專利名稱：：elF－5A同工型:衰老－誘導(dǎo)elF－5A；損傷－誘導(dǎo)elF－5A；生長(zhǎng)elF－5A和DHS的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以下內(nèi)容真核起始因子5A(“eIF-5A”)的獨(dú)特的同工型、編碼eIF-5A的多核苷酸、脫氧羥丁賴氨酸(hypusine)合酶(“DHS”)、編碼DHS的多核苷酸，以及eIF-5A同工型和DHS的的表達(dá)調(diào)節(jié)方法?，F(xiàn)有技術(shù)描述衰老是一個(gè)植物體生命過(guò)程中的末期。它預(yù)示死亡并且發(fā)生于生物體組織的各個(gè)水平上，包括整個(gè)植物、器官、花、果實(shí)、組織和單個(gè)細(xì)胞。多種體內(nèi)體外因子都可誘導(dǎo)衰老起始。衰老是植物體生命中或植物組織(如果實(shí)、花、葉)的一個(gè)復(fù)雜、高度受控的發(fā)育階段。衰老導(dǎo)致細(xì)胞膜和生物大分子的協(xié)同崩潰和隨之發(fā)生的代謝物向植物體其它部分的移動(dòng)。除了在正常的植物體發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的程序性衰老，細(xì)胞和組織的死亡及隨之發(fā)生的代謝物重定位也可以是由于外部，環(huán)境因子誘發(fā)的協(xié)同性反應(yīng)。衰老也被稱為壞死或細(xì)胞程序性死亡，誘導(dǎo)衰老過(guò)早起始的外部因子包括環(huán)境應(yīng)激(environmentalstress)如溫度、干旱、光照或營(yíng)養(yǎng)缺乏，也包括病原體攻擊。受到環(huán)境應(yīng)激作用的植物組織也產(chǎn)生乙烯，通常稱作應(yīng)激乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997，J.Exp.Botany，48181-189；Wright，M.，1974，Plant，12063-69)，已知在某些植物體中乙烯會(huì)引起衰老。衰老并不是一個(gè)被動(dòng)過(guò)程，更準(zhǔn)確的說(shuō)是一個(gè)主動(dòng)的受控過(guò)程，涉及特定基因的協(xié)同表達(dá)。在衰老過(guò)程中，總RNA量下降，許多基因的表達(dá)被關(guān)閉(Bate等1991，J.Exper.Botany，42，801-11；Hensel等1993，ThePlantCell，5，553-64)。但是，越來(lái)越多的證據(jù)表明衰老過(guò)程依賴于核基因的從頭轉(zhuǎn)錄。例如，除胞核作用、mRNA和蛋白合成的抑制劑可阻礙衰老。在對(duì)來(lái)自衰老葉和綠葉的mRNA體外翻譯的分子研究中發(fā)現(xiàn)，衰老葉的蛋白產(chǎn)物模式發(fā)生了變化(Thomas等1992，J.PlantPhysiol.，139，403-12)。使用差示篩選和扣除雜交技術(shù)，已從不同植物體中鑒別出許多代表衰老-誘導(dǎo)基因的cDNA克隆，包括單子葉植物和雙子葉植物，如擬南芥(Arabidopsis)、玉米、黃瓜、蘆筍、番茄、稻和馬鈴薯。鑒別出衰老過(guò)程中特異表達(dá)的基因有力證明了衰老的進(jìn)行需要從頭轉(zhuǎn)錄。在壞死和死亡發(fā)生以前，衰老過(guò)程中發(fā)生的事件顯示出高度的協(xié)調(diào)以允許最大限度的使用細(xì)胞成分。一定存在復(fù)雜的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)這個(gè)過(guò)程，包括對(duì)特異信號(hào)的感知和基因級(jí)聯(lián)表達(dá)的誘導(dǎo)。編碼衰老相關(guān)蛋白的基因表達(dá)很可能通過(guò)普通激活蛋白所調(diào)節(jié)，而激活蛋白依次直接或間接被激素信號(hào)活化。對(duì)這個(gè)過(guò)程的起始信號(hào)和隨后的協(xié)同作用的機(jī)制了解甚少?；虻膮f(xié)同表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄和翻譯因子包括起始因子。不同生物包括植物的翻譯起始因子已被分離和鑒定。翻譯起始因子可控制mRNA移出細(xì)胞核的速率，控制mRNA結(jié)合到核糖體的速率，并且在某種程度上可影響特定mRNAs的穩(wěn)定性(Zuk，etal.，EMBOJ.172914-2925(1998))。這樣一個(gè)并不是整體翻譯活性都需要的翻譯起始因子被確信為從胞核到胞質(zhì)穿梭運(yùn)輸特定mRNA亞群以利翻譯。Jao，等J.CellBiochem.86590-600，(2002)；Wang等JBiolChem27617541-17549(2001)；Rosoriusetal.J.CellSci.，112，2369-2380(1999)。這種翻譯因子稱為真核起始因子5A(eIF-5A)，它是已知的唯一一種含氨基酸羥丁賴氨酸的蛋白。Park，等JBiolChem26315264-15269(1988)。真核起始因子5A(eIF-5A)是一種基本蛋白因子，大小約為17kDa，參與真核細(xì)胞蛋白合成的起始作用。羥丁賴氨酸其特征在于存在羥丁賴氨酸，羥丁賴氨酸[N-(4-氨基-2-羥基丁基)賴氨酸]是一種獨(dú)特的修飾氨基酸，已知只存在于eIF-5A中。