2g。

進(jìn)一步：

步驟a1蔗糖磷酸化酶克隆菌株構(gòu)建中：

將凍存的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)傳代n次，以該菌液為dna模板，以ncbi上長(zhǎng)雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶基因序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物：

正向引物(spase-bam-f):

5’cgcggatccatgaaaaacaaagtgcagctcatc3’

反向引物(spase-hind-r):

5’cccaagcttgtcgatatcggcaatcgg3’

然后進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件為：92-98℃預(yù)變性0.5-2min，然后20-40個(gè)循環(huán)（92-98℃5-15s，49℃～64℃10-15s，68-75℃18-25s），68-75℃再延伸3-7min；

pcr反應(yīng)完畢后，經(jīng)進(jìn)行凝膠回收、驗(yàn)證和純化pcr反應(yīng)后的產(chǎn)物以及pet28a(+)質(zhì)粒的dna溶液組成bamhⅰ和hindⅲ雙酶切反應(yīng)體系進(jìn)行酶切修飾，酶切條件為32-42℃溫度下酶切反應(yīng)2-7min，然后進(jìn)行回收酶切產(chǎn)物，然后與含dna連接酶的溶液混合均勻，再10-20℃循環(huán)水浴中反應(yīng)過(guò)夜；

dna過(guò)夜連接完畢后，將10μl連接產(chǎn)物全部加入45-55μl剛?cè)诨拇竽c桿菌trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后置于冰上冰浴20-50min；然后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，35-45℃熱激80-95sec；隨后取出轉(zhuǎn)化混合物置于冰上1-3min后，于超凈臺(tái)中加入480-520μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至32-42℃、100-300rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇0.5-2小時(shí)；分別取80-120μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在兩個(gè)卡那霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板上，32-42℃恒溫培養(yǎng)10-24h；在轉(zhuǎn)化后的兩個(gè)平板上各挑單克隆菌落，至1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，32-42℃、100-300rpm恒溫?fù)u5-12h，以該菌液作為pcr模板進(jìn)行pcr驗(yàn)證，進(jìn)行驗(yàn)證陽(yáng)性克隆獲得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase；

步驟a2蔗糖磷酸化酶表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)的構(gòu)建中，

選取陽(yáng)性克隆菌液，接種于5ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，32-42℃、100-300rpm恒溫?fù)u菌8-20h后提取重組質(zhì)粒，然后分別取,0.5-1.5μl重組質(zhì)粒和0.5-1.5μlpet28a(+)質(zhì)粒加入兩管50μl剛?cè)诨拇竽c桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自百捷生物公司）中，混勻后置于冰上冰浴10-25min；隨后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，38-45℃熱激10-30s，再?gòu)暮銣厮″佒腥〕鲛D(zhuǎn)化混合物置于冰上1-3min后，于超凈臺(tái)中分別加入480-520μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至32-42℃、100-300rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇30-60min；取180-220μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在含90-110μg/ml的卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板上，32-42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-20h，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)平板的菌落情況，若pet28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的平板上的菌落生長(zhǎng)情況良好則可說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作無(wú)誤差，挑取實(shí)驗(yàn)組平板上的n個(gè)單克隆菌落至n個(gè)1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，于32-42℃、100-300rpm恒溫?fù)u菌8-20h后進(jìn)行菌液pcr驗(yàn)證獲得陽(yáng)性表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)。

步驟b1重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶，種子培養(yǎng)基組成為酵母浸粉1-3%、蛋白胨0.2-0.7%、氯化鈉0.05-0.15%、七水硫酸鎂0.002-0.007%、磷酸二氫鉀0.02-0.07%、磷酸氫二鈉0.10-0.20%、蔗糖0.18-0.32%、氯化鈣0.001-0.003%、7水硫酸鋅0.0005-0.0015%、七水硫酸亞鐵0.001-0.003%。然后在溫度28-36℃、轉(zhuǎn)速150-300rpm條件下振蕩培養(yǎng)14-25小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為0.8-1.2%比例接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為酵母浸粉2.0-4.0%、蛋白胨0.20-0.30%、氯化鈉0.4-0.6%、七水硫酸鎂0.005-0.015%、磷酸二氫鉀0.20-0.30%、磷酸氫二鈉0.48-0.60%、氯化鈣0.005-0.015%、蔗糖0.28-0.41%、甘油0.20-0.30%、乳糖0.10-0.20%。在發(fā)酵溫度為28-36℃、轉(zhuǎn)速150-300rpm條件下振蕩培養(yǎng)36-52小時(shí)，然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)5-20min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

