本發(fā)明涉及細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一套可標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)操作的nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其使用方法和得到的nk細(xì)胞。使用該試劑盒和基本實(shí)驗(yàn)耗材可短時(shí)間內(nèi)便捷的擴(kuò)增大量nk細(xì)胞,為體外大規(guī)模擴(kuò)增nk細(xì)胞和相關(guān)研究及臨床試驗(yàn)提供便利。

背景技術(shù)：

2000年國(guó)際腫瘤生物治療及基因治療年會(huì)中指出“免疫細(xì)胞療法是現(xiàn)代科技中唯一有可能徹底清除癌癥細(xì)胞的方法”。夢(mèng)想照進(jìn)現(xiàn)實(shí)，癌癥正在逐漸被人類(lèi)戰(zhàn)勝。細(xì)胞免疫療法是除手術(shù)、放療、化療以外的第四大癌癥治療模式。nk細(xì)胞作為免疫治療臨床研究中的熱點(diǎn)，其誘導(dǎo)和擴(kuò)增的方法各不相同，且誘導(dǎo)出的細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量也參差不齊。沒(méi)有一套簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定的誘導(dǎo)試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一套簡(jiǎn)便安全的nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其使用方法和得到的nk細(xì)胞。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒,試劑盒包含nk試劑套盒和nk耗材套盒：

nk試劑套盒包括：一支10ul預(yù)處理因子nk-a、一支40ul預(yù)處理因子nk-b、一支40ul擴(kuò)增因子nk-c、一支500ul擴(kuò)增因子nk-d、一支500ul擴(kuò)增因子nk-e和一瓶1000ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，按質(zhì)量濃度，各因子的成分如下，溶劑為無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；

預(yù)處理因子nk-a：

cd16mab2-5mg/ml

retronectin5-10mg/ml

預(yù)處理因子nk-b：

cd16mab2-5mg/ml

擴(kuò)增因子nk-c：

15000iu/ugil-235-60ug/ml

7000iu/ugil-1250-100ug/ml

7000iu/ugil-1525-50ug/ml

擴(kuò)增因子nk-d：

15000iu/ugil-235ug-60ug/ml

7000iu/ugil-1525ug-50ug/ml

擴(kuò)增因子nk-e：

15000iu/ugil-235ug-60ug/ml

7000iu/ugil-1225-50ug/ml

7000iu/ugil-1525-50ug/ml

nk耗材套盒包括：兩支單核淋巴細(xì)胞分離離心管、一個(gè)細(xì)胞加樣預(yù)灌支架、一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋和一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)。

所述單核淋巴細(xì)胞分離離心管由聚丙烯離心管和水平固定在聚丙烯離心管中的多孔異形篩板組成，靠近管壁處的多孔異形篩板上有方便加入淋巴細(xì)胞分離液的缺口，篩板檔網(wǎng)的孔徑為20-40μm。

所述聚丙烯離心管為50ml，多孔異形篩板固定于15ml刻度處。

所述細(xì)胞加樣預(yù)灌支架由托板和支架組成，支架包括第一支架板和第二支架板，托板與第一支架板之間、第一支架板和第二支架板之間均采用旋轉(zhuǎn)卡扣式結(jié)構(gòu)連接，第一支架板旋轉(zhuǎn)270°后固定，第二支架板旋轉(zhuǎn)90°固定，使第一支架板垂直于托板上，第二支架板平行托板并相距一定距離，第二支架板為雙層隔板，與旋轉(zhuǎn)卡扣相對(duì)的一側(cè)帶有開(kāi)口的“u”槽，兩層隔板之間預(yù)留5mm距離，使注射器空桶托耳能水平推入兩層隔板之間。

所述細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)為四方形，細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)底部設(shè)置有方便氣體交換的多個(gè)透氣孔，細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)上面四角設(shè)置有使多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)重疊放置的水平托耳。

上述nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)取t-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入5ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基、一支預(yù)處理因子nk-a，包被培養(yǎng)瓶，co2培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜；

(2)取兩支單核淋巴細(xì)胞分離離心管,在每支單核淋巴細(xì)胞分離離心管中沿預(yù)留加樣口加入15ml淋巴細(xì)胞分離液，在每支離心管中從篩板擋網(wǎng)處加入采集常規(guī)外周血或臍帶血30ml，ficoll-hypaque密度梯度離心，2000rpm/min，離心23min；

(3)收集步驟(2)中上層血漿，將收集的血漿置于56℃水浴鍋30min以滅活補(bǔ)體；3000rpm/min，離心6min除去血漿中析出物,并將上層自體血清轉(zhuǎn)移至離心管，放置于4℃冰箱備用；