羥丁賴氨酸通過(guò)使多胺即亞精胺上的丁氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移至eIF-5A中特定賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基上并進(jìn)行羥化，從而翻譯后修飾形成羥丁賴氨酸。eIF-5A的激活包括使亞精胺上的丁氨基轉(zhuǎn)移至eIF-5A賴氨酸殘基上、形成羥丁賴氨酸并活化eIF-5A。在真核生物中，脫氧羥丁賴氨酸(DHS)合酶介導(dǎo)eIF-5A中羥丁賴氨酸的翻譯后形成。體外使用甲硫氨酰-嘌呤霉素實(shí)驗(yàn)表明羥丁賴氨酸修飾對(duì)eIF-5A的活性是必需的。通過(guò)脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHSEC1.1.1.249)和脫氧羥丁賴氨酸羥化酶(DHHEC1.14.99.29)對(duì)保守的賴氨酸殘基的轉(zhuǎn)化作用，羥丁賴氨酸翻譯后在eIF-5A上形成羥丁賴氨酸。DHS已從幾種植物中分離出，包括番茄(GenBankAccessionNumberAF296077)、擬南芥Arabidopsisthaliana)(AT-DHS；GenBankAccessionNumberAF296078)、煙草(Ober和Hartmann，1999)、康乃馨(GenBankAccessionNumberAF296079)和香蕉(GenBankAccessionNumberAF296080)，然而DHH基因仍未被識(shí)別。DHS將亞精胺的丁氨基轉(zhuǎn)移至eIF-5A的一個(gè)保守性賴氨酸殘基上4，將其轉(zhuǎn)化為脫氧羥丁賴氨酸。這個(gè)中間體形式的eIF-5A再被DHH羥化為羥丁賴氨酸。Park等Biol.Siganals6，115-123(1997)。體外eIF-5A脫氧羥丁賴氨酸型和羥丁賴氨酸型均可與mRNA結(jié)合。LiuPark等BiolSignals6166-174(1997)。盡管eIF-5A的功能并未被完全認(rèn)識(shí)，但有證據(jù)表明它可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂(Park等Biol.Chem.276(20)17541-17549(2001)；Tome等BiolSignals6150-156，(1997))和衰老(Wang等JBiolChem276(20)17541-17549(2001))。也可見美國(guó)專利6,538,182和美國(guó)申請(qǐng)09/725,019，兩者的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用被結(jié)合至本文中。一些生物含有一種以上的eIF-5A同工型，這些同工型須滿足以下前提，即每種同工型都是特定組的mRNA的特異穿梭載體，而這些mRNA涉及諸如細(xì)胞分裂和衰老之類的過(guò)程。Wang等人證明番茄果實(shí)變軟及自然和應(yīng)激誘導(dǎo)的葉衰老與DHSmRNA水平上升有關(guān)(Wang等JBiolChem276(20)17541-17549(2001))。此外，在轉(zhuǎn)基因番茄中引入一個(gè)組成性啟動(dòng)子控制下的DHScDNA反義片段來(lái)抑制DHS表達(dá)時(shí)，果實(shí)變軟和酸敗的推遲證明了這些轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)表現(xiàn)出明顯的衰老推遲。參見美國(guó)專利6,538,182和申請(qǐng)于2003年11月29日的美國(guó)申請(qǐng)09/725,019，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合至本文中。既然已知DHS活化eIF-5A，這些數(shù)據(jù)顯示羥丁賴氨酸-修飾的eIF-5A(活性eIF-5A)可通過(guò)選擇性翻譯衰老所需mRNA來(lái)調(diào)節(jié)衰老。這一點(diǎn)通過(guò)在擬南芥(“AT”)中表達(dá)一個(gè)組成性啟動(dòng)子控制下的全長(zhǎng)或3’UTRcDNA的反義序列以減量調(diào)節(jié)DHS得到進(jìn)一步證明。通過(guò)減量調(diào)節(jié)擬南芥DHS(“AT-DHS”)表達(dá)并減少其對(duì)eIF-5A活化的可用性，衰老被推遲了約2周(見美國(guó)專利6,538,182)。在這樣的轉(zhuǎn)基因植物里，不僅觀察到衰老被推遲，而且觀察到種子產(chǎn)量上升、對(duì)應(yīng)激的耐受力上升和生物量產(chǎn)出上升，而且這里每種表型的程度由DHS表達(dá)減量調(diào)節(jié)的程度所決定。Southernblot(Wang等2001)和BLAST分析表明番茄和擬南芥基因組中僅含有一個(gè)拷貝的DHS基因，因而為了尋靶負(fù)責(zé)衰老轉(zhuǎn)錄物運(yùn)出胞核的特異eIF-5A同工型，必須通過(guò)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的反義構(gòu)建體(具3’UTR)或利用植物對(duì)一個(gè)過(guò)表達(dá)基因進(jìn)行減量調(diào)節(jié)的天然能力(即通過(guò)利用正義(sense)多核苷酸來(lái)得到過(guò)量表達(dá))來(lái)鑒定和特異減量調(diào)節(jié)衰老特異eIF-5A同工型。