步驟b1重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度28-36℃、轉(zhuǎn)速150-300rpm條件下振蕩培養(yǎng)15-35小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為4-6%比例接入裝有6l實(shí)施例3所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。在發(fā)酵溫度為28-36℃、轉(zhuǎn)速400-600rpm、罐壓0.03-0.06mpa、通氣量為7-8.5l/（min.l）條件下通氣攪拌培養(yǎng)18-28小時(shí)，發(fā)酵液od600nm達(dá)到35～45，然后開(kāi)始流加1200ml補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為酵母浸粉4.0-6.0%、蛋白胨0.5-1.5%、甘油7-13%、乳糖1.8-3.1%、蔗糖45-55%、磷酸二氫鉀0.3-0.7%、氯化鈣0.1-0.3%，流加速度75-85ml/min，連續(xù)流加10-20小時(shí)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液至ph4-7.0。流加完畢，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24-35小時(shí)后，終止發(fā)酵。然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)5-20min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

步驟b2中，所用緩沖體系為檸檬酸三鈉緩沖體系，其中，檸檬酸三鈉濃度為20～60mm，ph值為4.0～6.5，蔗糖濃度為60～120g/l，l-抗壞血酸濃度15～30g/l。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用基因重組和定點(diǎn)突變技術(shù)，將來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶編碼基因通過(guò)pet28a(+)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，構(gòu)建重組蔗糖磷酸化酶的工程菌株（保藏號(hào)：cctccm2016496）。以發(fā)酵所得菌體細(xì)胞為生物催化劑，在檸檬酸三鈉緩沖液體系中，以蔗糖和l-抗壞血酸為原料制備aa-2g。本發(fā)明直接采用蔗糖為糖基供體，原料易溶于水，而且價(jià)廉易得。同時(shí)產(chǎn)物單一，反應(yīng)產(chǎn)物主要為aa-2g，收率高達(dá)65%，不需額外添加糖化酶處理，生產(chǎn)成本低。

（四）具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1、蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase的構(gòu)建

將凍存的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)傳代2次，以該菌液為dna模板。以ncbi上長(zhǎng)雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶基因序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物：

正向引物(spase-bam-f):5’cgcggatccatgaaaaacaaagtgcagctcatc3’

反向引物(spase-hind-r):5’cccaagcttgtcgatatcggcaatcgg3’

然后進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，然后30個(gè)循環(huán)（95℃10s，49℃～64℃12s，72℃22s），72℃再延伸5min。

蔗糖磷酸化酶的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)采用設(shè)計(jì)不同的突變引物并進(jìn)行上述的pcr反應(yīng)。

pcr反應(yīng)完畢后，經(jīng)進(jìn)行凝膠回收、驗(yàn)證和純化pcr反應(yīng)后的產(chǎn)物以及pet28a(+)質(zhì)粒的dna溶液組成bamhⅰ和hindⅲ（購(gòu)于takara生物技術(shù)有限公司）雙酶切反應(yīng)體系進(jìn)行酶切修飾，酶切條件為37℃溫度下酶切反應(yīng)5min，然后進(jìn)行回收酶切產(chǎn)物，然后與含dna連接酶的溶液混合均勻，再16℃循環(huán)水浴中反應(yīng)過(guò)夜。

dna過(guò)夜連接完畢后，將10μl連接產(chǎn)物全部加入50μl剛?cè)诨拇竽c桿菌trans5α感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自百捷生物公司）中，混勻后置于冰上冰浴30min；然后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，42℃熱激90sec；隨后取出轉(zhuǎn)化混合物置于冰上2min后，于超凈臺(tái)中加入500μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至37℃、200rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇1小時(shí)；分別取100μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在兩個(gè)卡那霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板上，37℃恒溫培養(yǎng)16h；在轉(zhuǎn)化后的兩個(gè)平板上各挑單克隆菌落，至1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm恒溫?fù)u8h，以該菌液作為pcr模板進(jìn)行pcr驗(yàn)證，進(jìn)行驗(yàn)證陽(yáng)性克隆獲得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase。

實(shí)施例2、蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase的構(gòu)建

將凍存的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)傳代2次，以該菌液為dna模板。以ncbi上長(zhǎng)雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶基因序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物：