(4)收集步驟(2)中的白膜層細(xì)胞，洗兩次，獲得全部的單核細(xì)胞；

(5)取步驟(1)中包被的培養(yǎng)瓶,用30ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種細(xì)胞，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-c和步驟(3)中備用的自體血清2ml，將細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(6)培養(yǎng)第3天，收集培養(yǎng)的nk細(xì)胞,1200rpm/min,離心5min,棄上清；重懸細(xì)胞，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(7)培養(yǎng)第5天，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(8)培養(yǎng)第6天，取細(xì)胞培養(yǎng)袋，加入一支預(yù)處理因子nk-b和20ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，包被培養(yǎng)袋；co2培養(yǎng)箱孵育兩小時(shí)或4℃過(guò)夜；

(9)培養(yǎng)第7天，補(bǔ)加120ul擴(kuò)增因子nk-d、100ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml，并將細(xì)胞懸液完全轉(zhuǎn)移至預(yù)包被的培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；

(10)培養(yǎng)第9天，補(bǔ)加240ul擴(kuò)增因子nk-d、240ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml；

(11)培養(yǎng)第11天，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-e、剩余全部無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中剩余全部備用自體血清；

(12)培養(yǎng)第14天，收集細(xì)胞。

采用nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的使用方法得到的nk細(xì)胞。

本發(fā)明的有益效果:試劑盒采用聯(lián)合包被技術(shù)，在nk細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增，增強(qiáng)殺傷活性；帶有方便的細(xì)胞培養(yǎng)工具，使培養(yǎng)簡(jiǎn)便，穩(wěn)定。本發(fā)明培養(yǎng)方法能在少量血液樣本的情況下,短時(shí)間內(nèi)便捷的獲得大量的nk細(xì)胞，其中nk(cd3^-cd56⁺)比例達(dá)到60％以上。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明單核淋巴細(xì)胞分離離心管結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明細(xì)胞加樣預(yù)灌支架結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1細(xì)胞流式檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明使用nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及培養(yǎng)nk細(xì)胞的方法，該細(xì)胞培養(yǎng)方法采用聯(lián)合包被技術(shù)，并在nk細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增，增強(qiáng)其殺傷活性,其中nk耗材套盒提供了簡(jiǎn)單便捷的操作工具,下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本試劑盒作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明:

本發(fā)明的nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒,試劑盒包含nk試劑套盒和nk耗材套盒：

nk試劑套盒包括：一支10ul預(yù)處理因子nk-a、一支40ul預(yù)處理因子nk-b、一支40ul擴(kuò)增因子nk-c、一支500ul擴(kuò)增因子nk-d、一支500ul擴(kuò)增因子nk-e和一瓶1000ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，按質(zhì)量濃度，各因子的成分如下，溶劑為無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；

預(yù)處理因子nk-a：

cd16mab2-5mg/ml

retronectin5-10mg/ml

預(yù)處理因子nk-b：

cd16mab2-5mg/ml

擴(kuò)增因子nk-c：

15000iu/ugil-235-60ug/ml

7000iu/ugil-1250-100ug/ml

7000iu/ugil-1525-50ug/ml

擴(kuò)增因子nk-d：

15000iu/ugil-235ug-60ug/ml

7000iu/ugil-1525ug-50ug/ml

擴(kuò)增因子nk-e：

15000iu/ugil-235ug-60ug/ml

7000iu/ugil-1225-50ug/ml

7000iu/ugil-1525-50ug/ml

nk耗材套盒包括：兩支單核淋巴細(xì)胞分離離心管、一個(gè)細(xì)胞加樣預(yù)灌支架、一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋和一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)。

如圖1所示，所述單核淋巴細(xì)胞分離離心管由聚丙烯離心管2和水平固定在聚丙烯離心管中的多孔異形篩板1組成，靠近管壁處的多孔異形篩板1上有方便加入淋巴細(xì)胞分離液的缺口3，篩板檔網(wǎng)的孔徑為20-40μm。

所述聚丙烯離心管2為50ml，多孔異形篩板1固定于15ml刻度處。

如圖2所示，所述細(xì)胞加樣預(yù)灌支架由托板4和支架組成，支架包括第一支架板5和第二支架板6，托板4與第一支架板5之間、第一支架板5和第二支架板6之間均采用旋轉(zhuǎn)卡扣式結(jié)構(gòu)連接，第一支架板5旋轉(zhuǎn)270°后固定，第二支架板6旋轉(zhuǎn)90°固定，使第一支架板5垂直于托板4上，第二支架板6平行托板4并相距一定距離，第二支架板6為雙層隔板，與旋轉(zhuǎn)卡扣相對(duì)的一側(cè)帶有開(kāi)口的“u”槽，兩層隔板之間預(yù)留5mm距離，使注射器空桶托耳能水平推入兩層隔板之間。