植物沒(méi)有免疫系統(tǒng)，因而具有一種獨(dú)特方法來(lái)應(yīng)對(duì)病毒——這種方法稱為共抑制，這種方法可導(dǎo)致病毒RNA的序列特異性降解。當(dāng)轉(zhuǎn)基因處于一個(gè)強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(如花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動(dòng)子)控制下時(shí)，其對(duì)植物體來(lái)說(shuō)表現(xiàn)為病毒的轉(zhuǎn)錄物，并發(fā)生序列特異性降解，但不僅僅是轉(zhuǎn)入的基因，相應(yīng)內(nèi)源基因也被降解。(見綜述，F(xiàn)agardandVaucheret，AnnualReview.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，June；51167-194(2000))一些證據(jù)表明，對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的減量調(diào)節(jié)來(lái)說(shuō)共抑制作用的有效性，如不是更有效則與通過(guò)反義技術(shù)抑制表達(dá)的有效性相當(dāng)。發(fā)明概述本發(fā)明提供真核起始因子5A(“eIF-5A”)同工型衰老-誘導(dǎo)eIF-5A，損傷-誘導(dǎo)eIF-5A和生長(zhǎng)eIF-5A以及編碼這三種因子的多核苷酸。本發(fā)明提供這三種eIF-5A的反義多核苷酸，也提供包含這三種eIF-5A同工型的正義和反義多核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明也涉及這些因子的表達(dá)調(diào)節(jié)(提高/增量-調(diào)節(jié)或抑制)的方法。本發(fā)明也涉及脫氧羥丁賴氨酸合酶(“DHS”)和其編碼多核苷酸。本發(fā)明提供DHS的反義多核苷酸，也提供包含DHS的正義和反義多核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明也涉及DHS的表達(dá)調(diào)節(jié)(提高/增量-調(diào)節(jié)或抑制)的方法。附圖簡(jiǎn)述圖1為擬南芥的三種eIF-5A同工型序列對(duì)比。行1為衰老-誘導(dǎo)eIF-5A(美國(guó)6;538;182和未決申請(qǐng)(pengdingapplication)09/725,019已有描述)；行2為損傷-誘導(dǎo)eIF-5A；行3為生長(zhǎng)eIF-5A。圖2為擬南芥的三種eIF-5A同工型編碼區(qū)域序列對(duì)比。行1為衰老-誘導(dǎo)eIF-5A；行2為損傷-誘導(dǎo)eIF-5A；行3為生長(zhǎng)eIF-5A。圖3為擬南芥的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的基因組基因序列。圖4為擬南芥的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的基因組基因序列。圖5為擬南芥的生長(zhǎng)eIF-5A的基因組基因序列。圖6為雙載體pKYLX71-35S2圖譜。圖7為雙載體pGEM-TEasyVector圖譜。圖8為哥倫比亞生態(tài)型(Columbiaecotype)的擬南芥野生型植株不同組織中全部三種eIF-5A同工型的蛋白印跡雜交分析結(jié)果。圖9為哥倫比亞生態(tài)型(Columbiaecotype)的擬南芥野生型植株葉子感染72h后衰老-誘導(dǎo)eIF-5A和損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的蛋白印跡雜交分析結(jié)果。圖10為哥倫比亞生態(tài)型(Columbiaecotype)的擬南芥野生型植株葉發(fā)生損傷72h后三種eIF-5A同工型的RNA印跡雜交分析結(jié)果。圖11描述了衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A、損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A、生長(zhǎng)AteIF-5A的基因組DNA的PCR產(chǎn)物，分別為1、2、3號(hào)泳道。圖12為pGEM中的衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A、損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A、生長(zhǎng)AteIF-5A基因組序列的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖13為pKYLX71中的衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A、損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A、生長(zhǎng)AteIF-5A基因組序列的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖14是用含有正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的植株的T1平板照片。