正向引物(spase-bam-f):5’cgcggatccatgaaaaacaaagtgcagctcatc3’

反向引物(spase-hind-r):5’cccaagcttgtcgatatcggcaatcgg3’

然后進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件：92℃預(yù)變性2min，然后40個(gè)循環(huán)（92℃10s，49℃～64℃10s，68℃25s），68℃再延伸7min。

蔗糖磷酸化酶的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)采用設(shè)計(jì)不同的突變引物并進(jìn)行上述的pcr反應(yīng)。

pcr反應(yīng)完畢后，經(jīng)進(jìn)行凝膠回收、驗(yàn)證和純化pcr反應(yīng)后的產(chǎn)物以及pet28a(+)質(zhì)粒的dna溶液組成bamhⅰ和hindⅲ（購(gòu)于takara生物技術(shù)有限公司）雙酶切反應(yīng)體系進(jìn)行酶切修飾，酶切條件為32℃溫度下酶切反應(yīng)7min，然后進(jìn)行回收酶切產(chǎn)物，然后與含dna連接酶的溶液混合均勻，再10℃循環(huán)水浴中反應(yīng)過(guò)夜。

dna過(guò)夜連接完畢后，將10μl連接產(chǎn)物全部加入45μl剛?cè)诨拇竽c桿菌trans5α感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自百捷生物公司）中，混勻后置于冰上冰浴50min；然后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，35℃熱激80sec；隨后取出轉(zhuǎn)化混合物置于冰上3min后，于超凈臺(tái)中加入480μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至32℃、300rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇2小時(shí)；分別取80μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在兩個(gè)卡那霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板上，32℃恒溫培養(yǎng)24h；在轉(zhuǎn)化后的兩個(gè)平板上各挑單克隆菌落，至1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，32℃、300rpm恒溫?fù)u12h，以該菌液作為pcr模板進(jìn)行pcr驗(yàn)證，進(jìn)行驗(yàn)證陽(yáng)性克隆獲得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase。

實(shí)施例3、蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase的構(gòu)建

將凍存的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)傳代2次，以該菌液為dna模板。以ncbi上長(zhǎng)雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶基因序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物：

正向引物(spase-bam-f):5’cgcggatccatgaaaaacaaagtgcagctcatc3’

反向引物(spase-hind-r):5’cccaagcttgtcgatatcggcaatcgg3’

然后進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性0.5min，然后20個(gè)循環(huán)（98℃15s，49℃～64℃15s，75℃18s），75℃再延伸3min。

蔗糖磷酸化酶的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)采用設(shè)計(jì)不同的突變引物并進(jìn)行上述的pcr反應(yīng)。

pcr反應(yīng)完畢后，經(jīng)進(jìn)行凝膠回收、驗(yàn)證和純化pcr反應(yīng)后的產(chǎn)物以及pet28a(+)質(zhì)粒的dna溶液組成bamhⅰ和hindⅲ（購(gòu)于takara生物技術(shù)有限公司）雙酶切反應(yīng)體系進(jìn)行酶切修飾，酶切條件為42℃溫度下酶切反應(yīng)2min，然后進(jìn)行回收酶切產(chǎn)物，然后與含dna連接酶的溶液混合均勻，再20℃循環(huán)水浴中反應(yīng)過(guò)夜。

dna過(guò)夜連接完畢后，將10μl連接產(chǎn)物全部加入55μl剛?cè)诨拇竽c桿菌trans5α感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自百捷生物公司）中，混勻后置于冰上冰浴20min；然后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，45℃熱激95sec；隨后取出轉(zhuǎn)化混合物置于冰上1min后，于超凈臺(tái)中加入520μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至42℃、100rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇0.5小時(shí)；分別取120μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在兩個(gè)卡那霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板上，42℃恒溫培養(yǎng)10h；在轉(zhuǎn)化后的兩個(gè)平板上各挑單克隆菌落，至1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，42℃、100rpm恒溫?fù)u5h，以該菌液作為pcr模板進(jìn)行pcr驗(yàn)證，進(jìn)行驗(yàn)證陽(yáng)性克隆獲得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pet28a(+)-spase。

