呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病研究領(lǐng)域，特別是涉及一種呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖 譜模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸衰竭（Respiratory failure，RF)是氣體交換功能嚴(yán)重障礙導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng) 紊亂的臨床綜合征。通常情況下，呼吸衰竭的臨床評(píng)估指標(biāo)是指在海平大氣壓下，動(dòng)脈血氧 分壓（PaO 2) <8kPa(60mmHg)，或伴有二氧化碳分壓（PaCO2) >6. OkPa (45mmHg)。呼吸系統(tǒng) 包括肺和呼吸栗。由肺部引起的各種疾病導(dǎo)致的肺功能障礙會(huì)造成低血氧癥（I型呼吸衰 竭），而呼吸栗功能障礙會(huì)導(dǎo)致高碳酸血癥（II型呼吸衰竭）。
[0003] 有必要對(duì)呼吸衰竭的致病機(jī)理進(jìn)行研究，以尋找新的分子靶點(diǎn)和治療方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜 模型的構(gòu)建方法。
[0005] -種呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0006] 設(shè)置疾病組與健康對(duì)照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血單 個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本；
[0007] 分別根據(jù)外周血單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本獲取細(xì)胞總蛋白；
[0008] 將所述細(xì)胞總蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)酶解后，用相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽標(biāo)記，得 到具有相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽多重標(biāo)記的多肽；
[0009] 將得到的多肽經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反相液相色譜分離，再進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析和相對(duì) 定量分析，選擇超過(guò)預(yù)設(shè)閾值的表達(dá)顯著差異蛋白，得到所述呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞 蛋白質(zhì)圖譜模型。
[0010] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，采用二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜分析。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述質(zhì)譜分析的電離源為電噴霧電離源。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述細(xì)胞總蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)酶解前，還包括：將所述細(xì)胞總 蛋白進(jìn)行SDS電泳。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，采用濃度為12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS電泳。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，加入胰蛋白裂解酶將所述細(xì)胞總蛋白酶解。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞總蛋白與胰蛋白裂解酶的質(zhì)量比20 :1。
[0016] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞總蛋白與胰蛋白裂解酶的質(zhì)量比22 :1。
[0017] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述預(yù)設(shè)閾值為超過(guò)一個(gè)預(yù)設(shè)正常范圍的最大值、以及小 于所述預(yù)設(shè)正常范圍的最小值。
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析和相對(duì)定量分析之后，還選取超過(guò)0. 67 至1.50范圍的結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。
[0019] 上述構(gòu)建方法應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)能較好的進(jìn)行呼吸衰竭的差異蛋白 組學(xué)分析，能夠一次性篩選出824種與呼吸衰竭相關(guān)的差異蛋白，并能對(duì)其進(jìn)行定性及相 對(duì)定量，對(duì)篩選出的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，還能了解其參與的生物學(xué)過(guò)程及代謝 通路，為呼吸衰竭的發(fā)病機(jī)制提供新的線索，且篩選得到的顯著表達(dá)差異的蛋白有望成為 潛在的呼吸衰竭生物標(biāo)志物。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜模型的構(gòu)建方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明 的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā) 明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不 違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
[0022] 本實(shí)施例提供了一種呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜模型的構(gòu)建方法，其 具體包括如下步驟：
[0023] 設(shè)置疾病組與健康對(duì)照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血單 個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本；分別對(duì)各所述外周血單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞總蛋白抽提和蛋白濃度測(cè) 定；將所述細(xì)胞總蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)酶解后，用相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽標(biāo)記，得到具有 相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽多重標(biāo)記的多肽；將得到的多肽經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反相液 相色譜分離，再進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析和相對(duì)定量分析，選擇超過(guò)預(yù)設(shè)閾值的表達(dá)顯著差異蛋 白，得到所述呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜模型。例如，所述呼吸衰竭單個(gè)核細(xì) 胞蛋白質(zhì)圖譜模型，包括分類號(hào)為 gi I 58257696、gi 1182443、gi 1193244949、gi I 62088878、 gi I 229959、gi I 284521122 及 gi I 28332 的表達(dá)上調(diào)蛋白及分類號(hào)為 gi I 809369、 gi I 431896311、gi I 406717976、gi I 206581665 及 gi 1122939159 的表達(dá)下調(diào)蛋白。
