專利名稱：：一種從生物轉(zhuǎn)化或多酶反應(yīng)液中分離純化胞二磷膽堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種胞二磷膽堿的分離純化方法。尤其是從生物轉(zhuǎn)化或多酶反應(yīng)液中，采用新型離子交換樹脂組合柱層析，分離純化胞二磷膽堿的方法。
背景技術(shù)：
：胞二磷膽堿(cytidinediphosphatecholine,簡(jiǎn)稱CDP-Choline，CDP-C)是機(jī)體卵磷脂合成的重要中間體，是磷脂代謝所必需的輔酶。在臨床上，CDP-C在腦中磷脂代謝受損的狀態(tài)下可以改善磷脂的代謝，從而促進(jìn)意識(shí)的恢復(fù)。對(duì)腦外傷、腦手術(shù)所致的意識(shí)障礙，以及對(duì)一些慢性病如腦卒中后遺癥、帕金森氏病、中樞性眩暈、耳鳴、青光眼和感覺性神經(jīng)耳聾有一定的療效。CDP—C可用化學(xué)合成和生物合成制備?；瘜W(xué)合成CDP-C通常需要制備一些中間體(如胞苷酸嗎啡胍鹽或胞嘧啶二磷酸二酚等)，工藝煩瑣；雖然Kennedy曾采用加入大量的二環(huán)己基羰基二亞胺(DCC)PH乍縮合劑直接縮合胞苷酸(CMP)和磷酸膽堿來制備CDP-C(KennedyE.P.,J.Biol.Chem,1956,222:185)，但DCC試劑價(jià)格昂貴，用于工業(yè)生成成本過高；Ki:kugawa[叫(Kikugawa，Chem.Pharmaceut.BuU,1971,19:1011)和上海實(shí)驗(yàn)生物研究所(海實(shí)驗(yàn)生物研究所核酸研究組，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1975，1:19)曾采用對(duì)甲苯磺酰氯代替DCC作縮合劑直接縮合CMP和磷酸膽堿來制備CDP-C，但仍存在著操作要求嚴(yán)格和轉(zhuǎn)化率不高等問題。利用生物體內(nèi)的相關(guān)酶系進(jìn)行生物法合成，具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、成本低等特點(diǎn)，因此近年CDP-C的生產(chǎn)大多都采用生物合成。生物合成中，以CMP與磷酸膽堿(鹽)為底物生物合成CDP-C最為成熟。如文獻(xiàn)給出了利用酵母生物轉(zhuǎn)化合成CDP-C的生產(chǎn)條件pH8.0，20mmol/LCMP,酵母550g/L，磷酸鹽緩沖液為200mmol/L，葡萄糖1000mmol/L,磷酸膽堿卯mmol/L，硫酸鎂20mmol/L，反應(yīng)時(shí)間在24-32小時(shí)，反應(yīng)溫度在28°C，CDP-C轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1977,(4):15-19)。生物合成的CDP-C反應(yīng)液中，含有蛋白質(zhì)，色素，未反應(yīng)完的磷酸鹽，磷酸膽堿，硫酸鎂，胞苷酸，以及葡萄糖代謝副產(chǎn)物和胞苷等物質(zhì)，這使CDP-C的分離純化帶來很多困難。CDP-C的分離提取先要經(jīng)過離心去除菌體，調(diào)酸、調(diào)堿去除蛋白；然后活性炭吸附洗脫；離子交換樹脂吸附，分部洗脫等步驟，一般回收率不超過40%，在工業(yè)生產(chǎn)中損耗嚴(yán)重(生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1976,8(3):199-205;黃穎，醫(yī)藥工業(yè),1985,16(1):3-5)。另外價(jià)格較貴的未反應(yīng)完的胞苷酸無法回收。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的問題在于公開一種組合柱層析法從生物轉(zhuǎn)化或多酶反應(yīng)液(以下簡(jiǎn)稱反應(yīng)液)中分離CDP-C的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，并適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的本發(fā)明采用新型離子交換樹脂組合層析法(圖1)。1#陽柱吸附中的色素，蛋白質(zhì)，胞苷，調(diào)節(jié)pH;2#陰柱分離CDP-C和CMP;3，柱濃縮CDP-C溶液。1#陽柱可采用大孔酚醛系弱酸樹脂(HD-1)。