如圖3所示，所述細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)為四方形，細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)底部設(shè)置有方便氣體交換的多個(gè)透氣孔7，細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)上面四角設(shè)置有使多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋托盤(pán)重疊放置的水平托耳8。可使樣本重疊放置，增加培養(yǎng)箱利用率。

上述nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)取t-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入5ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基、一支預(yù)處理因子nk-a，包被培養(yǎng)瓶，co2培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜；

(2)取兩支單核淋巴細(xì)胞分離離心管,在每支單核淋巴細(xì)胞分離離心管中沿預(yù)留加樣口加入15ml淋巴細(xì)胞分離液，在每支離心管中從篩板擋網(wǎng)處加入采集常規(guī)外周血或臍帶血30ml，ficoll-hypaque密度梯度離心，2000rpm/min，離心23min；

(3)收集步驟(2)中上層血漿，將收集的血漿置于56℃水浴鍋30min以滅活補(bǔ)體；3000rpm/min，離心6min除去血漿中析出物,并將上層自體血清轉(zhuǎn)移至離心管，放置于4℃冰箱備用；

(4)收集步驟(2)中的白膜層細(xì)胞，洗兩次，獲得全部的單核細(xì)胞；

(5)取步驟(1)中包被的培養(yǎng)瓶,用30ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種細(xì)胞，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-c和步驟(3)中備用的自體血清2ml，將細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(6)培養(yǎng)第3天，收集培養(yǎng)的nk細(xì)胞,1200rpm/min,離心5min,棄上清；重懸細(xì)胞，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(7)培養(yǎng)第5天，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(8)培養(yǎng)第6天，取細(xì)胞培養(yǎng)袋，加入一支預(yù)處理因子nk-b和20ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，包被培養(yǎng)袋；co2培養(yǎng)箱孵育兩小時(shí)或4℃過(guò)夜；

(9)培養(yǎng)第7天，補(bǔ)加120ul擴(kuò)增因子nk-d、100ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml，并將細(xì)胞懸液完全轉(zhuǎn)移至預(yù)包被的培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；

(10)培養(yǎng)第9天，補(bǔ)加240ul擴(kuò)增因子nk-d、240ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml；

(11)培養(yǎng)第11天，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-e、剩余全部無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中剩余全部備用自體血清；

(12)培養(yǎng)第14天，收集細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞總數(shù)并通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)方法確定其中nk細(xì)胞的比例。

采用nk細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的使用方法得到的nk細(xì)胞。

溶劑為lonza公司無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其貨號(hào)為：04-418q。

所述步驟(12)中，所述nk細(xì)胞的比例是指cd3^-cd56⁺的比例。

所述步驟(1)和(8)中采用預(yù)包技術(shù)，培養(yǎng)瓶采用retronectin和cd16mab蛋白聯(lián)合包被，培養(yǎng)第七天培養(yǎng)袋用cd16mab包被。

所示步驟(6)中培養(yǎng)第三天更換新的培養(yǎng)體系,新的培養(yǎng)體系中不含有il-12。更換培養(yǎng)體系較大程度去除了血小板、析出蛋白、死亡細(xì)胞碎片和dna對(duì)nk細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；

所示步驟(5)到步驟(11)中細(xì)胞擴(kuò)增因子添加比例和添加時(shí)間。細(xì)胞因子添加比例及時(shí)間能較高的抑制t細(xì)胞擴(kuò)增，提高nk細(xì)胞的比例；

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

實(shí)施例1

(1)實(shí)驗(yàn)前一天取t-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入5ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(lonza公司無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，貨號(hào)為：04-418q)、一支預(yù)處理因子nk-a，包被培養(yǎng)瓶，4℃過(guò)夜；

(2)取兩支單核淋巴細(xì)胞分離離心管,在每支單核淋巴細(xì)胞分離離心管中沿預(yù)留加樣口加入15ml淋巴細(xì)胞分離液，在每支離心管中從篩板擋網(wǎng)處加入采集常規(guī)外周血30ml，ficoll-hypaque密度梯度離心，2000rpm/min，離心23min；