圖15為用正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T1植株在4周齡時(shí)的照片。圖16為用正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T1植株在5.5周齡時(shí)的照片。圖17為用正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株在播種后10天的照片。圖18為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T1植株在播種后10天的照片。圖19為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T1植株在4周齡時(shí)的照片。圖20為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株品系的蛋白雜交印跡分析。圖21為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系1A-1D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖22為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系2A-1D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖23為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系4A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖24為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系15A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖25為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系8A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖26為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系9E-H)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖27為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系11A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖28為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的T2植株(品系16A-D)4周齡(上方)、5周齡(左下方)和6周齡(右下方)時(shí)的照片。圖29為擬南芥不同植株品系種子的照片，包括野生型對(duì)照和被正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的品系。圖30為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的亞品系種子的平均大小柱狀圖。圖31為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的亞品系單個(gè)種子大小柱狀32是顯示單個(gè)種子重量與單個(gè)種子體積間的比例關(guān)系的曲線圖。圖33為用正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化的每個(gè)亞品系植株種子產(chǎn)量柱狀圖。圖34為正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株的表型概括。圖35為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(用反義全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A轉(zhuǎn)化)與野生型株對(duì)比。轉(zhuǎn)基因株表現(xiàn)出衰老推遲。圖36-38為用反義生長(zhǎng)eIF-5A轉(zhuǎn)化的植株的照片。圖39為構(gòu)建用以產(chǎn)生反義擬南芥3’DHS的載體時(shí)所用引物。圖40為載體構(gòu)建體。圖41為分離自擬南芥的損傷因子eIF-5A序列，及其反義構(gòu)建體的定位。圖42為載體構(gòu)建體。圖43為與假單胞桿菌溫育的葉片盤(discs)的平板計(jì)數(shù)。圖44為反義轉(zhuǎn)基因植株對(duì)野生型株的CFU圖。圖45為得自番茄葉cDNA文庫(kù)的番茄葉DHScDNA序列(SEQIDNO1)和其相應(yīng)的氨基酸序列(SEQIDNO2)。圖46為通過(guò)將番茄DHS基因序列與擬南芥基因庫(kù)中未鑒定序列(SEQIDNO5)對(duì)比得到的擬南芥DHS基因核苷酸序列。氨基酸間的間隙推測(cè)為內(nèi)含子。圖46B為相應(yīng)的擬南芥DHS氨基酸序列(SEQIDNO6)。圖46C為通過(guò)PCR得到的擬南芥DHScDNA的一個(gè)600堿基對(duì)的多核苷酸序列。