實(shí)施例4、蔗糖磷酸化酶表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)的構(gòu)建

選取陽(yáng)性克隆菌液，接種于5ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm恒溫?fù)u菌14h后提取重組質(zhì)粒。然后分別取1μl重組質(zhì)粒和1μlpet28a(+)質(zhì)粒加入兩管50μl剛?cè)诨拇竽c桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自百捷生物公司）中，混勻后置于冰上冰浴15min；隨后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，42℃熱激20s，再?gòu)暮銣厮″佒腥〕鲛D(zhuǎn)化混合物置于冰上2min后，于超凈臺(tái)中分別加入500μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至37℃、200rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇45min；取200μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在含100μg/ml的卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)平板的菌落情況，若pet28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的平板上的菌落生長(zhǎng)情況良好則可說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作無(wú)誤差。挑取實(shí)驗(yàn)組平板上的12個(gè)單克隆菌落至12個(gè)1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm恒溫?fù)u菌14h后進(jìn)行菌液pcr驗(yàn)證獲得陽(yáng)性表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)。

對(duì)陽(yáng)性表達(dá)酶蛋白的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列見(jiàn)附錄1。

實(shí)施例5、蔗糖磷酸化酶表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)的構(gòu)建

選取陽(yáng)性克隆菌液，接種于5ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，32℃、300rpm恒溫?fù)u菌20h后提取重組質(zhì)粒。然后分別取0.5μl重組質(zhì)粒和0.5μlpet28a(+)質(zhì)粒加入兩管50μl剛?cè)诨拇竽c桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自百捷生物公司）中，混勻后置于冰上冰浴10min；隨后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，38℃熱激30s，再?gòu)暮銣厮″佒腥〕鲛D(zhuǎn)化混合物置于冰上3min后，于超凈臺(tái)中分別加入520μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至32℃、300rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇60min；取180μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在含90μg/ml的卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板上，32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h。觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)平板的菌落情況，若pet28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的平板上的菌落生長(zhǎng)情況良好則可說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作無(wú)誤差。挑取實(shí)驗(yàn)組平板上的12個(gè)單克隆菌落至12個(gè)1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，于32℃、300rpm恒溫?fù)u菌20h后進(jìn)行菌液pcr驗(yàn)證獲得陽(yáng)性表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)。

對(duì)陽(yáng)性表達(dá)酶蛋白的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列見(jiàn)附錄1。

實(shí)施例6、蔗糖磷酸化酶表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)的構(gòu)建

選取陽(yáng)性克隆菌液，接種于5ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，42℃、100rpm恒溫?fù)u菌8h后提取重組質(zhì)粒。然后分別取1.5μl重組質(zhì)粒和1.5μlpet28a(+)質(zhì)粒加入兩管50μl剛?cè)诨拇竽c桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自百捷生物公司）中，混勻后置于冰上冰浴25min；隨后將其快速轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋中，45℃熱激10s，再?gòu)暮銣厮″佒腥〕鲛D(zhuǎn)化混合物置于冰上1min后，于超凈臺(tái)中分別加入480μl無(wú)菌的無(wú)抗lb培養(yǎng)基，放至42℃、100rpm恒溫?fù)u床中復(fù)蘇30min；取220μl復(fù)蘇后的菌液均勻地涂布在含110μg/ml的卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板上，42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h。觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)平板的菌落情況，若pet28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的平板上的菌落生長(zhǎng)情況良好則可說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作無(wú)誤差。挑取實(shí)驗(yàn)組平板上的12個(gè)單克隆菌落至12個(gè)1ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中，于42℃、100rpm恒溫?fù)u菌14h后進(jìn)行菌液pcr驗(yàn)證獲得陽(yáng)性表達(dá)菌株pet28a(+)-spase-bl21(de3)。

對(duì)陽(yáng)性表達(dá)酶蛋白的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列見(jiàn)附錄1。

實(shí)施例7、重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶，種子培養(yǎng)基組成為酵母浸粉2.0%、蛋白胨0.5%、氯化鈉0.1%、七水硫酸鎂0.005%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸氫二鈉0.15%、蔗糖0.25%、氯化鈣0.002%、7水硫酸鋅0.001%、七水硫酸亞鐵0.002%。然后在溫度32℃、轉(zhuǎn)速220rpm條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為1%比例接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為酵母浸粉3.0%、蛋白胨0.25%、氯化鈉0.5%、七水硫酸鎂0.01%、磷酸二氫鉀0.25%、磷酸氫二鈉0.54%、氯化鈣0.01%、蔗糖0.35%、甘油0.25%、乳糖0.15%。在發(fā)酵溫度為32℃、轉(zhuǎn)速220rpm條件下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)10min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