該樹脂可吸附大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等，亦可交換去除陽離子，如鈣、鎂離子及胞苷，這樣可以保護(hù)后續(xù)分離不受這些物質(zhì)的干擾，增加后續(xù)柱的吸附量。同時(shí)還可以吸附去掉大部分的色素，改變反應(yīng)液的pH為酸性。2#陰柱可采用大孔弱堿性苯乙烯陰離子交換樹脂如D301或多孔結(jié)構(gòu)的酚醛縮聚型弱堿性陰樹脂如D345或大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂如D315等。由于CDP-C所帶負(fù)電荷要小于CMP，通過控制pH值可將兩者在柱上分離，即CMP吸附到樹脂，而CDP-C流出。同時(shí)大部分陰離子可被吸附到此柱上。3#陰柱可采用強(qiáng)堿凝膠型陰離子交換樹脂，如華東理工大學(xué)HZ201或其它廠家生產(chǎn)的201x7，201x8等，粒徑在0.5-1.Omm之間。CDP-C可在此柱上得到濃縮，減少后續(xù)真空濃縮操作能耗。本發(fā)明的特征是，通過新型陰陽離子交換樹脂的有序組合層析，可一次性分離純化得到高純度的CDP-C，與老工藝相比，柱分離時(shí)間縮短，水耗量降低60%以上，產(chǎn)品容易結(jié)晶。本發(fā)明的方法依次包括如下步驟1)將過濾后CDP-C反應(yīng)液依次通過1、2、3#柱，使蛋白質(zhì)、色素、陽離子吸附在1#柱中，陰離子和CMP及少量CDP-C吸附在2#柱中，大量CDP-C吸附在3#柱中。2)用去離子水洗滌1-3#柱，使P柱出口不再含CMP。3)用pH5.0的溶液串洗2-3#柱，使2#柱出口不再含有CDP-C。4)用高濃度的鹽和鹽酸濃液將CDP-C從3#柱上洗脫，即可得到高純度的CDP-C溶液。5)用pH3.0的溶液洗脫2#柱上吸附的CMP。通過上述分離過程，可高收率的獲得CDP-C產(chǎn)品，并可回收大部分未反應(yīng)完的CMP,而其它副產(chǎn)物雜質(zhì)都被柱所吸收或被洗脫時(shí)洗掉。本發(fā)明所用的方法具有操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)品回率高，分離效果好，所得產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)異，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等特點(diǎn)。圖1為流程圖。由圖1所示本發(fā)明所說的方法依次包括如下步驟，1)將CDP-C反應(yīng)液過濾后，依次通過1#弱酸型陽離子交換樹脂柱，2#弱堿型陰離交換樹脂和3#強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂。上柱總量為"柱總交換量的5-30%(摩爾比)，最佳為10-15%，即每30升樹脂可交換1公斤胞二磷膽堿反應(yīng)液。柱l:柱2:柱3體積比為1:1.2-2.5:0.3-0.8，最佳為1:1.4-1.8:0.5-0.7。上柱的線速度為0.11-0.45米/小時(shí)，最佳為0.25-0.35米/小時(shí)。上柱液中CDP-C的含量為l-20mg/mL，最佳為5-10mg/mL。上柱完畢，用去離子水充分淋洗，使1#柱出口不含胞苷酸為止。2)用pH5.0的溶液淋洗2#柱，使2#柱的出口不含CDP-C為止。然后改用pH3.0的溶液洗脫2"主，回收含CMP部分，經(jīng)濃縮結(jié)晶得到CMP。3)用高濃度的鹽、酸混合溶液洗脫3#柱，所用的鹽可以為可溶性的鈉鹽或鉀鹽，本發(fā)明采用氯化鈉溶液，濃度為0.5-10%，最佳為3-5%。所用的酸溶液可以硫酸，鹽酸，磷酸等。本發(fā)明采用的稀鹽酸溶液，濃度為0.9-0.00001mol/L，最佳為0.1-0.001mol/L之間。得到的CDP-C溶液經(jīng)濃縮后，加入3-5倍體積的乙醇，結(jié)晶，即可得到純度和含量都在98%以上的產(chǎn)品。本發(fā)明所說的1#柱所用樹脂為大孔酚醛系弱酸樹脂，如HD-l,122，125等，粒徑在5-30目，最佳在10-20目；所說的2#柱所用樹脂為大孔弱堿性苯乙烯陰離子交換樹脂如D301或孔結(jié)構(gòu)的酚醛縮聚型弱堿性陰樹脂如D345或大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂如D315等，粒徑在在5-30目，最佳在10-20目；所說的3#柱可采用強(qiáng)堿凝膠型陰離子交換樹脂，如HZ201、201x7，201x8，AmberlitelRA-900等，粒徑在60-150目之間，最佳為80-100目之間。