或放置在-80°C保存1年以上。需要使用時(shí)，恢復(fù)到常溫使用。
[0038]實(shí)施例2:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇
[0039]將凍存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞從液氮中取出，放置在35_42°C的水浴鍋中，震蕩溫育60秒，細(xì)胞解凍后，立即將凍存液加入到5倍體積的條件培養(yǎng)基中細(xì)胞懸液以lOOOrpm離心5分鐘，去上清，用條件培養(yǎng)基重懸沉淀；輕輕吹打混勻，并按照7 X 103/cm2細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿中，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。放置在37°C，5% C02培養(yǎng)箱靜置24小時(shí)后，更換條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞擴(kuò)增情況，細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80% -90%。
[0040]實(shí)施例3:復(fù)蘇細(xì)胞活力對(duì)比
[0041]實(shí)驗(yàn)組:按照實(shí)施例1制備獲得條件培養(yǎng)基，將凍存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞從液氮中取出，放置在35-42°C的水浴鍋中，震蕩溫育60秒，細(xì)胞解凍后，立即將凍存液加入到5倍體積的條件培養(yǎng)基中，取少量細(xì)胞懸液，加入臺(tái)盼藍(lán)，放置在細(xì)胞活力計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，其余細(xì)胞懸液以lOOOrpm離心5分鐘，去上清，用條件培養(yǎng)基重懸沉淀；輕輕吹打混勻，并按照7 X 103/cm2細(xì)胞密度接種六孔板中，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。放置在37°C，5 % C0 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，用胰酶消化離心細(xì)胞，用條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸液，加入臺(tái)盼藍(lán)，放置在細(xì)胞活力計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞總量計(jì)數(shù)
[0042]對(duì)照組:從液氮中取出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(與實(shí)驗(yàn)組為相同來(lái)源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞)立即放入42°C水浴鍋內(nèi)融化，PBS洗滌后，取出細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，以lOOOrpm離心5分鐘，去上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照7X 103/cm2細(xì)胞密度接種六孔板中，并放置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。用胰酶消化離心細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸液，加入臺(tái)盼藍(lán)，放置在細(xì)胞活力計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞總量的計(jì)算
[0043]兩者對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2，由圖1可以明顯看出，經(jīng)由本發(fā)明方法復(fù)蘇后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的活力接近95%，而現(xiàn)有方法復(fù)蘇后的細(xì)胞活力在85%左右，兩者相比具有顯著差異。同時(shí)，由圖2可以看出，在細(xì)胞復(fù)蘇且經(jīng)過(guò)72h的培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了現(xiàn)有方法，表明經(jīng)過(guò)本發(fā)明復(fù)蘇方法復(fù)蘇后的細(xì)胞活力較高，增殖能力強(qiáng)。
[0044]實(shí)施例4:流式細(xì)胞儀檢測(cè)復(fù)蘇后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志
[0045]按照實(shí)施例1、2復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，待復(fù)蘇后細(xì)胞融合度達(dá)到80 % -90 %，用0.25 %胰酶消化離心細(xì)胞，并計(jì)數(shù)后每管加入2 X 105細(xì)胞數(shù)，染色緩沖液洗1次，lOOOrpm離心5min ;棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細(xì)胞；加入⑶73、⑶90、⑶45、及HLA-DRA抗體各2 μ L，并設(shè)一管為空白對(duì)照；在4°C下，避光反應(yīng)15-20min ;染色緩沖液洗一次，lOOOrpm離心5min ;直接標(biāo)記的細(xì)胞棄上清，避光加入500 μ L的上樣緩沖液，混勻，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞樣品，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。
[0046]由圖3和圖4可知，間充質(zhì)干細(xì)胞陰性表面標(biāo)志⑶45 (白細(xì)胞陽(yáng)性)、HLA-DR(MHC-1I類(lèi)分子)為均呈現(xiàn)陰性，同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶73、⑶90均呈現(xiàn)陽(yáng)性。說(shuō)明復(fù)蘇后臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞依然保持間充質(zhì)干細(xì)胞的良好生物學(xué)特征。
[0047]實(shí)施例5:復(fù)蘇臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化鑒定
[0048]按照實(shí)施例1、2復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，待復(fù)蘇后細(xì)胞融合度達(dá)到80 % -90 %，用0.25 %胰酶消化離心細(xì)胞，按照1 X 103細(xì)胞/cm2接種于六孔板中，加入完全培養(yǎng)基，24h后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24h后，每隔2-3天換液，21天后進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0049]復(fù)蘇后的間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)3周后，由茜素紅染色可見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)說(shuō)明經(jīng)過(guò)條件培養(yǎng)基復(fù)蘇的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞仍然保持向成骨分化的潛能。