實(shí)施例8、重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶，種子培養(yǎng)基組成為酵母浸粉1.0%、蛋白胨0.7%、氯化鈉0.05%、七水硫酸鎂0.007%、磷酸二氫鉀0.02%、磷酸氫二鈉0.20%、蔗糖0.18%、氯化鈣0.003%、7水硫酸鋅0.0005%、七水硫酸亞鐵0.003%。然后在溫度28℃、轉(zhuǎn)速300rpm條件下振蕩培養(yǎng)14小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為0.8%比例接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為酵母浸粉2.0%、蛋白胨0.30%、氯化鈉0.4%、七水硫酸鎂0.015%、磷酸二氫鉀0.20%、磷酸氫二鈉0.60%、氯化鈣0.005%、蔗糖0.41%、甘油0.20%、乳糖0.20%。在發(fā)酵溫度為28℃、轉(zhuǎn)速300rpm條件下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)20min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

實(shí)施例9、重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶，種子培養(yǎng)基組成為酵母浸粉3.0%、蛋白胨0.2%、氯化鈉0.15%、七水硫酸鎂0.002%、磷酸二氫鉀0.07%、磷酸氫二鈉0.10%、蔗糖0.32%、氯化鈣0.001%、7水硫酸鋅0.0015%、七水硫酸亞鐵0.001%。然后在溫度36℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)25小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為1.2%比例接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為酵母浸粉4.0%、蛋白胨0.20%、氯化鈉0.6%、七水硫酸鎂0.005%、磷酸二氫鉀0.30%、磷酸氫二鈉0.48%、氯化鈣0.015%、蔗糖0.28%、甘油0.30%、乳糖0.10%。在發(fā)酵溫度為36℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)52小時(shí)，然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)5min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

實(shí)施例10、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例7所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度32℃、轉(zhuǎn)速220rpm條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為5%比例接入裝有6l實(shí)施例7所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。在發(fā)酵溫度為32℃、轉(zhuǎn)速500rpm、罐壓0.05mpa、通氣量為7.5l/（min.l）條件下通氣攪拌培養(yǎng)24小時(shí)，發(fā)酵液od600nm達(dá)到35～45，然后開(kāi)始流加1200ml補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為酵母浸粉5.0%、蛋白胨1.0%、甘油10%、乳糖2.5%、蔗糖50%、磷酸二氫鉀0.5%、氯化鈣0.2%，流加速度80ml/min，連續(xù)流加15小時(shí)，流加中通過(guò)20%氨水來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液至ph6.5。流加完畢，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)30小時(shí)后，終止發(fā)酵。然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)10min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

實(shí)施例11、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例7所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度28℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)15小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為4%比例接入裝有6l實(shí)施例7所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。在發(fā)酵溫度為28℃、轉(zhuǎn)速400rpm、罐壓0.03mpa、通氣量為8.5l/（min.l）條件下通氣攪拌培養(yǎng)18小時(shí)，發(fā)酵液od600nm達(dá)到35～45，然后開(kāi)始流加1200ml補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為酵母浸粉4.0%、蛋白胨1.5%、甘油7%、乳糖3.1%、蔗糖45%、磷酸二氫鉀0.7%、氯化鈣0.1%，流加速度85ml/min，連續(xù)流加20小時(shí)，流加中通過(guò)20%氨水來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液至ph4.5。流加完畢，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)35小時(shí)后，終止發(fā)酵。然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)5min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

實(shí)施例12、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例7所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度36℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)35小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為6%比例接入裝有6l實(shí)施例7所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。在發(fā)酵溫度為36℃、轉(zhuǎn)速400rpm、罐壓0.06mpa、通氣量為7l/（min.l）條件下通氣攪拌培養(yǎng)18小時(shí)，發(fā)酵液od600nm達(dá)到35～45，然后開(kāi)始流加1200ml補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為酵母浸粉6.0%、蛋白胨0.5%、甘油13%、乳糖1.8%、蔗糖55%、磷酸二氫鉀0.3%、氯化鈣0.3%，流加速度75ml/min，連續(xù)流加10小時(shí)，流加中通過(guò)20%氨水來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液至ph7。流加完畢，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)后，終止發(fā)酵。然后通過(guò)離心機(jī)4000轉(zhuǎn)20min離心收集含蔗糖磷酸化酶的菌體漿狀物，該漿狀物即可作為生物催化劑。

實(shí)施例13、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例8所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度32℃、轉(zhuǎn)速220rpm條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為5%比例接入裝有6l實(shí)施例8所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。其他與實(shí)施例10相同。

