一種高效地誘導粳稻花藥培養(yǎng)的誘導培養(yǎng)基配方的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種粳稻花藥培養(yǎng)培養(yǎng)基配方，具體涉及一種可以顯著降低褐化、高 效率地誘導粳稻花藥誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，屬于農業(yè)科學技術領域。
【背景技術】
[0002] 花藥是植物的雄性器官，花藥培養(yǎng)是利用植物組織培養(yǎng)技術，把發(fā)育到一定階段 的花藥。通過無菌操作接種在培養(yǎng)基上，在一系列條件誘導下改變花藥的發(fā)育程序，進行有 絲分裂，經(jīng)過脫分化后形成細胞團，進而形成愈傷組織，經(jīng)歷再分化發(fā)育成完整的單倍體植 株的過程。
[0003] 1964年，印度德里大學的兩位植物學家Guha和Maheshwari發(fā)現(xiàn)，他們培養(yǎng)的毛葉 曼陀羅花藥中長出的胚狀體是來源于花粉的單倍體植株。1968年，日本的Niizeki和Oono 通過花藥培養(yǎng)得到了單倍體水稻植株。隨著研究的不斷深入，花藥培養(yǎng)技術逐步得以進步， 并應用于水稻遺傳育種。
[0004] 水稻花藥培養(yǎng)育種是育種學發(fā)展的趨勢之一，它集成了雜交育種、誘變育種、細胞 學、遺傳學等各種生物科學的內容。利用花藥培養(yǎng)可以明顯的加快育種進程、縮短育種年 限?；ㄋ幣囵B(yǎng)形成的單倍體植株加倍后每個基因均以純合體的形式存在，各種優(yōu)良和不良 的性狀在早期世代表現(xiàn)出來，便于進行篩選和淘汰。
[0005] 我國水稻花藥培養(yǎng)技術研究始于20世紀70年代，在水稻育種研究中得到了不斷 的改良和完善，花藥培養(yǎng)的效率得以提高，也帶動了其他作物的花藥培養(yǎng)的進度，有大量通 過利用該技術培育出的秈粳稻品種已經(jīng)通過了審定，并且得到了大面積的推廣。自1975年 中國科學院北京植物研究所、黑龍江省農業(yè)科學院作物育種研究所和松花江地區(qū)農業(yè)科學 研究所水稻實驗站組成的單倍體育種協(xié)作組首次育成粳稻品種"單豐1號"以及1976年中 國科學院遺傳所和天津市農科所育成了 "花育1號"和"花育2號"以來，我國實現(xiàn)了花培 育種從理論到應用的突破，也促進了國內外的花培育種技術的發(fā)展。常規(guī)育種與花藥培養(yǎng) 技術結合起來育成了大量水稻新品種通過審定，比較有代表性的有20世紀80年代的中國 農科院的"中花"系列，其中中花8號、中花9號和中花10號年種植面積曾達到2萬hm。90 年代的江西農科院選育的"贛秈"系列，黑龍江省農業(yè)科學院水稻研究所選育出了龍粳系列 品種，2000年后又有不冋的中花品種和龍梗品種被成功選育。經(jīng)過30多年來全國各地育種 研究隊伍的潛心研究，目前我國已有一大批通過花培育種的品種產(chǎn)生，并且大面積推廣應 用。隨著花藥培養(yǎng)的遺傳特性、生理生化等不斷深入研究，現(xiàn)在水稻花藥培養(yǎng)已經(jīng)成為當今 生物技術育種中較為實用、有效的育種新技術，我國水稻花藥培養(yǎng)育種的應用研究在國際 上一直保持領先地位。
[0006] 從品種選育的角度看，花藥培養(yǎng)獲得的再生植株越多，獲得優(yōu)良基因型的概率越 大。水稻的生長發(fā)育是由自身基因與環(huán)境因素共同決定的，由于受培養(yǎng)基組分、材料的差異 性以及培養(yǎng)環(huán)境等的影響，目前花培效率還不夠理想，獲得的再生植株群體小，花培后代的 表現(xiàn)型不充足，這使選擇、利用受到較大的限制。提高花藥培養(yǎng)的誘導頻率和花培綠苗頻 率，增大花培后代的群體，是水稻花培技術在遺傳育種上擴大應用的前提和基礎。為此，仍 然需要進行不懈的努力。
