一種分離胎盤造血干細(xì)胞的灌洗液、酶解液及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及干細(xì)胞領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種分離胎盤造血干細(xì)胞的灌洗液、酶解液及 方法。
【背景技術(shù)】
[0002]造血干細(xì)胞化emopoieticStemcell,服C)是存在于造血組織中的一群原始造血 細(xì)胞，它不是組織固定細(xì)胞，可存在于造血組織及血液中。造血干細(xì)胞是所有造血細(xì)胞和免 疫細(xì)胞的起源。
[0003] 隨著研究的日漸深入，HSC移植已經(jīng)成為治療許多惡性血液系統(tǒng)疾病及其他腫瘤 的有效手段。目前，HSC的主要來源是骨髓、外周血及廝血，骨髓和外周血HSC增殖和分化 能力下降，并且易受供者健康狀態(tài)影響，而廝血服C數(shù)量有限，運些限制因素使其不能滿足 日漸增長的HSC臨床應(yīng)用需求。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，胎盤中含有大量的早期干細(xì) 胞，包括數(shù)量豐富的造血干細(xì)胞。運些干細(xì)胞在胎盤中行使著造血的功能。胎兒出生后剝 離的胎盤內(nèi)所含的造血干細(xì)胞，是廝帶血的8~10倍，可供其自用幾次，甚至可提供給多個 成人患者的治療。
[0004] 此外，胎盤中提取的造血干細(xì)胞不但具有含量豐富、移植后排斥反應(yīng)低、無倫理障 礙等優(yōu)點，還有W下優(yōu)點：胎盤中的造血干細(xì)胞更為早期，增殖能力強；胎盤眾多的造血干 細(xì)胞還可用來大規(guī)模制備紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞/血小板，用來替代輸血。鑒于胎盤造血干細(xì) 胞的運些優(yōu)點，胎盤組織造血干細(xì)胞庫技術(shù)的開展是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大進展，將有效 解決移植時骨髓或動員后外周血來源不足，廝帶血數(shù)量不夠等技術(shù)難題，有望取代骨髓、動 員后外周血和廝帶血用于造血干細(xì)胞移植治療惡性血液系統(tǒng)疾病。 陽〇化]目前，胎盤服C的分離提取方法主要采用機械酶解法。盡管機械酶解法能獲取數(shù) 量充足的細(xì)胞，但雜細(xì)胞含量高、造血干細(xì)胞含量較低，造血干細(xì)胞活率低。此外，現(xiàn)有技術(shù) 中主要是對胎盤絨毛膜部位進行酶解消化，消化組織體積大，需要用大量的酶解液，生產(chǎn)成 本高；整個提取過程操作繁復(fù)、耗時長，提取的細(xì)胞數(shù)量波動性較大、污染幾率大大增加，不 利于工業(yè)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種分離胎盤造血干細(xì)胞的灌洗液、酶解 液及方法。
[0007] -種分離胎盤造血干細(xì)胞的灌洗液，包含緩沖液、雙抗、血管擴張劑和抗氧化劑。
[0008] 優(yōu)選地，所述灌洗液包含PBS、青-鏈霉素雙抗、酪妥拉明和維生素C。
[0009] 更優(yōu)選地，所述灌洗液中各組分在PBS中的含量為：1X~3X青-鏈霉素雙抗， 0. 01~0.Img/mL酪妥拉明，1~5mg/mL維生素C。
[0010] 一種分離胎盤造血干細(xì)胞的酶解液，包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、膠原酶I、膠原酶II、肝素 鋼、血管擴張劑、抗氧化劑和抗調(diào)亡試劑。
[0011] 優(yōu)選地，所述酶解液包含RPMI-1640培養(yǎng)基、膠原酶I、膠原酶II、肝素鋼、酪妥拉 明、維生素C和Z-VAD-FMK(Caspase抑制劑）。