圖46D為DHScDNA片段的相應(yīng)氨基酸序列。圖47為相應(yīng)的番茄葉DHS全長(zhǎng)氨基酸序列(SEQIDNO2)、相應(yīng)的擬南芥衰老-誘導(dǎo)DHS全長(zhǎng)氨基酸序列，以及人、酵母、真菌、古生菌(Archaeobacteria)的DHS氨基酸序列對(duì)比。三或四個(gè)序列間的相同氨基酸用方框標(biāo)出。圖48為番茄DHScDNA限制性酶切圖譜。圖49是以32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA為探針的，分離自番茄葉的基因組DNA的DNA雜交印跡分析結(jié)果。圖50為不同階段下分離自番茄花的RNA做RNA雜交印跡分析結(jié)果。頂部為總RNA的溴化乙錠染色凝膠電泳結(jié)果。每條帶含10μgRNA。底部是以32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA為探針的RNA雜交印跡的放射自顯影圖。圖51為不同成熟階段的番茄果實(shí)RNA的RNA雜交印跡分析結(jié)果，用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA為探針。每條帶含10μgRNA。圖52為分離自2M山梨醇處理干旱應(yīng)激下的番茄葉6h的RNA雜交印跡分析結(jié)果，每個(gè)帶含10μgRNA。印跡用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA探測(cè)。圖53是分離自低溫處理的番茄葉的RNA雜交印跡分析結(jié)果。圖53A為總RNA的溴化乙錠染色凝膠電泳結(jié)果，每條帶含10μgRNA。圖53B是以32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA為探針的RNA雜交印跡放射自顯影圖。圖53C為通過(guò)葉滲出液電導(dǎo)率測(cè)量的相應(yīng)分析滲漏數(shù)據(jù)。圖54為康乃馨DHS全長(zhǎng)(1384bp)cDNA克隆核苷酸序列(SEQIDNO9)，不包括polyA尾和5’末端非編碼區(qū)域。核苷酸下方為相應(yīng)氨基酸序列(373氨基酸殘基，SEQIDNO10)圖55是衰老中擬南芥葉的總RNA雜交印跡分析結(jié)果，32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)擬南芥DHScDNA為探針。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖56是不同階段康乃馨花瓣總RNA雜交印跡分析結(jié)果，32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)康乃馨DHScDNA為探針。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖57上方為番茄果實(shí)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因序列(SEQIDNO11)，下方為相應(yīng)氨基酸序列(SEQIDNO12)。圖58上方為康乃馨衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因序列(SEQIDNO13)，下方為相應(yīng)氨基酸序列(SEQIDNO14)。圖59上方為擬南芥衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因序列(SEQIDNO15)，下方為相應(yīng)氨基酸序列(SEQIDNO16)。圖60是擬南芥不同階段葉的總RNA雜交印跡分析結(jié)果，32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)擬南芥DHScDNA和32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因?yàn)樘结?。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖61是分離自番茄果實(shí)的果實(shí)花端著色(breakerBK)，紅-硬(red-firmRF)和紅-軟(red-soft，RS)階段的總RNA雜交印跡分析結(jié)果，32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA和32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因?yàn)樘结?。伴隨果實(shí)成熟，DHS和eIF-5A含量在紅-硬階段平行上調(diào)。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖62為經(jīng)山梨醇處理干旱應(yīng)激的番茄葉總RNA雜交印跡分析結(jié)果。C為對(duì)照，S為經(jīng)山梨醇處理的樣品。以32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA和32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因?yàn)樘结樧饔≯E。eIF-5A和DHS對(duì)干旱應(yīng)激的反應(yīng)是含量提高。