肺癌ctl細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及制備方法
【專利說明】肺癌CTL細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及制備方法
[技術(shù)領(lǐng)域]
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種肺癌CTL細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及制備方法。
[【背景技術(shù)】]
[0002] 自體細(xì)胞免疫治療的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了Ξ大傳統(tǒng)腫瘤治療一放療、化療和手術(shù)治療難 W徹底抹殺腫瘤細(xì)胞的缺陷，它是用自己的細(xì)胞治自己的病，通過提高病人自身的免疫系 統(tǒng)的功能，增強(qiáng)特異性腫瘤殺傷細(xì)胞的分化能力，在沒有任何副作用的前提下，可W在細(xì)胞 水平上殺滅腫瘤。運(yùn)項(xiàng)實(shí)現(xiàn)患者自身機(jī)體的"自主抗癌"療法，有望達(dá)到完全消滅體內(nèi)癌細(xì) 胞并根治的目的，將成為未來癌癥治療的一個(gè)主要方向。運(yùn)項(xiàng)技術(shù)被認(rèn)為是"二十一世紀(jì) 最有希望攻克腫瘤的治療技術(shù)"，也是世界上目前唯一有希望完全消滅腫瘤細(xì)胞的治療手 段。腫瘤自體細(xì)胞免疫療法適用于多種實(shí)體腫瘤，包括惡性黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、膀脫 癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、膜腺癌、肝癌、胃癌等實(shí)體 瘤手術(shù)后防止復(fù)發(fā)，也可W用于多發(fā)性骨髓瘤、B淋己瘤和白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的復(fù) 發(fā)，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞免疫治療的適應(yīng)人群還可W用于上述腫瘤的進(jìn)一步鞏固治療，達(dá)到延 長生存期、提高生活質(zhì)量和抑制腫瘤惡化的目的。美國FDA于2010年4月29日批準(zhǔn)了第 一支基于該技術(shù)的治療產(chǎn)品上市，中國也已立法規(guī)定此技術(shù)作為第Ξ類醫(yī)療技術(shù)，允許有 資質(zhì)的醫(yī)院開展。
[0003] 第一代過繼自體細(xì)胞免疫療法主要包括Ξ種免疫細(xì)胞的療法一DC、CIK、DCCIK，療 法優(yōu)點(diǎn)突顯在：通過采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)由體外培養(yǎng)使其數(shù)量成千上萬倍增多，進(jìn) 而使免疫細(xì)胞的祀向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭wW殺滅血液及組織中的病原體、 修復(fù)機(jī)體受損組織細(xì)胞，W及調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。運(yùn)項(xiàng)技術(shù)在國內(nèi)若干家公立醫(yī) 院已經(jīng)開展，廣大的醫(yī)療機(jī)構(gòu)尚處在待開發(fā)狀態(tài)。但是，腫瘤殺傷的特異性低而且殺傷機(jī)理 不是很清楚。CD8T細(xì)胞治療是第二代免疫細(xì)胞治療，CD8T細(xì)胞是癌細(xì)胞最原始的天敵，具 有腫瘤特異性抗原識(shí)別和有效殺傷癌細(xì)胞的效果。作為第二代免疫細(xì)胞治療技術(shù)，CD8T細(xì) 胞技術(shù)屬于近幾年獲得重大突破的最新技術(shù)。除具有第一代自體細(xì)胞免疫療法的優(yōu)點(diǎn)外， 與第一代免疫細(xì)胞治療技術(shù)DC\CIK技術(shù)相比，不僅在安全性上得到了更好的保證，對(duì)癌細(xì) 胞的殺傷性和祀向性上更是得到了顯著提升，有效改善了DC\CIK技術(shù)腫瘤殺傷效果有限 的局限性，是真正有望根治癌癥的最新技術(shù)。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于提高肺癌CTL細(xì)胞的生產(chǎn)效率，W適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化的要求。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，提供一種肺癌CTL細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其制備方法，該試劑盒 的制備包括W下步驟：
[0006] a.合成能夠誘導(dǎo)肺癌特異的CTL的抗原膚
