本發(fā)明涉及細胞分離技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種外周血單個核細胞的分離方法。

背景技術(shù)：

在臨床研究中，針對特定細胞的功能學(xué)和生物學(xué)特性的檢查常常依賴細胞的分離技術(shù)，從外周血以及機體各種體液，例如胸水、腹水中分離單個核細胞是體外進行淋巴細胞免疫學(xué)研究和細胞學(xué)實驗的重要前提。

目前熱門的細胞免疫治療療法是引領(lǐng)未來疾病治療的新技術(shù)，該療法需要采集人體自身免疫細胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)使其擴增，再經(jīng)過基因工程改造、特殊培養(yǎng)等處理后，使這些細胞具有增強免疫、殺死病原體和腫瘤細胞、促進組織器官再生和機體康復(fù)等治療功效，從而達到治療疾病的目的。該療法具有療效良好、副作用小、個性化等獨特的優(yōu)勢，為癌癥、血液病、心血管病、糖尿病、老年癡呆癥等疾病提供了良好的治療效果，在未來治療中必將擔當重要角色。其中，外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，簡稱pbmc)是參與機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的一類重要免疫細胞群。pbmc主要包含淋巴細胞和單核細胞，其中淋巴細胞占比80％～90％，淋巴細胞包括t淋巴細胞和b淋巴細胞兩大類，它們根據(jù)其表面標記物和功能不同又可以分為不同的細胞亞群，按標記物的不同，t淋巴細胞有cd3+、cd4+、cd8+、cd45+細胞等亞群，按細胞功能的不同，還有輔助t細胞(helpertcells,th)、效應(yīng)t細胞(effectortcells,te)和細胞毒性t細胞(cytotoxictcells,tc)等等；b淋巴細胞有b1、b2兩種亞型。單核細胞占比10％～20％，單核細胞能吞噬異物產(chǎn)生抗體，在機體損傷治愈、抗御病原的入侵和對疾病的免疫方面起著重要的作用。因此，對不同淋巴細胞亞群分離、鑒別以及進行功能研究對疾病診斷乃至治療都具有十分重要的臨床意義。

現(xiàn)階段，分離外周血單個核細胞的方法主要有黏附法、免疫磁珠分離法、流式細胞分離法以及經(jīng)典的ficoll-hypaque密度梯度離心法。

黏附法的細胞回收率除了與選擇的吸附材料有關(guān)外，還與分離時輸入細胞的流速有關(guān)；此方法有操作麻煩，分離純度不高，回收率低。免疫磁珠分離法應(yīng)用的是抗原抗體結(jié)合的原理分離細胞，這種方法具有分離純度高的特點，細胞回收率也高；但是，免疫磁珠分離得到的淋巴細胞的效果和活力受磁珠的種類和抗體的影響，而且成本也很高。流式細胞分離法是20世紀70年代發(fā)展起來的細胞鑒定和分選技術(shù)，該技術(shù)集激光術(shù)、計算技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)于一體，通過流式細胞儀來實現(xiàn)；流式細胞分離技術(shù)已經(jīng)較為成熟，可以同時檢測細胞中dna的含量、細胞體積、細胞膜受體以及表面抗原、細胞所處周期等許多生物信息；但是，流式細胞術(shù)分選細胞的成本較高，分離過程中也會對細胞造成損傷，從而影響細胞的活性。另外，流式細胞分離法無法進行無菌操作，這使得經(jīng)流式細胞分選的細胞不宜再做培養(yǎng)方面的研究。

上述免疫磁珠分離法和流式細胞分離法分離的淋巴細胞對分離樣本是有選擇的，通常這兩種方法使用的樣本均是進行過密度梯度離心獲得的混合淋巴細胞，這也是上述兩種方法可獲得較高純度的細胞的重要原因。因此，外周血單個核細胞最適用的分離方法是ficoll-hypaque密度梯度離心法，但此方法依然存在比如對細胞損傷大、細胞得率低、分離過程中容易受到干擾等問題有待進一步解決。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種外周血單個核細胞的分離方法，以解決現(xiàn)有的密度梯度離心法對細胞損傷大、細胞得率低且不適宜臨床應(yīng)用、分離過程中易受干擾的技術(shù)問題。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種外周血單個核細胞的分離方法，包括以下步驟：(1)將外周血與杜氏磷酸緩沖液混勻得到稀釋后的外周血；將淋巴細胞分離液裝于離心管中并遮光保存；(2)傾斜裝有所述淋巴細胞分離液的離心管，使所述淋巴細胞分離液的液面與水平面呈50°～70°角；將所述步驟(1)中得到的稀釋后的外周血沿所述離心管的側(cè)壁加入到所述淋巴細胞分離液中得到混合液；所述稀釋后的外周血與所述淋巴細胞分離液的體積比為1～2：1；(3)將所述步驟(2)中裝有混合液的所述離心管放置在水平離心機中離心分離并取白膜層，即得到所述外周血單個核細胞層。