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖63為番茄花蕾和開放并衰老中的花的總RNA雜交印跡分析結(jié)果，以32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA和32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因?yàn)樘结樧饔≯E。eIF-5A和DHS的含量在開放/衰老花中含量提高。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖64為寒害的番茄葉總RNA雜交印跡分析結(jié)果。以32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)番茄DHScDNA和32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因?yàn)樘结樧饔≯E。eIF-5A和DHS在復(fù)溫期間隨寒害的發(fā)展而含量提高。頂部為放射自顯影圖，底部為溴化乙錠染色凝膠圖。圖65為3.1周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達(dá)DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉(zhuǎn)基因株的照片，顯示轉(zhuǎn)基因株的葉比野生型大。圖66為4.6周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達(dá)DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉(zhuǎn)基因株的照片，顯示轉(zhuǎn)基因株的葉比野生型大。圖67為5.6周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達(dá)DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉(zhuǎn)基因株的照片，顯示轉(zhuǎn)基因株的葉比野生型大。圖68為6.1周齡的野生型擬南芥(左方)和反義方向表達(dá)DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉(zhuǎn)基因株的照片，顯示轉(zhuǎn)基因株的外形比野生型大。圖69是反義方向表達(dá)DHS基因的三個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥T1品系植株的種子產(chǎn)量增加的圖。以種子的體積來(lái)計(jì)量種子的產(chǎn)量。野生型株的SEn＝30。圖70為反義方向表達(dá)DHS3’末端基因(序列見圖80)的轉(zhuǎn)基因番茄植株(左方)和野生型株(右方)的照片，顯示轉(zhuǎn)基因株的葉和植株體都大于野生型株。照片攝于將植株幼苗移植至土中18天后。圖71為反義方向表達(dá)DHS3’末端基因(序列見圖36)的轉(zhuǎn)基因番茄植株(左方)和野生型株(右方)的照片，顯示轉(zhuǎn)基因株的葉和植株體都大于野生型株。照片攝于將植株幼苗移植至土中32天后。圖72-79為野生型番茄果實(shí)(頂部組)和反義方向表達(dá)全長(zhǎng)DHS基因的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)(底部組)的照片。果實(shí)在果實(shí)花端著色階段采集，在生長(zhǎng)室里成熟。自采集起的時(shí)間(以天為單位)顯示于每組的左上角。圖80為擬南芥衰老-誘導(dǎo)DHS基因的3’末端核苷酸序列(SEQIDNO30，上方)和相應(yīng)氨基酸序列(下方)，這個(gè)DNA片段被用來(lái)以反義方向轉(zhuǎn)化植株。圖81為番茄DHS基因的3’末端核苷酸序列(SEQIDNO31，上方)和相應(yīng)氨基酸序列(下方)，這個(gè)DNA片段被用來(lái)以反義方向轉(zhuǎn)化植株。圖82為600bp擬南芥DHS探針的核苷酸序列(SEQIDNO26，上方)和相應(yīng)氨基酸序列(下方)，該探針被用來(lái)分離全長(zhǎng)擬南芥基因。圖83為483bp康乃馨DHS探針的核苷酸序列(SEQIDNO27，上方)和相應(yīng)氨基酸序列(下方)，該探針被用來(lái)分離全長(zhǎng)康乃馨基因。圖84(a)和(b)為以反義方向表達(dá)DHS3’末端基因(序列見圖81)的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)(右方)和野生型果實(shí)(左方)的照片。野生型果實(shí)表現(xiàn)出花蒂腐(blossomendrot)，而轉(zhuǎn)基因果實(shí)則無(wú)。圖85為幾種植物的不同eIF-5A同工型序列對(duì)比，也顯示羥丁賴氨酸保守區(qū)域的對(duì)比。圖86為番茄衰老-誘導(dǎo)eIF-5A多核苷酸和氨基酸序列。圖87為擬南芥衰老-誘導(dǎo)eIF-5A和pKYLX71-正義衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的結(jié)構(gòu)。圖88為番茄衰老-誘導(dǎo)eIF-5A和pKYLX71-正義衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的結(jié)構(gòu)。