實(shí)施例14、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例8所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度28℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)15小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為4%比例接入裝有6l實(shí)施例8所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。其他與實(shí)施例11相同。

實(shí)施例15、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例8所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度36℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)35小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為6%比例接入裝有6l實(shí)施例8所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。其他與實(shí)施例12相同。

實(shí)施例16、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例9所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度32℃、轉(zhuǎn)速220rpm條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為5%比例接入裝有6l實(shí)施例9所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。其他與實(shí)施例10相同。

實(shí)施例17、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例9所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度28℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)15小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為4%比例接入裝有6l實(shí)施例9所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。其他與實(shí)施例11相同。

實(shí)施例18、重組菌株進(jìn)行10l罐發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶

將pet28a(+)-spase-bl21(de3)表達(dá)菌株斜面菌體接入裝有300ml實(shí)施例9所提到種子培養(yǎng)基的2000ml三角瓶，然后在溫度36℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下振蕩培養(yǎng)35小時(shí)至菌液od600nm達(dá)到20～25后，然后按接種比為6%比例接入裝有6l實(shí)施例9所提到發(fā)酵培養(yǎng)基的10l罐中進(jìn)行放大發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶。其他與實(shí)施例12相同。

實(shí)施例19、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取10g實(shí)施例7所收集的菌體漿狀物，加80ml50mm檸檬酸三鈉溶液將菌體漿狀物重新分散制成菌體懸浮液，然后依次加入7.5克蔗糖和2克l-抗壞血酸，一邊加入一邊攪拌使原料溶解完全，再用50mm檸檬酸三鈉溶液定容至100ml，再用0.5m鹽酸調(diào)節(jié)ph值5.5，然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶，用三層玻璃紙封口，再置于振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為35℃、轉(zhuǎn)速120rpm，反應(yīng)24h，取樣測(cè)定轉(zhuǎn)化液中aa-2g濃度為22.3g/l,轉(zhuǎn)化率58%。aa-2g的測(cè)定方法采用hplc法，測(cè)定條件如下：

流動(dòng)相：50mm磷酸二氫鉀溶液（ph3.0，用三氟乙酸調(diào)節(jié)）：甲醇=95：5；流速：0.4ml/min；色譜柱：kromasil100-5c18(250×4.6mm)；波長(zhǎng)：238nm；柱溫：25℃。

實(shí)施例20、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取10g實(shí)施例7所收集的菌體漿狀物，加80ml20mm檸檬酸三鈉溶液將菌體漿狀物重新分散制成菌體懸浮液，然后依次加入6.0克蔗糖和1.5克l-抗壞血酸，一邊加入一邊攪拌使原料溶解完全，再用20mm檸檬酸三鈉溶液定容至100ml，再用0.5m鹽酸調(diào)節(jié)ph值6.5，然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶，用三層玻璃紙封口，再置于振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為28℃、轉(zhuǎn)速220rpm，反應(yīng)30h，取樣測(cè)定轉(zhuǎn)化液中aa-2g,轉(zhuǎn)化率56%。aa-2g的測(cè)定方法采用hplc法，測(cè)定條件如下：

流動(dòng)相：50mm磷酸二氫鉀溶液（ph3.0，用三氟乙酸調(diào)節(jié)）：甲醇=95：5；流速：0.4ml/min；色譜柱：kromasil100-5c18(250×4.6mm)；波長(zhǎng)：238nm；柱溫：25℃。

實(shí)施例21、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取10g實(shí)施例7所收集的菌體漿狀物，加80ml60mm檸檬酸三鈉溶液將菌體漿狀物重新分散制成菌體懸浮液，然后依次加入12.0克蔗糖和3克l-抗壞血酸，一邊加入一邊攪拌使原料溶解完全，再用60mm檸檬酸三鈉溶液定容至100ml，再用0.5m鹽酸調(diào)節(jié)ph值4.0，然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶，用三層玻璃紙封口，再置于振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為42℃、轉(zhuǎn)速200rpm，反應(yīng)15h，取樣測(cè)定轉(zhuǎn)化液中aa-2g轉(zhuǎn)化率64%。aa-2g的測(cè)定方法采用hplc法，測(cè)定條件如下：