[0024] 下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)呼吸衰竭外周血單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜模型 的構(gòu)建方法作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0025] 例如，米用如下主要試劑：Triton X-100 (Amersham Biosciences)，Strata-X 33u (Phenomenex)，BCA蛋白試劑盒（Pierce)，三乙基碳酸氫銨緩沖液（Sig-ma-Aldrich)， ZipTip槍頭和超純水（Millipore)，8種不同同位素標(biāo)記的iTRAQ試劑（Applied Biosystems)，質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶膠體金（Promega)。其中，iTRAQ(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)，同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)）試劑及使用 是ABI公司的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)，使用該技術(shù)可以對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋 白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定。
[0026] 下面，采用兩組全血標(biāo)本對(duì)本方法進(jìn)行說(shuō)明，全血標(biāo)本包括5名呼吸衰竭患者（疾 病組）和5名健康人群（健康對(duì)照組），標(biāo)本均來(lái)自深圳市人民醫(yī)院，標(biāo)本采集時(shí)間為2013 年4月至2013年10月。RF組呼吸衰竭患者均是通過(guò)病理診斷及臨床標(biāo)準(zhǔn)確診的II型呼吸 衰竭，包括4名女性和1名男性，平均年齡為35. 22歲（28-45歲），而健康對(duì)照組在種族、年 齡和性別上均與RF組相匹配，見(jiàn)表1。標(biāo)本收集的方案與執(zhí)行均獲得深圳市人民醫(yī)院倫理 委員會(huì)的批準(zhǔn)。
[0027] 表1呼吸衰竭標(biāo)本特征（η = 5)
[0029] 操作流程如圖1所示，具體說(shuō)明如下。
[0030] 首先準(zhǔn)備樣品，將人體外周血單個(gè)核細(xì)胞分離，例如采用密度梯度離心法或細(xì)胞 比重法等分離人體外周血單個(gè)核細(xì)胞，例如采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人 體外周血單個(gè)核細(xì)胞；又如采低滲鹽水法、氯化銨溶紅細(xì)胞法等分離人體外周血單個(gè)核細(xì) 胞。下面示例說(shuō)明分離步驟如下：
[0031] (1)、收集肝素抗凝全血約5mL，用等量的PBS (Phosphate buffer saline，磷酸鹽 緩沖液）稀釋，將稀釋后的血液輕置于分離液的上層，并于22°C、14, OOOrpm條件下離心 IOmin ；
[0032] (2)、棄掉上層血漿，吸取中間層的單個(gè)核細(xì)胞置于另一試管中，加入5mlPBS，混 勾，洗滌，然后于22°C、14, OOOrpm條件下離心5min ;
[0033] (3)、棄掉上清液，重復(fù)步驟（2) -次；
[0034] (4)、棄上清液，將管底的細(xì)胞沉淀懸浮于100 μ L的PBS中，用血球計(jì)數(shù)板在顯微 鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)入I. 5mL的EP管中備用，并置于-80°C保存。
[0035] 然后測(cè)定細(xì)胞總蛋白抽提和蛋白濃度，下面給出一個(gè)具體的實(shí)例。
[0036] (1)、加入適量蛋白裂解液溶解，例如，按I X IO6個(gè)細(xì)胞加入約100 μ L蛋白裂解液 的比例加入，然后分別加入lmmol PMSF(苯甲基磺酰氟）和2mmol的EDTA(乙二胺四乙酸 二鈉），反應(yīng)5分鐘后加入IOmmol的DTT (二巰基蘇糖醇），接著進(jìn)行15min的超聲，然后在 25, OOOrpm條件下離心20min，取上清液。上清液中加入5倍體積的預(yù)冷丙酮，即預(yù)冷丙酮 的體積為上清液的5倍，例如將丙酮預(yù)冷至-20至-5攝氏度，轉(zhuǎn)移至-20°C靜置沉淀2h，然 后在16, OOOrpm條件下離心20min，棄上清。取適量沉淀重復(fù)以上步驟后，將沉淀在200 μ L 0. 5mol的TEAB (四乙基溴化銨）中超聲溶解15min，然后在25, OOOrpm的條件下離心20min 后，取上清液用于定量。
[0037] (2)、采用BCA蛋白定量試劑盒，以BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白） 為標(biāo)準(zhǔn)品，制定BSA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)備0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μ L的標(biāo)準(zhǔn)品量 (0. 2 μ g/ μ L BSA)，然后添加純水至最終體積為20 μ L。將0 μ L作為空白對(duì)照，然后把樣品 的上清液稀釋一定倍數(shù)至測(cè)量范圍內(nèi)，每個(gè)樣品各取20 μ L至管中，再分別加入180 μ L的 蛋白測(cè)試試劑，混勻后置于室溫lOmin。然后在595nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線得出樣品濃度。
[0038] 然后進(jìn)行SDS電泳，例如，配置12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，將樣品分別與4倍體 積的loading buffer混勾，然后置于95°C下加熱5min，分別吸取30 μ g的樣品以及10 μ g 的Marker在濃度為12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠下電泳120min，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán) 染液染色2h，再置于脫色液中脫色3-5次。優(yōu)選的，電泳結(jié)束后，在30至36攝氏度環(huán)境下， 用考馬斯亮藍(lán)染液染色2h。例如，通過(guò)水浴方式，在30至36攝氏度環(huán)境下，用考馬斯亮藍(lán) 染液染色2h。這樣，在染色時(shí)，可以保持考馬斯亮藍(lán)染液染色的效率，提高染色效果，理想情 況下可檢出1~〇. 1 μ g蛋白。優(yōu)選的，在染色之前，還包括步驟：過(guò)濾所述考馬斯亮藍(lán)染液； 又如，在染色之前，預(yù)先將考馬斯亮藍(lán)染液升溫至25至30攝氏度。這樣，可以獲得較好的 染色效果。優(yōu)選的，在脫色液中脫色3次，第一次脫色的時(shí)間大于第三次脫色的時(shí)間，第三 次脫色的時(shí)間大于第二次脫色的時(shí)間；優(yōu)選的，第一次脫色之前，將脫色液的溫度預(yù)熱至染 色的環(huán)境溫度，并且，脫色液的溫度不高于36攝氏度；優(yōu)選的，第二次脫色之前，將脫色液 的溫度預(yù)熱至33~36攝氏度。優(yōu)選的，脫色液中的甲醇與冰醋酸的摩爾比為4~4. 5:1。 這樣，可以獲得較好的脫色效果。
[0039] 然后進(jìn)彳丁蛋白質(zhì)酶解，例如，每組精確取出100 y g蛋白，蛋白：酶按質(zhì)量比為20 : 1的比例加入Trypsin (胰蛋白）裂解酶，置于37 °C下酶解4h，再按照相同的比例加入 Trypsin裂解酶，置于37°C下酶解8h。又如，按照細(xì)胞總蛋白與胰蛋白裂解酶的質(zhì)量比為 22:1加入胰蛋白裂解酶，并置于37°C酶解6h，再按照細(xì)胞總蛋白與胰蛋白酶的質(zhì)