圖89為擬南芥對(duì)照株和包含正義多核苷酸衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的轉(zhuǎn)基因株的對(duì)比照片。轉(zhuǎn)基因株比對(duì)照株有更粗的開花莖。圖90和圖91為包含正義多核苷酸衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的轉(zhuǎn)基因植株，(圖90為擬南芥，圖91為番茄)，轉(zhuǎn)基因株更發(fā)達(dá)的木質(zhì)部表明轉(zhuǎn)基因株木質(zhì)部產(chǎn)生作用增強(qiáng)。圖92為擬南芥對(duì)照植株和包含正義多核苷酸衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的擬南芥轉(zhuǎn)基因株的對(duì)比，在擬南芥中使用一個(gè)番茄正義多核苷酸衰老-誘導(dǎo)eIF-5A。轉(zhuǎn)基因株有比對(duì)照株有更粗的開花莖。圖93和94兩個(gè)柱狀圖顯示包含正義多核苷酸衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的轉(zhuǎn)基因植株有更高的木質(zhì)部產(chǎn)生作用。圖94涉及番茄的正義多核苷酸衰老-誘導(dǎo)eIF-5A。圖95為油菜(canola)的生長(zhǎng)eIF-5A氨基酸序列和多核苷酸序列。圖96為油菜的生長(zhǎng)eIF-5A和pKYLX71-正義生長(zhǎng)eIF-5A結(jié)構(gòu)。圖97為油菜DHS氨基酸序列和多核苷酸序列。圖98為油菜DHS和pKYLX71-正義DHS結(jié)構(gòu)。圖99的柱狀圖顯示在油菜里DHS的表達(dá)抑制提高了種子產(chǎn)量。圖100的柱狀圖，從左到右依次顯示擬南芥、油菜、番茄的生長(zhǎng)同工型eIF-5A增量調(diào)節(jié)和番茄DHS的增量調(diào)節(jié)。圖101為番茄生長(zhǎng)eIF-5A氨基酸和多核苷酸序列。圖102為番茄生長(zhǎng)eIF-5A和pKYLX71-正義生長(zhǎng)eIF-5A結(jié)構(gòu)。圖103為番茄損傷-誘導(dǎo)eIF-5A氨基酸序列和多核苷酸序列。圖104a和b為番茄損傷-誘導(dǎo)eIF-5A和pKYLX71-正義番茄損傷-誘導(dǎo)eIF-5A結(jié)構(gòu)。圖105為萵苣DHS多核苷酸的部分序列。圖106為pTA7001-3’UTR反義萵苣DHS構(gòu)建體。圖107A和B為苜蓿DHS氨基酸和多核苷酸序列。圖108A和B為香蕉DHS氨基酸和多核苷酸序列。圖109A和B為三角葉楊(cottonwood)DHS氨基酸和多核苷酸序列。圖110為香蕉黑條葉斑病球腔菌(mycosphaerellafijiensis)部分DHS氨基酸和多核苷酸序列。發(fā)明詳述在這里，術(shù)語(yǔ)“植物”指完整植株、植株的一部分、植物細(xì)胞，或指植物細(xì)胞群。可適用本發(fā)明方法的植物類型不限定，包括如乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物；產(chǎn)果型植物如杏樹、蘋果樹、橘樹、香蕉、葡萄、梨樹、番茄、草莓、鱷梨等；蔬菜如胡蘿卜、豌豆、萵苣、卷心菜、蕪菁、馬鈴薯、椰菜、蘆筍等；花卉類如康乃馨、玫瑰、菊花等；農(nóng)作物如玉米、稻谷、大豆、苜蓿等；和林木類如落葉樹、針葉樹、常綠樹等；一般而言，任何可接受并表達(dá)本發(fā)明的DNA分子的植物都適用于本發(fā)明。也可包括不同倍體水平的植物，包括單倍體、雙倍體、四倍體和多倍體。所用的植物可以是單子葉或雙子葉植物。這里轉(zhuǎn)基因植物定義為經(jīng)某種方法進(jìn)行遺傳修飾的植株，包括但不限于將異源或同源衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A或DHS的基因整合進(jìn)基因組的植株。被改變的遺傳物質(zhì)可編碼蛋白，也可含有一段調(diào)節(jié)或控制序列，或者其本身是或包含一段反義序列或正義序列，或編碼一段反義RNA或正義RNA且這些RNA是該植株的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A或DHSDNA或mRNA序列或是其部分片段的正義或反義序列。“轉(zhuǎn)基因”和“轉(zhuǎn)基因序列”定義為被整合到轉(zhuǎn)基因植物的外源基因或部分基因序列。這里用的術(shù)語(yǔ)“雜交”意指在合適的嚴(yán)格條件下進(jìn)行的核酸雜交，其條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)探針序列和靶序列特性來(lái)方便的確定。雜交和洗脫條件為本領(lǐng)域熟知的，而且也可方便的根據(jù)所需嚴(yán)格性通過(guò)改變溫育時(shí)間，溫度和/或溶液離子強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)條件。例如可參見Sambrook，J.etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989。條件選擇要依據(jù)待雜交序列長(zhǎng)度，特別是探針序列長(zhǎng)度、核酸的相對(duì)G-C含量、允許的錯(cuò)配量來(lái)進(jìn)行。