用于示蹤子宮植入干細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于婦產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于示蹤子宮植入干細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]不孕癥病因薄型內(nèi)膜和宮腔粘連是輔助生殖技術(shù)發(fā)展中影響成功率的制約因素。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)宮腔移植是較有希望的治療方法，用MSCs復(fù)合膠原支架治療大鼠子宮壁損傷，支架提供了結(jié)構(gòu)性支撐和細(xì)胞粘附的基礎(chǔ)，使大數(shù)量級(jí)細(xì)胞作為一個(gè)活體組織片直接接合到損傷組織處，目前已獲得子宮損傷的解剖和功能修復(fù)。但是干細(xì)胞移植后在子宮局部定位、分化、如何轉(zhuǎn)移仍不明確。外源性干細(xì)胞治療的細(xì)胞傳遞途徑有兩種方式:通過循環(huán)系統(tǒng)的全身干細(xì)胞傳遞和局部干細(xì)胞傳遞，對于全身干細(xì)胞傳遞研究已知干細(xì)胞經(jīng)體循環(huán)會(huì)分布于肺、肝、脾等多個(gè)臟器及淋巴結(jié)內(nèi)，約4-10%的干細(xì)胞會(huì)歸巢至損傷缺血區(qū)域；對于局部注射干細(xì)胞，則注重于干細(xì)胞存活、分布、功能方面的研究，沒有局部傳遞方式移植干細(xì)胞的再轉(zhuǎn)移研究。
[0003]對于干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的監(jiān)測多采用細(xì)胞體外標(biāo)記示蹤劑后再移植體內(nèi)的方法，如:1)遺傳性地改變細(xì)胞的基因，使其表達(dá)特異性的標(biāo)志物，如綠色熒光蛋白、半乳糖苷酶等；2)選用雄性供體和雌性宿主，利用染色體作為標(biāo)志物；3)利用染料標(biāo)記細(xì)胞；4)移植前用5-溴-2-脫氧尿苷或脫氧胸苷來監(jiān)測正在分裂的細(xì)胞。以上方法的缺點(diǎn)是如監(jiān)測干細(xì)胞體內(nèi)的遷移必須在離體狀態(tài)下進(jìn)行組織切片分析，為創(chuàng)傷性、毀滅性方法，臨床上難以應(yīng)用于人體。
[0004]在本發(fā)明之前，超順磁性氧化鐵納米顆粒(SP1Ns)標(biāo)記干細(xì)胞的磁共振活體成像技術(shù)是干細(xì)胞在體示蹤較經(jīng)典的方法，具有多功能、多序列、多參數(shù)、多方位成像以及較高的軟組織分辨力。但這種方法成像時(shí)間長、敏感度有限；近紅外量子點(diǎn)(QDs)熒光成像技術(shù)也是一種在體光學(xué)成像技術(shù)。QDs具有獨(dú)特的光學(xué)特性:熒光度強(qiáng)，光化學(xué)穩(wěn)定性好，不易發(fā)生光漂白，成像快速、敏感，但對組織穿透力有限，不能顯示器官空間結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種用于示蹤子宮植入干細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的試劑盒及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]用于示蹤子宮植入干細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的試劑盒，其主要技術(shù)特征在于由納米粒子超順磁性氧化鐵納米顆粒及近紅外量子點(diǎn)硫化銀標(biāo)記臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組成。
[0008]1、所述超順磁性氧化鐵納米顆粒(SP10@Si02)由二氧化硅(Si02)包被四氧化三鐵(Fe304)晶體核心組成，平均晶體直徑27±3nm，平均ζ電位+50mv ;可產(chǎn)生強(qiáng)大的Τ2負(fù)性對比增強(qiáng)效應(yīng)。
[0009]2、所述近紅外量子點(diǎn)硫化銀(Ag2S_QDs)采用單源前驅(qū)體熱分解合成，顆粒粒徑大小為5.4±0.3nm，激發(fā)光785nm時(shí)，可發(fā)射波長位于1000_1320nm的近紅外II區(qū)熒光。3、所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所干細(xì)胞庫分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面抗原鑒定:顯示⑶14、⑶34和⑶45為陰性，⑶29、⑶44和⑶105為陽性，呈現(xiàn)為間質(zhì)干細(xì)胞的特征。
[0010]4、所述的嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷是指各種原因造成的子宮內(nèi)膜過度損傷，內(nèi)膜功能性修復(fù)障礙，代之以結(jié)締組織增生修復(fù)，子宮壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成。
[0011]本發(fā)明的另一技術(shù)方案是:
[0012]用于示蹤子宮植入干細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的試劑盒的制備方法，其主要技術(shù)特征在于制備步驟如下:
[0013]1)超順磁性氧化鐵納米粒子(SP10@Si02)標(biāo)記液的配制:將SP10@Si02原液置于深低溫(-196°C )液氮中冷凍除菌，將濃度為lmg/ml的SP10@Si02原液加入DMEM(含氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基)無血清培養(yǎng)液中稀釋為lOOygFe/ml的工作標(biāo)記液備用；