[0050]實(shí)施例6:復(fù)蘇臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化鑒定
[0051 ] 按照實(shí)施例1、2復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，待復(fù)蘇后細(xì)胞匯合度達(dá)到80 % -90 %，用0.25 %胰酶消化離心細(xì)胞，收集細(xì)胞后，并按照1 X 103細(xì)胞/cm 2接種于六孔板中，加入完全培養(yǎng)基，24h后，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、10%胎牛血清、0.5mM ΙΒΜΧ、1 μΜ地塞米松、ΙΟΟμΜ吲哚美辛、5yg/mL胰島素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天換液。四周后進(jìn)行油紅0染色，鑒定脂滴形成情況，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0052]復(fù)蘇后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)成脂誘導(dǎo)4周后，由油紅0染色可見(jiàn)紅色油滴，說(shuō)明經(jīng)過(guò)條件培養(yǎng)基復(fù)蘇的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞仍然保持向成脂分化的潛能。
[0053]以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括: 步驟1、將傳代至P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞先用間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)收集培養(yǎng)基上清，將各時(shí)間段上清離心后再取上清混合，獲得條件培養(yǎng)基； 步驟2、將凍存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞解凍，并加入到步驟I收集的條件培養(yǎng)基中離心去上清，然后再次加入條件培養(yǎng)基重懸并培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到要求。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I為: 將傳代至P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按照5000-10000/cm2的細(xì)胞密度用間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，用Hanks清洗后，再用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)收集培養(yǎng)基上清，1000-2000rpm離心5_10min，去除沉淀，收集所有上清混合，濾膜過(guò)濾后獲得條件培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述P3-P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)以下方法獲得: 將臍帶沃頓氏膠組織接種于培養(yǎng)皿中，加入間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后換液，每2-3天換液，待細(xì)胞克隆匯合度達(dá)到80% -90%,獲得PO代； 用胰酶消化PO代細(xì)胞，離心后用間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀并傳代培養(yǎng)，按照所述方式傳代至P3-P5代。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述P3-P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)以下方法獲得: 將臍帶沃頓氏膠組織剪碎至1.0-20.0cm3后，將組織塊接種于培養(yǎng)皿中，加入間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基放置在37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7天后換液，每2-3天換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80% -90%,獲得PO代； 用0.25%胰酶消化PO代細(xì)胞，離心后用間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀，5000-10000/cm2細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，按照所述方式傳代至P3-P5代。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基為含10% FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2為: 將凍存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞放置在35-42°C的水浴鍋中，震蕩溫育30-60秒，然后加入到5-10倍體積的條件培養(yǎng)基中，以1000-2000rpm離心3_5分鐘，去上清，用條件培養(yǎng)基重懸沉淀，吹打混勻，并按照5000-10000/cm2的細(xì)胞密度用條件培養(yǎng)基放置在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，更換條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80% -90%。7.權(quán)利要求1所述條件培養(yǎng)基在復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種復(fù)蘇臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。該方法將傳代至P3-P5代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)收集培養(yǎng)基上清，將各上清離心后再取上清混合，獲得條件培養(yǎng)基；將凍存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞解凍，并加入到條件培養(yǎng)基中離心去上清，然后再次加入條件培養(yǎng)基重懸并培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到要求。本發(fā)明以培養(yǎng)過(guò)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基上清為復(fù)蘇時(shí)的培養(yǎng)基，替代現(xiàn)有方法中普遍采用的間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，依靠其中包含的多種細(xì)胞在增殖過(guò)程中分泌的活性物質(zhì)來(lái)促進(jìn)復(fù)蘇后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高其活力。
【IPC分類(lèi)】C12N5/0775
【公開(kāi)號(hào)】CN105238750
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510791550
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 馮德龍, 王小燕
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年11月17日