[0012] 優(yōu)選地，所述酶解液各組分在RPMI-1640培養(yǎng)基中的含量為：0. 01~0. 05mg/mL 膠原酶1、0.01~0.05111邑/11114交原酶11、10~501]/1止肝素鋼、0.01~0.1111邑/1^酪妥拉明， 1 ~5mg/血維生素C、5 ~20ng/血Z-VAD-FMK。
[0013] 優(yōu)選地，所述酶解液各組分在RPMI-1640培養(yǎng)基中的含量為：0. 05mg/mL膠原酶 I、0.Olmg/mL膠原酶II、50U/mL肝素鋼、0. 05mg/mL酪妥拉明，3mg/mL維生素C、lOng/mL Z-VAD-歴。
[0014] 一種分離胎盤造血干細(xì)胞的方法，包括W下步驟：
[0015] S1、用灌洗液清洗胎盤內(nèi)血液；
[0016] S2、向胎盤內(nèi)灌注酶解液，室溫酶解0. 5~1.化； 陽017] S3、收集酶解后的酶解液，離屯、取細(xì)胞沉淀；
[0018] S4、用PBS重懸細(xì)胞沉淀，再添加1~3倍體積的徑乙基淀粉溶液，室溫下靜置 20~40min，取上層液體離屯、后棄去上清；用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀，室溫下裂解殘留 的紅細(xì)胞5~15min，離屯、后棄上清；
[0019] S5、用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，離屯、后棄上清，所得細(xì)胞沉淀即為胎盤造 血干細(xì)胞。
[0020] 優(yōu)選地，徑乙基淀粉溶液的濃度為6m/v%。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟S3在收集酶解后的酶解液后，用灌洗液灌注沖洗胎盤，收集灌 洗液并與收集的酶解后的酶解液合并為混合液，混合液離屯、后取細(xì)胞沉淀。
[0022] 優(yōu)選地，所述步驟S4中用PBS重懸細(xì)胞沉淀，再添加1~3倍體積的徑乙基淀粉 溶液，室溫下靜置20~40min;取上層液體300~800g離屯、5~lOmin;離屯、后棄去上清； 用1X紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀與1X紅細(xì)胞裂解液的體積比為1:5~1:10， 滿旋振蕩，室溫下裂解殘留的紅細(xì)胞l〇min，200~500g離屯、5~lOmin，離屯、后棄上清；
[0023] 優(yōu)選地，所述步驟S5中用20~40血RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，200~500g 離屯、5~lOmin，離屯、后棄上清，所得細(xì)胞沉淀即為胎盤造血干細(xì)胞。
[0024] 優(yōu)選地，胎盤浸沒于胎盤保存液中在0~4°C條件下保存運輸，6~12小時內(nèi)分離 胎盤造血干細(xì)胞；所述胎盤保存液包含青-鏈霉素雙抗、肝素鋼、低分子右旋糖酢和PBS，各 組分在PBS中的含量為：1X~3X青-鏈霉素雙抗、10~50U/mL肝素鋼、Im/v%低分子右 旋糖酢。
[00巧]本發(fā)明的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)：灌注酶解法提取胎盤造血干細(xì)胞的關(guān)鍵是提高造 血干細(xì)胞的提取數(shù)量、保證造血干細(xì)胞的存活率。因此，酶解液的組成成分成為至關(guān)重要的 因素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[00%] (1)酶解液組分簡單，除了培養(yǎng)基外，添加了抗調(diào)亡試劑化spase抑制劑、血管擴 張劑酪妥拉明、抗氧化劑維生素C和酶。RPMI-1640培養(yǎng)基作為溶劑，在酶解過程中為細(xì)胞 提供營養(yǎng)供給，保證了細(xì)胞的活率。Caspase抑制劑極大的抑制了細(xì)胞啟動調(diào)亡程序，提高 了細(xì)胞的活率。本發(fā)明酶解液比較溫和，同時使用膠原酶I和膠原酶II，不僅減少對細(xì)胞的 損傷，還可W在短時間內(nèi)更好的消化胎盤組織，釋放出組織里面的造血干細(xì)胞，提高分離得 至IJ的胎盤造血干細(xì)胞的數(shù)量和活率?？寡趸瘎┚S生素C可W增強細(xì)胞的抗氧化能力，提高 其抗逆能力，進而提高細(xì)胞的活率。酶解液中血管擴張劑酪妥拉明具有良好的血管擴張作 用，利用實驗中的灌注操作。肝素鋼則降低血管中的凝血現(xiàn)象，利于血液的排除。此外，酪 妥拉明和肝素鋼還有利于酶解液滲透至末端血管，充分消化胎盤組織。