[0014]2) SP10iSi02標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞:用第五代MSCs，吸出原含血清的培養(yǎng)液，PBS (磷酸鹽緩沖液)洗滌3遍；100 μ gFe/ml SP10iSi02加入多聚左旋賴氨酸(Fe: PLL為1: 0.03)，37°C孵育1小時(shí)制成含F(xiàn)e-PLL復(fù)合物的標(biāo)記液，用標(biāo)記液與MSCs在100%飽和濕度、5% C02、37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜；SP10@Si02標(biāo)記MSCs孵育12h后棄去含SP100Si02的培養(yǎng)基，用PBS洗滌3遍，再用100U/ml的肝素鈉PBS液洗滌2遍，加入4ml 0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(乙二胺四乙酸)液，37°C消化5min，加入4ml含10%胎牛血清培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，移液至離心管中離心后棄上清，加入DMEM/LG完全培養(yǎng)液重懸MSCs ；
[0015]3)近紅外量子點(diǎn)硫化銀(Ag2S_QDs)標(biāo)記液的配制:將Ag2S_QDs原液置于深低溫(-196°C )液氮中冷凍除菌，將0.lmg量的Ag2S-QDs原液加入DMEM無血清培養(yǎng)液中稀釋為25 μ g/ml的工作標(biāo)記液，與MSCs在37°C下孵育30min，用PBS沖洗細(xì)胞3次；
[0016]4)Ag2S_QDs標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞:用第五代MSCs，吸出原含血清的培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，用25 μ g/ml Ag2S-QDs和Hychont培養(yǎng)DMEM-F12為細(xì)胞進(jìn)行等量換液，在100 %飽和濕度、5% C02、37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h過夜；Ag2S_QDs標(biāo)記MSCs孵育12h后棄去含Ag2S-QDs的培養(yǎng)基，用PBS洗滌3遍，加入4ml0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA液，37°C消化5min，加入4ml含10%胎牛血清培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，移液至離心管中離心后棄上清，加入DMEM-F12完全培養(yǎng)液重懸MSCs。
[0017]
[0018]所述膠原支架復(fù)合標(biāo)記SP10@Si02或Ag2S_QDs標(biāo)記的MSCs由以下方法制備:
[0019]培養(yǎng)基濕潤膠原支架后將標(biāo)記SP10@Si02或Ag2S_QDs的MSCs細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，放入37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)15min。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于試劑盒與傳統(tǒng)干細(xì)胞標(biāo)記方法相比采用干細(xì)胞納米粒子雙標(biāo)記法示蹤干細(xì)胞，與以往示蹤方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn):可在體定位干細(xì)胞至術(shù)后一周，可揭示干細(xì)胞定植后的組織外轉(zhuǎn)移部位。所用對比劑SP10@Si02和Ag2S-QDs已經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明生物相容性好，磁共振儀器及近紅外量子點(diǎn)熒光成像儀已有商業(yè)化產(chǎn)品，技術(shù)可推廣程度高，技術(shù)可控，安全性好，有利于干細(xì)胞治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷的科學(xué)研究，保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。
【附圖說明】
[0021]圖1——不同數(shù)量級(jí)標(biāo)記SP10@Si02的MSCs體外MRI信號(hào)強(qiáng)度檢測示意圖，其中A 為 1 X 104 個(gè) /ml 標(biāo)記 SP10iSi02 的 MSCs 體外 MRI，B 為 1 X 105 個(gè) /ml 標(biāo)記 SP10iSi02 的MSCs 體外 MRI，C 為 1 X 106 個(gè) /ml 標(biāo)記 SP10iSi02 的 MSCs 體外 MRI，D 為 1 X 104 個(gè) /ml 未標(biāo)記 SP10iSi02 的 MSCs 體外 MRI，E 為 1 X 105 個(gè) /ml 未標(biāo)記 SP10iSi02 的 MSCs 體外 MRI，F(xiàn)為 1 X 106 個(gè) /ml 未標(biāo)記 SP10iSi02 的 MSCs 體外 MRI。
[0022]圖2-不同數(shù)量級(jí)標(biāo)記Ag2S_QDs的MSCs熒光強(qiáng)度檢測示意圖。
[0023]圖3——術(shù)后48小時(shí)7.0T超導(dǎo)小動(dòng)物專用磁共振掃描儀成像_T2加權(quán)橫斷位子宮成像。
[0024]圖4——術(shù)后一周7.0Τ超導(dǎo)小動(dòng)物專用磁共振掃描儀成像示意圖-Τ2加權(quán)橫斷位子宮成像。
[0025]圖5——術(shù)后一月離體大鼠內(nèi)生殖器近紅外量子點(diǎn)熒光成像示意圖.
[0026]圖6—普魯士藍(lán)染色陽性細(xì)胞在子宮和卵巢的分布示意圖，其中Α為IX 106個(gè)/ml標(biāo)記SP10@Si02干細(xì)胞修復(fù)后子宮的干細(xì)胞分布示意圖，B為1X106個(gè)/ml標(biāo)記SP100Si02干細(xì)胞修復(fù)后卵巢的干細(xì)胞分布示意圖，C為1X105個(gè)/ml標(biāo)記5?10略102干細(xì)胞修復(fù)子宮的干細(xì)胞分布示意圖，D為1X105個(gè)/ml標(biāo)記SP10@Si02干細(xì)胞修復(fù)后卵巢的干細(xì)胞分布示意圖，E為1X104個(gè)/ml標(biāo)記SP10@Si02干細(xì)胞修復(fù)子宮的干細(xì)胞分布示意圖，F(xiàn)為1X104個(gè)/ml標(biāo)記SP10@Si02干細(xì)胞修復(fù)后