[0007] 分析肺癌特異性抗原分子內(nèi)的抗原膚片段，設(shè)計(jì)能與MHCI類分子結(jié)合的膚段，并 在體外合成運(yùn)些膚段，保證純度在99 %W上， 陽00引 b.制備人造抗原提呈細(xì)胞
[0009] W果蛹S2細(xì)胞為基礎(chǔ)，共轉(zhuǎn)染表達(dá)HLA-A2、β-微球蛋白、CD80、細(xì)胞間黏附分 子-1，并保證相關(guān)分子表達(dá)細(xì)胞占總細(xì)胞的80 %W上，得到人工果蛹抗原提呈細(xì)胞，
[0010] 補(bǔ)骨素和紫外射線處理上述人工果蛹抗原提呈細(xì)胞并建立細(xì)胞庫，得到所述的人 造抗原提呈細(xì)胞，
[0011] C.制備試劑盒
[0012] 試劑盒包括上述人造抗原提呈細(xì)胞和抗原膚。
[0013] 上述試劑盒制備的還具有如下優(yōu)化方案：
[0014]所述的試劑盒中還包括β 2Μ。
[0015]所述的試劑盒中還包括比-2和比-7。
[0016] 所述的試劑盒中還包括絲裂霉素。
[0017] 所述的試劑盒中還包括凍存液。 陽0化]所述的抗原膚來自于腫瘤抗原MAGE-1、MAGE-3、NY-ES0-1、SSX-2、WT-1W及hT邸Τ。
[0019] 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠有效的提高肺癌CTL細(xì)胞的生產(chǎn)效率，并且能夠滿 足產(chǎn)業(yè)化的要求。
[【附圖說明】]
[0020] 圖1為MAGE-1、MAGE-3、NY-ES0-1的抗原膚的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0021] 圖2為SSX-2、WT-1、hTERT的抗原膚的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0022] 圖3為T細(xì)胞增長曲線；
[0023] 圖4為CTL的活性測(cè)定圖， 圖5為人工抗原提呈細(xì)胞激活CD8叮細(xì)胞產(chǎn)生CTL的過程示意圖； 圖6為果蛹細(xì)胞負(fù)載抗原膚的示意圖。
[【具體實(shí)施方式】]
[0024] W下，結(jié)合實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明做進(jìn)一步說明，實(shí)施例僅用于解釋說明而不用于限 定本發(fā)明的保護(hù)范圍。 陽0巧]細(xì)胞毒性T細(xì)胞（巧totoxicT-lympho巧te，CTL)是CD8巧淋己細(xì)胞經(jīng)刺激后產(chǎn) 生的能特異性殺傷腫瘤的效應(yīng)T細(xì)胞，也稱殺傷性T細(xì)胞。CTL細(xì)胞治療是利用患者自身靜 脈血的CD8+T淋己細(xì)胞，在體外通過特異性抗原膚和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，分化擴(kuò)增成具有強(qiáng) 大殺傷力的CTL細(xì)胞，再經(jīng)靜脈回輸體內(nèi)，從而有效的發(fā)揮免疫效應(yīng)，達(dá)到清除病毒和殺傷 腫瘤細(xì)胞的作用。
[0026] 本試劑盒是利用人工抗原提呈細(xì)胞（artificialantigenpresenting cell,aAPC)負(fù)載特異性的肺癌抗原膚，aAPC表面的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibilitycomplex,MHC)與肺癌抗原膚結(jié)合后產(chǎn)生的MHC-抗原膚復(fù)合物能被 CD8叮細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體燈cellrec巧tor，TCR)識(shí)別從而激活CD8巧細(xì)胞產(chǎn)生CTL。 (如圖5所示）。
[0027] 1.特異性的CD8T毒性細(xì)胞仍Ls)能專一有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，輸入體內(nèi)后能治 愈腫瘤患者。臨床試驗(yàn)已證明特異性細(xì)胞過繼治療腫瘤的有效性。
[002引 2.體外用攜帶抗原膚的抗原提呈細(xì)胞刺激從外周血分離的CD8T細(xì)胞能產(chǎn)生大量 腫瘤特異性的CD8T毒性細(xì)胞（CTLs)。
[0029] 3.人工果蛹抗原提呈細(xì)胞燈YFLY)高效表達(dá)MHCI分子和一些共刺激分子，能有 效地負(fù)載抗原膚和最大程度地刺激CD8T細(xì)胞（如圖4所示）。
[0030] 4.人工果蛹抗原提呈細(xì)胞燈Y化巧經(jīng)補(bǔ)骨素/紫外射線（Psoralen/UV)處理后， 果蛹抗原提呈細(xì)胞失活，卻保存了抗原提呈的功能，而且安全。此方法已獲得抑A認(rèn)可。
[0031] 5.本試劑盒提供制備特異性CD8T細(xì)胞所需要的抗原提呈細(xì)胞株和其它一切試劑 和細(xì)胞因子，為各醫(yī)院，研究所和公司提供制備特異性CD8T細(xì)胞用于研究和治療提供了一 個(gè)簡(jiǎn)便的方法。 陽0巧 實(shí)施例