(3)收集步驟(2)中上層血漿，將收集的血漿置于56℃水浴鍋30min以滅活補(bǔ)體；3000rpm/min，離心8min除去血漿中析出物,并將上層自體血清轉(zhuǎn)移至離心管，共計(jì)26ml,放置于4℃冰箱備用；

(4)收集步驟(2)中的白膜層細(xì)胞，洗兩次，獲得全部的單核細(xì)胞,計(jì)數(shù)為5.2*10⁷；

(5)取步驟(1)中包被的培養(yǎng)瓶,用30ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種細(xì)胞，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-c和步驟(3)中備用的自體血清2ml，將細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(6)培養(yǎng)第3天，收集培養(yǎng)的nk細(xì)胞,1200rpm/min,離心5min,棄上清。重懸細(xì)胞，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(7)培養(yǎng)第5天，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(8)培養(yǎng)第6天，取細(xì)胞培養(yǎng)袋，加入一支預(yù)處理因子nk-b和20ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，包被培養(yǎng)袋。co2培養(yǎng)箱孵育兩小時(shí)或4℃過(guò)夜。

(9)培養(yǎng)第7天，補(bǔ)加120ul擴(kuò)增因子nk-d、100ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml，并將細(xì)胞懸液完全轉(zhuǎn)移至預(yù)包被的培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；

(10)培養(yǎng)第9天，補(bǔ)加240ul擴(kuò)增因子nk-d、240ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml；

(11)培養(yǎng)第11天，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-e、剩余全部無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基490ml和步驟(3)中剩余全部備用自體血清3ml；

(12)培養(yǎng)第14天，將細(xì)胞培養(yǎng)袋中的所有細(xì)胞收獲，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)為2.9*10⁹，臺(tái)盼藍(lán)拒染率98％,流式細(xì)胞檢測(cè)方法確定其中nk細(xì)胞(cd3^-cd56⁺)的比例為61％(圖4)。

實(shí)施例2

(1)實(shí)驗(yàn)前一天取t-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入5ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(lonza公司無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，貨號(hào)為：04-418q)、一支預(yù)處理因子nk-a，包被培養(yǎng)瓶，4℃過(guò)夜；

(2)取兩支單核淋巴細(xì)胞分離離心管,在每支單核淋巴細(xì)胞分離離心管中沿預(yù)留加樣口加入15ml淋巴細(xì)胞分離液，在每支離心管中從篩板擋網(wǎng)處加入采集常規(guī)外周血30ml，ficoll-hypaque密度梯度離心，2000rpm/min，離心23min；

(3)收集步驟(2)中上層血漿，將收集的血漿置于56℃水浴鍋30min以滅活補(bǔ)體；3000rpm/min，離心8min除去血漿中析出物,并將上層自體血清轉(zhuǎn)移至離心管，共計(jì)24ml,放置于4℃冰箱備用；

(4)收集步驟(2)中的白膜層細(xì)胞，洗兩次，獲得全部的單核細(xì)胞,計(jì)數(shù)為7*10⁷；

(5)取步驟(1)中包被的培養(yǎng)瓶,用30ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種細(xì)胞，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-c和步驟(3)中備用的自體血清2ml，將細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(6)培養(yǎng)第3天，收集培養(yǎng)的nk細(xì)胞,1200rpm/min,離心5min,棄上清。重懸細(xì)胞，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(7)培養(yǎng)第5天，補(bǔ)加60ul擴(kuò)增因子nk-d、60ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清3ml；

(8)培養(yǎng)第6天，取細(xì)胞培養(yǎng)袋，加入一支預(yù)處理因子nk-b和20ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，包被培養(yǎng)袋。co2培養(yǎng)箱孵育兩小時(shí)或4℃過(guò)夜。

(9)培養(yǎng)第7天，補(bǔ)加120ul擴(kuò)增因子nk-d、100ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml，并將細(xì)胞懸液完全轉(zhuǎn)移至預(yù)包被的培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；

(10)培養(yǎng)第9天，補(bǔ)加240ul擴(kuò)增因子nk-d、240ml無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(3)中備用的自體血清6ml；

(11)培養(yǎng)第11天，補(bǔ)加一支擴(kuò)增因子nk-e、剩余全部無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基490ml和步驟(3)中剩余全部備用自體血清3ml；

(11)培養(yǎng)第14天，將細(xì)胞培養(yǎng)袋中的所有細(xì)胞收獲，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)為3.7*10⁹，臺(tái)盼藍(lán)拒染率97％。

本發(fā)明立足于免疫細(xì)胞nk細(xì)胞的體外大規(guī)模誘導(dǎo)方法，其在臨床上巨大的應(yīng)用前景。

綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。