分析檢測(cè)方法鈣鎂離子采用鉻黑T指示劑。蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)顯色法測(cè)定。CDP-C和CMP采用HPLC法測(cè)定。具體實(shí)施方式實(shí)施例14000mLCDP-C反應(yīng)液，含CDP-C34.5g，CMP5.0g，磷酸鹽150g，磷酸膽堿40g，硫酸鎂9.7g，蛋白質(zhì)107mg，按順序通過1-3#柱，流速為0.3m/h。柱1尺寸為40xl000mm，裝處理過的HD-1(H+)樹脂1000mL;柱2尺寸為6OxlOOOmm，裝處理過的D315(OH-)樹脂2000mL;柱3的尺寸為30xl000mm，裝處理過的HZ201樹脂500mL。上柱完畢，用1000mL去離子水淋洗。斷開柱1和柱2。然后用1500mLpH5.0的稀鹽酸溶液淋洗柱2。斷開柱2和柱3。再用pH2的稀鹽酸溶液(含氯化鈉4%)洗脫柱3。收集含CDP-C的洗脫液約800mL，濃縮至100mL，用氫氧化鈉調(diào)pH7.5。加入400mL無水乙醇，攪拌均勻，置4。C放置16小時(shí)，過濾結(jié)晶，真空干燥得CDP-C鈉鹽27.9g，收率為80.9%。經(jīng)檢測(cè)CDP-C純度為98.8%，蛋白質(zhì)檢測(cè)為陰性，未檢測(cè)出磷酸鹽及鎂離子(〈10ppm)。另用pH3.0的稀鹽洗脫柱2，收集含CMP溶液，經(jīng)濃縮結(jié)晶，得到CMP4.5g，收率為90%。實(shí)施例2將實(shí)施例1中的CDP-反應(yīng)液4000mL，依次通過1-3#柱，流速為0.3m/h。柱1尺寸為40xl000mm，裝處理過的HD-1(H+)樹脂1000mL;柱2尺寸為60xl000mm，裝處理過的D301(OH-)樹脂2200mL;柱3的尺寸為30><1000mm，裝處理過的AmberliteIRA-900(OH-)樹脂450mL。其它按實(shí)施例1操作。結(jié)果得到CDP-C鈉鹽28.5g，純度98.9%，收率82.6g?；厥瞻账?.0g，收率為80%。實(shí)施例3將實(shí)施例1所得的CDP-C(A)和用傳統(tǒng)工藝制成的CDP-C(B)用無菌水配制成0.125g/mL溶液，真空密封，在110'C加熱30分鐘。冷卻，在430nm測(cè)定吸光度，結(jié)果如表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1一種從生物轉(zhuǎn)化或多酶反應(yīng)液中分離純化胞二磷膽堿的方法，包括如下步驟1)將CDP-C反應(yīng)液依次通過陽離子交換柱1、陰離子交換柱2和陰離子交換柱3；2)用去離子水洗滌柱1-3，使陽離子交換柱1出口不再含CMP；3)用pH5.0的溶液串洗陰離子交換柱2和陰離子交換柱3，使陰離子交換柱2出口不再含有CDP-C；4)用高濃度的鹽和鹽酸濃液將CDP-C從陰離子交換柱3上洗脫，即可得到高純度的CDP-C溶液；和，5)用pH3.0的溶液洗脫陰離子交換柱2上吸附的CMP。全文摘要本發(fā)明屬于生化分離
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于公開一種從生物轉(zhuǎn)化或多酶反應(yīng)液中分離CDP-C的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的CDP-C回收率低和胞苷酸無法回收的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的技術(shù)方案是將CDP-C反應(yīng)液依次通過陽離子交換柱1、陰離子交換柱2和陰離子交換柱3；用去離子水洗滌柱1-3；用pH5.0的溶液串洗陰離子交換柱2和陰離子交換柱3；用高濃度的鹽和鹽酸濃液將CDP-C從陰離子交換柱3上洗脫得到高純度的CDP-C溶液；用pH3.0的溶液洗脫陰離子交換柱2上吸附的CMP。本發(fā)明的方法分離時(shí)間縮短，水耗量降低60％以上，產(chǎn)品容易結(jié)晶，可高收率的獲得CDP-C產(chǎn)品，并可回收大部分未反應(yīng)完的CMP。文檔編號(hào)C07H1/06GK101096380SQ20071002241公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年5月10日優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日發(fā)明者丁慶豹,邱蔚然,閆蓬勃申請(qǐng)人:南通秋之友生物科技有限公司