一種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細胞，MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。
[0003]臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilicalcord mesencymal stem cells，UC-MSCs)是來源于胎兒臍帶沃頓氏膠的間充質(zhì)干細胞，與骨髓、脂肪間充質(zhì)干細胞一樣，其具有較強的自我更新及多向分化潛能，同時臍帶間充質(zhì)干細胞能分泌GM-CSF G-CSF，而骨髓、脂肪間充質(zhì)則不能。間充質(zhì)干細胞在分離培養(yǎng)后需要通過低溫冷凍保存，在使用時再經(jīng)過復(fù)蘇進行組織器官損傷修復(fù)。
[0004]文獻《人臍帶間充質(zhì)干細胞凍存復(fù)蘇后的生物學(xué)特征》(王有為，韓之波等，中國組織工程研究與臨床康復(fù)，第14卷，第10期2010 - 03 - 05出版)記載了當(dāng)前復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞的普遍方法:
[0005]UC-MSCs于液氮中凍存1個月后，從液氮中取出細胞，立即投入42°C水浴中融化。PBS洗滌后，以完全培養(yǎng)基于37°C、體積分數(shù)為5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)或進行其他物學(xué)特征檢測。
[0006]雖然上述復(fù)蘇的方法比較簡單、快捷，但是該方法復(fù)蘇后的細胞活力偏低，不利于后續(xù)的進行組織器官損傷修復(fù)等臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞的方法，使得所述方法能夠提高復(fù)蘇后臍帶間充質(zhì)干細胞的活力，并且仍然保持可以分化為成骨細胞、成脂細胞的能力。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0009]—種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞的方法，包括:
[0010]步驟1、將傳代至P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細胞先用間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時收集培養(yǎng)基上清，將各時間段上清離心后再取上清混合，獲得條件培養(yǎng)基；
[0011]步驟2、將凍存的臍帶間充質(zhì)干細胞解凍，并加入到步驟1收集的條件培養(yǎng)基中離心去上清，然后再次加入條件培養(yǎng)基重懸并培養(yǎng)至細胞融合度達到要求。
[0012]針對現(xiàn)有方法復(fù)蘇凍存的臍帶間充質(zhì)干細胞后細胞活力不高的問題，本發(fā)明在復(fù)蘇時不采用傳統(tǒng)方法中慣用的商業(yè)培養(yǎng)基(間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基)進行復(fù)蘇，而是采用培養(yǎng)過臍帶間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基來進行復(fù)蘇，可顯著改善復(fù)蘇后細胞活力不高的現(xiàn)象。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)利用條件培養(yǎng)液可有效提高復(fù)蘇細胞或組織的活力，而且不同來源的條件培養(yǎng)液對不同細胞、組織的活力有不同的促進或抑制作用。
[0013]其中，作為優(yōu)選，步驟1為:
[0014]將傳代至P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細胞按照5000-10000/cm2的細胞密度用間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，用Hanks清洗后，再用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時收集培養(yǎng)基上清，1000-2000rpm離心5_10min，去除沉淀，收集所有上清混合，濾膜過濾后獲得條件培養(yǎng)基。
[0015]對于本發(fā)明所述條件培養(yǎng)基中的細胞接種密度、離心操作的參數(shù)、培養(yǎng)時間和環(huán)境等可根據(jù)實際情況進行調(diào)節(jié)，本發(fā)明僅是給出比較優(yōu)選的參數(shù)，但并不僅限于這些參數(shù)及其組合，對于本發(fā)明其他方法步驟中出現(xiàn)的類似參數(shù)也不僅限于所提供的優(yōu)選參數(shù)及其組合。
[0016]作為優(yōu)選，所述間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0017]對于P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細胞可按照本領(lǐng)域常規(guī)的分離方法以及傳代方法來獲得，本發(fā)明提供了如下優(yōu)選的獲得方法:
[0018]將臍帶沃頓氏膠組織接種于培養(yǎng)皿中，加入間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后換液，每2-3天換液，待細胞融合度達到80% -90%,獲得P0代；
[0019]用胰酶消化P0代細胞，離心后用間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀并傳代培養(yǎng)，按照所述方式傳代至P3-P5代。