進一步地，所述步驟(1)中外周血與杜氏磷酸緩沖液的體積比為1：1。

進一步地，所述步驟(2)中將稀釋后的外周血加入到所述淋巴細胞分離液中時，所述淋巴細胞分離液的液面與水平面呈60°角。

進一步地，所述步驟(2)中稀釋后的外周血與所述淋巴細胞分離液的體積比為3：2。

進一步地，所述步驟(3)中離心分離的轉(zhuǎn)速為450～600g；所述離心分離的時間為20～30min。

進一步地，所述步驟(3)中離心分離的轉(zhuǎn)速為500g；所述離心分離的時間為25min。

進一步地，所述外周血單個核細胞分離的操作溫度為20℃。

進一步地，所述淋巴細胞分離液包括ficoll400和泛影葡胺鈉，所述淋巴細胞分離液在20℃時的密度為1.077g/ml。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述分離方法分離得到的外周血單個核細胞，對所述外周血單個核細胞培養(yǎng)后進行流式細胞分析，得到所述外周血單個核細胞的活性為96％～98％。

進一步地，將上述分離方法分離得到的所述外周血單個核細胞與杜氏磷酸緩沖液混勻，于水平離心機離心分離，得到細胞沉淀；將所述細胞沉淀中加入所述杜氏磷酸緩沖液，吹打混勻得到細胞懸液進行細胞計數(shù)。

進一步地，所述細胞計數(shù)的方法為吸取所述細胞懸液和濃度為0.4％的臺盼藍溶液混勻，檢測細胞活力。

進一步地，將所述細胞懸液置入離心機中，20℃、500g轉(zhuǎn)速下離心，得到細胞沉淀，向所述細胞沉淀中加入含10％胎牛血清的rpmi1640細胞培養(yǎng)基，混勻，置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的外周血單個核細胞的分離方法，對現(xiàn)有的密度梯度離心法進行了改進，操作簡單，適合大量樣本的分離；并能夠?qū)崿F(xiàn)無菌操作，分離得到的外周血單個核細胞適宜臨床應(yīng)用；對分離的外周血單個核細胞的損傷很小，細胞得率高，分離過程中也不會受到干擾。

2、本發(fā)明分離方法分離得到的外周血單個核細胞，可用于腫瘤免疫療法中對大規(guī)模血液單個核細胞的需求；可以提供同一個包含大量個體的單個核細胞，該方法分離的血液細胞純度以及活性較高；可進行二次篩選，直接用于針對t淋巴細胞以及b淋巴細胞的治療性研究。

除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。下面將參照圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明優(yōu)選實施例的外周血中不同組分的比重示意圖；

圖2是本發(fā)明優(yōu)選實施例的外周血中分離的單個核細胞示意圖；

圖3是本發(fā)明優(yōu)選實施例中核算染料propidiumiodide(pi)測定活細胞數(shù)目的數(shù)據(jù)圖；

圖4是本發(fā)明優(yōu)選實施例的單個核細胞中五種亞型細胞的流式分群圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進行詳細說明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。

本發(fā)明提供了一種外周血單個核細胞的分離方法，包括以下步驟：(1)將外周血與杜氏磷酸緩沖液混勻得到稀釋后的外周血；將淋巴細胞分離液裝于離心管中并遮光保存；(2)傾斜裝有淋巴細胞分離液的離心管，使淋巴細胞分離液的液面與水平面呈50°～70°角；將步驟(1)中得到的稀釋后的外周血沿離心管的側(cè)壁加入到淋巴細胞分離液中得到混合液；稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液的體積比為1～2：1；(3)將步驟(2)中裝有混合液的離心管放置在水平離心機中離心分離并取白膜層，即得到外周血單個核細胞層。