流動(dòng)相：50mm磷酸二氫鉀溶液（ph3.0，用三氟乙酸調(diào)節(jié)）：甲醇=95：5；流速：0.4ml/min；色譜柱：kromasil100-5c18(250×4.6mm)；波長(zhǎng)：238nm；柱溫：25℃。

實(shí)施例22、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取10g實(shí)施例8所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例20相同。

實(shí)施例23、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取10g實(shí)施例9所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例21相同。

實(shí)施例24、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例10所收集的菌體漿狀物，加2l50mm檸檬酸三鈉溶液將菌體漿狀物重新分散制成菌體懸浮液，然后依次加入300克蔗糖和75克l-抗壞血酸，一邊加入一邊攪拌使原料溶解完全，再用50mm檸檬酸三鈉溶液定容至3l，再用0.5m鹽酸調(diào)節(jié)ph值5.5，然后轉(zhuǎn)入5l生物催化反應(yīng)釜，反應(yīng)溫度為35℃、轉(zhuǎn)速120rpm條件下進(jìn)行生物催化制備aa-2g。轉(zhuǎn)化過(guò)程，為了保持反應(yīng)體系ph能夠維持在5.5，采用0.5m鹽酸或0.5m氫氧化鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)。若轉(zhuǎn)化體系ph值高于5.5時(shí)，采用0.5m鹽酸溶液來(lái)調(diào)節(jié)；若低于5.5時(shí)，則采用0.5m氫氧化鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化24h時(shí)，取樣測(cè)定轉(zhuǎn)化液中aa-2g濃度為31.2g/l,轉(zhuǎn)化率約65%。

實(shí)施例25、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例10所收集的菌體漿狀物，加2l20mm檸檬酸三鈉溶液將菌體漿狀物重新分散制成菌體懸浮液，然后依次加入180克蔗糖和45克l-抗壞血酸，一邊加入一邊攪拌使原料溶解完全，再用20mm檸檬酸三鈉溶液定容至3l，再用0.5m鹽酸調(diào)節(jié)ph值6.5，然后轉(zhuǎn)入5l生物催化反應(yīng)釜，反應(yīng)溫度為28℃、轉(zhuǎn)速100rpm條件下進(jìn)行生物催化制備aa-2g。轉(zhuǎn)化過(guò)程，為了保持反應(yīng)體系ph能夠維持在6.5，采用0.5m鹽酸或0.5m氫氧化鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)。若轉(zhuǎn)化體系ph值高于6.5時(shí)，采用0.5m鹽酸溶液來(lái)調(diào)節(jié)；若低于6.5時(shí)，則采用0.5m氫氧化鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化30h時(shí)，取樣測(cè)定轉(zhuǎn)化液中aa-2轉(zhuǎn)化率約64%。

實(shí)施例26、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例10所收集的菌體漿狀物，加2l60mm檸檬酸三鈉溶液將菌體漿狀物重新分散制成菌體懸浮液，然后依次加入360克蔗糖和90克l-抗壞血酸，一邊加入一邊攪拌使原料溶解完全，再用60mm檸檬酸三鈉溶液定容至3l，再用0.5m鹽酸調(diào)節(jié)ph值4.0，然后轉(zhuǎn)入5l生物催化反應(yīng)釜，反應(yīng)溫度為41℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下進(jìn)行生物催化制備aa-2g。轉(zhuǎn)化過(guò)程，為了保持反應(yīng)體系ph能夠維持在4.0，采用0.5m鹽酸或0.5m氫氧化鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)。若轉(zhuǎn)化體系ph值高于4.0時(shí)，采用0.5m鹽酸溶液來(lái)調(diào)節(jié)；若低于4.0時(shí)，則采用0.5m氫氧化鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化15h時(shí)，取樣測(cè)定轉(zhuǎn)化液中aa-2g轉(zhuǎn)化率約71%。

實(shí)施例27、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例11所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例25相同。

實(shí)施例28、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例12所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例26相同。

實(shí)施例29、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例13所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例24相同。

實(shí)施例30、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例14所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例25相同。

實(shí)施例31、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例15所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例26相同。

實(shí)施例32、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例16所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例24相同。

實(shí)施例30、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例17所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例25相同。

實(shí)施例31、生物催化合成aa-2g

稱(chēng)取300g實(shí)施例18所收集的菌體漿狀物，其他與實(shí)施例26相同。

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<110>山東格得生物科技有限公司

<120>制備l-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的方法

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<110>山東格得生物科技有限公司

<120>一種重組蔗糖磷酸化酶的工程菌株制備l-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的方法

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