[0027] (2)本發(fā)明灌洗液組分簡單，除了雙抗、PBS外，含有酪妥拉明、維生素C。青-鏈 霉素雙抗具有抗菌作用，防止污染。PBS用于維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓。酪妥拉明和維生素C的 作用與其在酶解液中的作用相同，維生素C用于增強細(xì)胞的抗氧化能力，提高細(xì)胞的活率； 酪妥拉明起血管擴張作用，利用實驗中的灌注操作。
[0028] (3)本發(fā)明分離胎盤造血干細(xì)胞的方法不止局限于分離絨毛膜組織中的造血干細(xì) 胞，還可通過酶解灌注法全方位提取胎盤的造血干細(xì)胞。整個操作過程簡單有效，實驗操 作時間短，顯著提高分離提取效率，獲得的細(xì)胞數(shù)量大，造血干細(xì)胞的含量大大提高，細(xì)胞 數(shù)量較穩(wěn)定；同時優(yōu)化提取分離的條件，盡可能的提高造血干細(xì)胞的存活率，細(xì)胞污染率極 低。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實施例1中方法制備的HSC不加抗體對照組的流式檢測結(jié)果。其 中，圖1-A和圖1-B為不加抗體的對照組。圖1-A為檢測單個核細(xì)胞總數(shù)的流式檢測圖，所 圈區(qū)域P1即表示單個核細(xì)胞總數(shù)所占百分比。圖1-B為檢測CD34陽性細(xì)胞數(shù)的流式檢測 圖，右側(cè)百分比為CD34陽性細(xì)胞在單個核細(xì)胞中的百分比。
[0030] 圖2為本發(fā)明實施例1中方法制備的HSC添加抗體檢測組的流式檢測結(jié)果。其 中，圖2-A和圖2-B為不加抗體的對照組。圖2-A為檢測單個核細(xì)胞總數(shù)的流式檢測圖，所 圈區(qū)域P1即表示單個核細(xì)胞總數(shù)所占百分比。圖2-B為檢測CD34陽性細(xì)胞數(shù)的流式檢測 圖，右側(cè)百分比為CD34陽性細(xì)胞在單個核細(xì)胞中的百分比。
【具體實施方式】
[0031] 為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實施例做進一步說明。
[0032] 本發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場購得。徑乙基淀粉溶液使用的是徑乙基淀粉 注射液，購自廣州醫(yī)藥有限公司，500血/包，其中徑乙基淀粉她巧的含量為6m/v%;lX紅 細(xì)胞裂解液購自廣州譽為生物科技儀器有限公司。本發(fā)明所述IX~3X的雙抗為本領(lǐng)域 常規(guī)的試劑濃度表示方法，一般所購買的青-鏈霉素雙抗均為高倍母液，如所購買的青-鏈 霉素雙抗多數(shù)為100倍濃度，在使用時會稀釋配置成低倍數(shù)，如1倍，1X雙抗的濃度為青霉 素lOOU/mL、鏈霉素100μg/mL。在配制胎盤保存液時，低分子右旋糖直接使用低分子右旋 糖酢葡萄糖注射液（購自廣州醫(yī)藥公司），其含有低分子右旋糖酢-40的濃度為6m/v%，含 有葡萄糖的濃度為5m/v%。
[0033] 本發(fā)明所用胎盤由某醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性 且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術(shù)前準(zhǔn)備無菌聚苯乙 締胎盤采集盒作為運送容器，內(nèi)裝胎盤保存液，采集后0~4°c條件下6~12小時內(nèi)送到制 備處分離制備胎盤造血干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述胎盤保存液包含廝血漿、葡萄糖、青-鏈霉素、 低分子右旋糖酢