上述步驟中，設(shè)置稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液的體積比為1～2：1，更有選的，稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液的體積比為3：2，是經(jīng)過大量摸索而得到的，能夠提高細胞得率。步驟(2)中將稀釋后的外周血加入到淋巴細胞分離液中時，控制淋巴細胞分離液的液面與水平面呈50°～70°角，可以較大限度地保護兩者的交界面不被沖破。

本發(fā)明的外周血單個核細胞的分離方法，對現(xiàn)有的密度梯度離心法進行了改進，操作簡單，適合大量樣本的分離；并能夠?qū)崿F(xiàn)無菌操作，分離得到的外周血單個核細胞適宜臨床應(yīng)用；對分離的外周血單個核細胞的損傷很小，細胞得率高，分離過程中也不會受到干擾。

優(yōu)選的，步驟(1)中外周血與杜氏磷酸緩沖液的體積比為1：1。采用此體積比，外周血與杜氏磷酸緩沖液能夠更加充分地混合，從而也有助于稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液的混合。

優(yōu)選的，步驟(2)中將稀釋后的外周血加入到淋巴細胞分離液中時，淋巴細胞分離液的液面與水平面呈60°角?？刂屏馨图毎蛛x液的液面與水平面呈60°角，可以最大限度地保護稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液的交界面不被沖破。

優(yōu)選的，步驟(2)中稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液的體積比為3：2。采用上述體積比時，細胞得率最高。

優(yōu)選的，步驟(3)中離心分離的轉(zhuǎn)速為450～600g；離心分離的時間為20～30min。更優(yōu)選的，步驟(3)中離心分離的轉(zhuǎn)速為500g；離心分離的時間為25min。步驟(3)在進行離心時，采用上述離心轉(zhuǎn)速，標準規(guī)范，對細胞的損傷較小。

優(yōu)選的，外周血單個核細胞分離的操作溫度為20℃。嚴格設(shè)置操作環(huán)境的溫度為20℃，以使淋巴細胞分離液與杜氏磷酸緩沖液的效果發(fā)揮到最大，減少細胞損傷。

優(yōu)選的，淋巴細胞分離液包括ficoll400和泛影葡胺鈉，淋巴細胞分離液在20℃時的密度為1.077g/ml。采用上述淋巴細胞分離液，可以為細胞提供一個合適的滲透壓以及低的細胞毒性，從而使分離得到的單個核細胞具有較高的純度以及細胞活率。

本發(fā)明還提供了上述分離方法分離得到的外周血單個核細胞，對外周血單個核細胞培養(yǎng)后進行流式細胞分析，得到外周血單個核細胞的活性為96％～98％。

本發(fā)明分離方法分離得到的外周血單個核細胞，可用于腫瘤免疫療法中對大規(guī)模血液單個核細胞的需求；可以提供同一個包含大量個體的單個核細胞，該方法分離的血液細胞純度以及活性較高；可進行二次篩選，直接用于針對t淋巴細胞以及b淋巴細胞的治療性研究。

優(yōu)選的，將上述分離方法分離得到的外周血單個核細胞與杜氏磷酸緩沖液混勻，于水平離心機離心分離，得到細胞沉淀；將細胞沉淀中加入杜氏磷酸緩沖液，吹打混勻得到細胞懸液進行細胞計數(shù)。采用上述方法可以對分離得到的外周血單個核細胞層進行細胞計數(shù)。

優(yōu)選的，細胞計數(shù)的方法為吸取細胞懸液和濃度為0.4％的臺盼藍溶液混勻，檢測細胞活力。

優(yōu)選的，上述分離得到的外周血單個核細胞的培養(yǎng)方法：將細胞懸液置入離心機中，20℃、500g轉(zhuǎn)速下離心，得到細胞沉淀，向細胞沉淀中加入含10％胎牛血清的rpmi1640細胞培養(yǎng)基，混勻，置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用上述方法培養(yǎng)分離得到的外周血單個核細胞，培養(yǎng)24小時后，可以在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及活性。