[0007] 培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)的物質基礎，直接關系到培養(yǎng)物的生長與分化，培養(yǎng)基組分是 影響花培效率的一個很重要的因素。培養(yǎng)基各組分的合適用量，以及它們之間一定的組合 關系，可導致花培效率的大幅度提高。繼續(xù)篩選和優(yōu)化基本培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基選用的針對 性，是提高花藥培養(yǎng)力的有效措施；大量的研究發(fā)現(xiàn)一些有機附加物可以顯著提高花藥培 養(yǎng)力，發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化組合花藥培養(yǎng)有機附加物質，可進一步提高花藥培養(yǎng)力。
[0008] 水稻花藥培養(yǎng)的過程需要進行三個步驟：誘導培養(yǎng)，即將花藥剝離在誘導培養(yǎng)基 上先脫分化誘導出花藥愈傷組織；分化培養(yǎng)，即將花藥愈傷組織轉移到分化培養(yǎng)基上再分 化生出具有根和芽的綠苗的過程；繼代培養(yǎng)，即將分化出的幼小植株轉移至繼代培養(yǎng)基上 生長成健壯植株的過程。其中，花藥誘導培養(yǎng)是水稻花藥培養(yǎng)過程的重點也是難點，水稻花 藥愈傷組織誘導的頻率和質量直接決定著花藥培養(yǎng)的成敗，因此，組合和優(yōu)化培養(yǎng)基組分， 摸索出高效的水稻花藥誘導培養(yǎng)基配方是提高花藥培養(yǎng)誘導頻率的關鍵。
[0009] 通過多年粳稻花藥培養(yǎng)的摸索和實踐，我們進一步優(yōu)化了基本培養(yǎng)基配方，并且 不斷嘗試加入一些提高粳稻藥誘導力的有機添加物并組合其種類搭配及濃度，最終摸索出 了一種可以顯著降低培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基的褐化反應、高效率地誘導粳稻花藥誘導培養(yǎng)的培 養(yǎng)基配方。我們的研究結果對于進一步推廣和應用水稻單倍體育種和理論研究無疑有較大 的現(xiàn)實意義和實用價值。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種高效地誘導粳稻花藥培養(yǎng)的誘導培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配方如 下： KNO3 2200 ~2600mg/L，（NH4)2SO4 370 ~430mg/L，KH2PO4 330 ~370mg/L，CaCl2* 2H20 130 ~150mg/L，MgSO4* 7H20 150 ~170mg/L，Na2-EDTA 30 ~35mg/L，F(xiàn)eSO4* 7H20 22 ~ 26mg/L，MnSO4* 4H 20 3. 6 ~4. 2mg/L，ZnSO4* 7H 20 I. 2 ~I. 4mg/L，H3BO3 I. 3 ~I. 5mg/ L，KI 0? 6 ~0? 7mg/L，丙三醇 6 ~7mg/L，Na3C6H5O7* H 20 0? 45 ~0? 55mg/L，葉酸 0? 45 ~ 0? 55mg/L，甘氨酸2. 7~3. 3mg/L，丙氨酸2. 2~2. 8mg/L，賴氨酸I. 8~2. 2mg/L，維生素 BI L 8~2. 2mg/L，維生素B6 0? 9~I. lmg/L，煙酸0? 9~I. I mg/L，氯化2-羥乙基三甲 銨220~280mg/L，蔗糖50~60g/L，植物凝膠5~6g/L ; 2,4_D 3. 6 ~4. 4mg/L，NAA 3. 6 ~4. 4mg/L，復駄核酸 0? 45 ~0? 55mg/L，水解蛋白 0? 45 ~0? 55g/L，活性炭 2. 5 ~3. Og/L，?；撬?0? 07 ~0? 08mg/L，生物素 0? 07 ~0? 08mg/ L，植物硫化激動素 PSK a 27 ~33pmol/L，PH 5. 8-6. 0。