[0020]更進一步優(yōu)選的，將臍帶沃頓氏膠組織剪碎至1.0-20.0cm3后，將組織塊接種于培養(yǎng)皿中，加入間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基放置在37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7天后換液，每2-3天換液，待細胞融合度達到80% -90%,獲得P0代；
[0021]用0.25%胰酶消化P0代細胞，離心后用間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀，5000-10000/cm2細胞密度接種培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，按照所述方式傳代至P3-P5代。
[0022]在步驟2復(fù)蘇環(huán)節(jié)，將本發(fā)明所采用的條件培養(yǎng)基替代現(xiàn)有經(jīng)常采用的商業(yè)培養(yǎng)基，按照一般的做法復(fù)蘇即可。
[0023]作為優(yōu)選，步驟2為:
[0024]將凍存的臍帶間充質(zhì)干細胞放置在35_42°C的水浴鍋中，震蕩溫育30_60秒，然后加入到5-10倍體積的條件培養(yǎng)基中，以1000-2000rpm離心3_5分鐘，去上清，用條件培養(yǎng)基重懸沉淀，吹打混勻，并按照5000-10000/cm2的細胞密度用條件培養(yǎng)基放置在37°C、5%0)2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時后，更換條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達到80% -90%。
[0025]運用本發(fā)明所述方法復(fù)蘇凍存的臍帶間充質(zhì)干細胞，相比采用現(xiàn)有方法(《人臍帶間充質(zhì)干細胞凍存復(fù)蘇后的生物學(xué)特征》中記載的復(fù)蘇方法)復(fù)蘇后的細胞，其活力顯著提高，且依然保持間充質(zhì)干細胞良好的生物學(xué)特征，具有分化為成骨細胞和成脂細胞的能力?；诖?，本發(fā)明提供了所述條件培養(yǎng)基在復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞中的應(yīng)用。本發(fā)明所述條件培養(yǎng)基在不使用時可放置在_20°C培養(yǎng)箱保存6個月-12個月左右或放置在_80°C保存1年以上。需要使用時，恢復(fù)到37°C常溫使用。
[0026]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明以培養(yǎng)過臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)基上清為復(fù)蘇時的培養(yǎng)基，替代現(xiàn)有方法中普遍采用的間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基，依靠其中包含的多種細胞在增殖過程中分泌的活性物質(zhì)來促進復(fù)蘇后的臍帶間充質(zhì)干細胞的生長，進而提高其活力。
【附圖說明】
[0027]圖1所示為本發(fā)明復(fù)蘇方法和現(xiàn)有復(fù)蘇方法細胞復(fù)蘇后活力柱形圖；
[0028]圖2所示為本發(fā)明復(fù)蘇方法和現(xiàn)有復(fù)蘇方法細胞復(fù)蘇且培養(yǎng)72h后的細胞總數(shù)柱形圖；
[0029]圖3所示為空白組細胞表面抗原流式細胞儀檢測圖；
[0030]圖4所示為實驗組細胞表面抗原流式細胞儀檢測圖；
[0031]圖5所示為復(fù)蘇后細胞成骨誘導(dǎo)的鏡檢圖；
[0032]圖6所示為復(fù)蘇后細胞成脂誘導(dǎo)的鏡檢圖。
【具體實施方式】
[0033]本發(fā)明實施例公開了一種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品及方法進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0034]為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細胞的方法進行詳細說明。
[0035]實施例1:臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的收集
[0036]將臍帶沃頓氏膠組織剪碎至1.0-20.0cm3后，將組織塊接種于培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10% FBS)放置在37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7天后換液，每2_3天換液，待細胞融合度達到80% -90%，用0.25%胰酶消化細胞，離心后用完全培養(yǎng)基重懸沉淀，7 X 103/cm2細胞密度接種培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。取P3-P5代細胞進行條件培養(yǎng)基收集。
[0037]條件培養(yǎng)基收集:用于條件培養(yǎng)基的臍帶間充質(zhì)干細胞，先按照7X 103/cm2細胞密度接種培養(yǎng)皿，完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)24小時后，用Hanks清洗后，加入無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在24小時、48小時、72小時后，分別收集細胞培養(yǎng)基上清，將上清分裝于50mL離心管中，1000pm離心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取條件培養(yǎng)基，用0.22 μπι濾膜過濾，收集在無菌培養(yǎng)瓶中。放置在_20°C培養(yǎng)箱保存6個月-12個月左右