實施例

以下各實施例中使用的試劑均為市售。

實施例1

本發(fā)明的優(yōu)選實施例公開了一種外周血單核細胞的分離方法，包括以下步驟：

(1)在分離細胞前，將生物安全柜、超凈臺滅菌，并分裝淋巴細胞分離液于離心管中，淋巴細胞分離液包括ficoll400和泛影葡胺鈉，淋巴細胞分離液在20℃時的密度為1.077g/ml；用錫箔紙包住離心管以達到避光的效果。分離細胞的當天采集血樣即新鮮外周血，用醫(yī)用抗凝管采集10支，6ml/支，共計60ml。采集的血樣置于室溫運輸，保證1小時內(nèi)送至實驗室。實驗室相關(guān)人員接到血樣后，立即做好登記工作并立即進行傳染病“術(shù)前四項檢查”，使用病毒表面抗原聯(lián)合檢測試劑盒檢測，包括乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒的相關(guān)病原學(xué)檢查，一旦發(fā)現(xiàn)血樣攜帶病原體，則應(yīng)立即銷毀。如果以上四項均為陰性結(jié)果，則可用于單個核細胞的分離實驗。在分離細胞前，可先將血樣進行離心，收集少許血清以便后續(xù)用于質(zhì)量檢驗。圖1為所采集的外周血中不同組分的比重情況。

(2)將血樣平均分到4支50ml離心管中，每管含有15ml血樣，將杜氏磷酸緩沖液(簡稱dpbs)與上述新鮮外周血以1：1的比例充分混勻得到稀釋后的外周血。

(3)傾斜裝有淋巴細胞分離液的離心管，使傾斜后分離液的液面與水平界面呈60°夾角。使用一次性3ml巴氏吸管吸取稀釋后的外周血，沿著淋巴細胞分離液的離心管側(cè)壁小心滴加到淋巴細胞分離液中得到混合液，注意不要沖破兩者的交界面。分別將4支離心管中的稀釋后的外周血均滴加到淋巴細胞分離液中，稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液的體積比為3：2。

(4)設(shè)置水平離心機模式為慢升慢降，室溫20℃下，離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為500g，將上述4支離心管置于離心機中離心25min。離心結(jié)束后，緩慢取出離心管，小心吸棄上清(血漿層)，輕緩吸取中間白膜層于新的離心管中，即為外周血單個核細胞層。

(5)將上述分離得到的外周血單個核細胞層與dpbs緩沖液混勻，設(shè)置離心機模式為正常升降速條件，室溫20℃下，設(shè)置離心轉(zhuǎn)速為500g，離心8min。離心結(jié)束后，小心吸棄上清，并向下層細胞沉淀中加入合適體積的dpbs緩沖液，充分吹打混勻后得到細胞懸液進行細胞計數(shù)。計數(shù)方法：吸取20ul細胞懸液與20ul0.4％臺盼藍溶液混勻，檢測細胞活力。

(6)剩余的細胞懸液置入離心機中，正常升降速條件，20℃、500g轉(zhuǎn)速下離心8min，得到細胞沉淀。向上述細胞沉淀中加入含10％胎牛血清的rpmi1640細胞培養(yǎng)基，混勻，置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，可以在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及活性，如圖2所示。

(7)取適量上述培養(yǎng)24小時后的外周血單個核細胞，進行流式細胞分析，通過流式細胞分析對細胞的活性、單個核細胞中的各個亞型進行檢測。

針對細胞活性的分析，選用核酸染料propidiumiodide(pi)對活細胞數(shù)目進行測定，本實施例分離所得細胞的活性為97.9％，如圖3所示。本實施例還針對cd3+、cd8+、cd14+、cd19+、cd56+五種細胞亞型進行了分析，如圖4所示。

實施例2

本優(yōu)選實施例與實施例1大致相同，區(qū)別在于，將稀釋后的外周血加入到淋巴細胞分離液中時，淋巴細胞分離液的液面與水平面呈50°角；稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液混合時的體積比為1：1；離心分離時，離心機的轉(zhuǎn)速設(shè)置為450g，離心時間為30min。

上述分離得到的外周血單個核細胞，培養(yǎng)24小時后，進行流式細胞分析，分離所得細胞的活性為96.5％。

實施例3

本優(yōu)選實施例與實施例1大致相同，區(qū)別在于，將稀釋后的外周血加入到淋巴細胞分離液中時，淋巴細胞分離液的液面與水平面呈70°角；稀釋后的外周血與淋巴細胞分離液混合時的體積比為2：1；離心分離時，離心機的轉(zhuǎn)速設(shè)置為600g，離心時間為20min。

上述分離得到的外周血單個核細胞，培養(yǎng)24小時后，進行流式細胞分析，分離所得細胞的活性為97％。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。