[003引 1.設(shè)計(jì)能夠誘導(dǎo)肺癌特異的CTL的抗原膚：運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，分析肺癌特 異性抗原分子內(nèi)的抗原膚片段，設(shè)計(jì)能與MHCI類分子結(jié)合的膚段，并在體外合成運(yùn)些膚 段，保證純度在99%W上。研究膚段與血1CI類分子的結(jié)合穩(wěn)定性。目前我們已經(jīng)篩選到 肺癌專一的多膚，可W誘導(dǎo)抗原膚特異的CTL可用于肺癌的治療。
[0034] 2.人造抗原提呈細(xì)胞的制備方法：構(gòu)建各種相關(guān)蛋白的表達(dá)載體。W果蛹S2細(xì) 胞為基礎(chǔ)，共轉(zhuǎn)染表達(dá)HLA-A2、β-微球蛋白、CD80、細(xì)胞間黏附分子-1 (ICAM-1，CD54);流 式細(xì)胞術(shù)（FAC巧分析各種分子表達(dá)情況，保證相關(guān)分子表達(dá)細(xì)胞占總細(xì)胞的80%W上。它 比一般抗原提呈細(xì)胞值C)可W上載更多腫瘤抗原膚，能更有效地激活CD8T細(xì)胞，從而達(dá)到 產(chǎn)生CD8毒性細(xì)胞的最佳效果，而且可W在體外批量生產(chǎn)運(yùn)個(gè)細(xì)胞株，適合產(chǎn)業(yè)化的要求。 陽03引 3.篩選高表達(dá)Μ肥的果蛹細(xì)胞株后，補(bǔ)骨素/紫外射線（Psoralen/UV)處理人工 果蛹抗原提呈細(xì)胞并建立細(xì)胞庫。
[0036] 4.試劑盒的制備：試劑盒由人工APC，細(xì)胞因子，肺癌抗原膚及其他一些試劑組 成。
[0037] 5.CTL制備方法：利用試劑盒提供的人工抗原遞呈細(xì)胞和合成的抗原膚與CD8T 細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，經(jīng)非CD8的PBMCW及試劑盒提供的合成的抗原膚重覆刺激和擴(kuò)增后產(chǎn) 生CD8T毒性細(xì)胞（CTL)。
[0038] 6.高質(zhì)量CTL的檢測(cè)：
[0039] 1). CD8的純度檢測(cè)：流式細(xì)胞儀。 W40] 。.CTL活性的測(cè)定JFN- 丫的ELISA測(cè)定。
[0041] 3). CTL表型的測(cè)試：流式細(xì)胞儀。
[0042] 試劑盒組成：
[0043] (A)人工抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括抗原膚和0 2M W44] 做non-CD8叮細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括抗原膚和0 2M
[0045] (C) CTL細(xì)胞培養(yǎng)增殖體系，包括比-2和比-7
[0046] (D)包括絲裂霉素
[0047] 似凍存液 W48](巧人工抗原提呈細(xì)胞
[0049]
[0050] 試劑盒注意事項(xiàng)：
[0051] 本試劑盒可處理2x107個(gè)CD8叮細(xì)胞，最終可獲得兩倍數(shù)目W上的CTL細(xì)胞。本 試劑盒僅提供人工抗原提呈細(xì)胞，不提供CD8+T細(xì)胞分選試劑，用戶須自行分選CD8+T細(xì)胞 且凍存純化CD8T細(xì)胞后得到的非CD8部分（non-CD8+T細(xì)胞）。由于CD8+T細(xì)胞具有MHC限 制性，請(qǐng)選用HLA-A2陽性的血樣來使用本試劑盒。制備CTL后，用戶可選用合適的祀細(xì)胞 測(cè)定CTL活性。需要咨詢，可與我司聯(lián)系。
[0052] 試盒操作步驟： 陽化引第0天 W54] 1)將分選出來的CD8叮細(xì)胞濃度用細(xì)胞培養(yǎng)液（建議使用培養(yǎng)基：Life TechnologyAiM-V極MediumCTS?)調(diào)至 3. 3x106cells/ml;non-CD8+T細(xì)胞 1500;rpm離 屯、5分鐘，棄去上清液用凍存液E重懸，濃度為5~lOx106ce11s/ml，-80°C凍存，第二天轉(zhuǎn) 至液氮待用。 陽化5] 2)將試劑F人工抗原提呈細(xì)胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)至15ml離屯、管，加10ml細(xì)胞培養(yǎng)液（建議 使用培養(yǎng)基：Life TechnologyAIM-V汲Medium CTS?+2% FB巧，1500巧m離屯、5分鐘，棄 去上清液，重復(fù)Ξ次。將細(xì)胞W lx 107cells/ml濃度重懸于新鮮培養(yǎng)基中，1 :100稀釋比例 加入試劑A，室溫培養(yǎng)2小時(shí)（每半小時(shí)搖勻細(xì)胞一次）。
[0056]扣取3ml的CD8+T細(xì)胞與100 μ 1步驟。中的人工抗原提呈細(xì)胞混合于12孔板 中的一個(gè)孔中共培養(yǎng)（37°C，5%C〇2)。
[0057]第 5 天
[0058] 吹打混勻細(xì)胞后，W1 :500體積稀釋添加試劑C。 陽059] 第7天 W60] 1)調(diào)節(jié)CD8叮細(xì)胞濃度至2x106cells/ml(計(jì)算終濃度時(shí)細(xì)胞液體積V，其中保