[0011] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)基具有高效率地誘導粳稻花藥愈傷組織、降低褐化的優(yōu)點，可 以大幅度地提高粳稻花藥培養(yǎng)效率。下面的實施例以及對比實驗可以清楚地反映本發(fā)明所 述培養(yǎng)基的特點。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1 配制如下配方的培養(yǎng)基： KNO3 2400mg/L, (NH4)2SO4 400mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2* 2H 20 140mg/L, MgSO4* 7H 20 160mg/L, Na2-EDTA 32. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 24mg/L, MnSO4* 4H 20 3. 9mg/L, ZnSO4* 7H 20 I. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0? 65mg/L，丙三醇 6. 5mg/L，Na3C6H5O7* H2O 0? 5mg/L，葉酸 0? 5mg/L，甘氨酸3. Omg/L，丙氨酸2. 5mg/L，賴氨酸2. Omg/L，維生素BI 2. Omg/L，維生素 B6 lmg/L，煙酸lmg/L，氯化2-輕乙基三甲銨250mg/L，鹿糖55g/L，植物凝膠5.5g/L; 2.4- D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，復酞核酸 0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭 2.75g/L， ?；撬?. 〇75mg/L，生物素0. 075mg/L，植物硫化激動素PSK a 30pmol/L，PH 5. 9。
[0013] 選取粳稻品種通科粳和黑殼紫粳作為花藥培養(yǎng)花藥供體，采集單核晚期花藥作為 供試材料，表面消毒后，4°C下低溫預處理3天。預處理后，外植體滅菌（0. 1%升汞溶液，15 min)，抖藥法接種花藥于該誘導培養(yǎng)基中誘導愈傷組織，每個三角瓶接種50枚花藥，在溫 度為28°C、濕度為60%-70%的環(huán)境下暗培養(yǎng)。愈傷組織形成后(長到2mm左右)，計算愈傷組 織誘導率。
[0014] 實施例2 配制如下配方的培養(yǎng)基(丙氨酸添加濃度的優(yōu)選）： KNO3 2400mg/L, (NH4)2SO4 400mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2* 2H 20 140mg/L, MgSO4* 7H 20 160mg/L, Na2-EDTA 32. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 24mg/L, MnSO4* 4H 20 3. 9mg/L, ZnSO4* 7H 20 I. 3mg/L，H3BO3 I. 4mg/L，KI 0? 65mg/L，丙三醇 6. 5mg/L，Na3C6H5O7* H2O 0? 5mg/L，葉酸 0. 5mg/L，甘氨酸3.0mg/L，賴氨酸2.0mg/L，維生素BI 2.0mg/L，維生素B6 lmg/L，煙酸 lmg/L，氯化2-輕乙基三甲銨250mg/L，鹿糖55g/L，植物凝膠5.5g/L; 2.4- D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，復酞核酸 0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭 2.75g/L， ?；撬?. 〇75mg/L，生物素0. 075mg/L，植物硫化激動素PSK a 30pmol/L，PH 5. 9。
[0015]丙氨酸的添加濃度設置以下 10 種：〇 ;〇? 5 mg/L ;1 mg/L ;1. 5 mg/L ;2 mg/L ;3mg/ L ;3.5 mg/L ;4 mg/L，5 mg/L ;8 mg/L〇
[0016] 同樣選取該兩個粳稻品種作為花藥供體，操作方法、培養(yǎng)方法同實施例1，計算愈 傷組織誘導率。
[0017] 實施例3 配制如下配方的培養(yǎng)基(凝固劑的優(yōu)選）： KNO3 2400mg/L, (NH4)2SO4 400mg/L, KH2PO4 350mg/L, CaCl2* 2H 20 140mg/L, MgSO4* 7H 20 160mg/L, Na2-EDTA 32. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 24mg/L, MnSO4* 4H 20 3. 9mg/L, ZnSO4* 7H 20 1. 3mg