當(dāng)需要兩條互補(bǔ)性較低的鏈進(jìn)行部分雜交時(shí)，優(yōu)選低嚴(yán)格性條件。當(dāng)需要完全互補(bǔ)或近似完全互補(bǔ)時(shí)，優(yōu)選高嚴(yán)格性條件。此處所說(shuō)的高嚴(yán)格性所指如下雜交液含6×SSC、0.01MEDTA、1×Denhardt溶液和0.5％SDS。雜交在約68℃進(jìn)行，當(dāng)進(jìn)行DNA克隆片段雜交時(shí)雜交時(shí)間約3-4h，當(dāng)進(jìn)行真核總DNA雜交時(shí)雜交時(shí)間約12-l6h。對(duì)較低嚴(yán)格性可降低雜交溫度至約42℃，低于雙鏈解鏈溫度(TM)。已知TM是G-C含量、雙鏈長(zhǎng)度和溶液離子強(qiáng)度的函數(shù)。這里所用的術(shù)語(yǔ)“基本序列同一性”(sustantialsequenceidentity)或“基本同源性”(substantialhomology)是指一段多核苷酸序列或氨基酸序列與另一段多核苷酸序列或氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和/或功能基本上等同。具有基本序列同一性或基本同源性的序列間的任何結(jié)構(gòu)或功能差異都是微小的，也就是說(shuō)這些差異不會(huì)影響這些序列在所需應(yīng)用中發(fā)揮期望作用的能力。例如，差異可能是由于不同種類生物在密碼子使用上的固有差別引起的。如果兩個(gè)或更多不同序列間有顯著量的序列重疊或相似性，或者即使有長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)不同但不同序列間表現(xiàn)出相似的物理特性，那么結(jié)構(gòu)上的差異就被認(rèn)為是微小的。這種物理特性包括如在限定條件下雜交的能力，或者對(duì)蛋白是免疫交叉反應(yīng)能力或相似的酶活性等。這些特性中的每一種都可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用本領(lǐng)域已知技術(shù)方便地確定。此外，如兩條多核苷酸序列至少有約70％，優(yōu)選約80％，最優(yōu)選約90％的相似性，則它們“基本互補(bǔ)”(substantialcomplementary)。如果兩條氨基酸序列在其多核苷酸的活性部分間至少有70％的相似性，則兩條氨基酸序列基本同源(substantialhomologous)。這里所用的短語(yǔ)“與(DNA或RNA分子的)相應(yīng)部分雜交”意為參與雜交的一方分子如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列(正義或反義方向)識(shí)別并雜交到另一方核酸分子的一段序列上，而后者核酸分子具有約和前者相同的大小并且有足夠的相似性以影響合適條件下的雜交。例如，一段100核苷酸長(zhǎng)的番茄損傷-誘導(dǎo)eIF-5A基因3’編碼或非編碼區(qū)域的反義序列，會(huì)識(shí)別并雜交到3’編碼或非編碼區(qū)域內(nèi)一段約100核苷酸核酸部分上，后者可以是AT損傷-誘導(dǎo)eIF-5A基因或其它任何植物的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A基因，只要兩條核酸分子有約70％或更高的相似性。要理解的是，“相應(yīng)區(qū)域”可允許雜交發(fā)生一些錯(cuò)配，因而“相應(yīng)區(qū)域”可小于或大于雜交到其上的分子，如大于或小于20％-30％，優(yōu)選大小差異不超過(guò)約12-15％。這里所用的術(shù)語(yǔ)，一個(gè)核酸(或多核苷酸)的“功能性衍生物”是指編碼衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A或DHS的核苷酸序列或基因的一個(gè)片段、變異體、同源物或類似物。一個(gè)功能性衍生物至少保留了衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5或DHS的編碼DNA的部分功能，使其使用與本發(fā)明一致。這種功能可包括在高度嚴(yán)格條件下與分離的天然衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5或DHS基因進(jìn)行雜交，或是與來(lái)自其它植物的基本同源DNA或其mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行雜交的能力，而這些衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5或DHS基因的反義序列抑制衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5或DHS的表達(dá)?；蚧駾NA序列的“片段”指這個(gè)核酸分子的任一亞組，如較短的多核苷酸或寡核苷酸?！白儺愺w”指與整個(gè)基因或基因的一個(gè)片段基本相似的分子，如含有一個(gè)或多個(gè)取代核苷酸的核苷酸取代變異體，但仍保持了與特定基因雜交的能力或者編碼能夠與天然DNA雜交的mRNA轉(zhuǎn)錄物的能力?！巴次铩敝竵?lái)自異屬或異種植物的片段或變異體序列?！邦愃莆铩敝敢粋€(gè)非天然的分子，它與整個(gè)分子、變異體或其片段具有基本相似或功能相關(guān)。“調(diào)節(jié)表達(dá)”指表達(dá)被抑制或增量調(diào)節(jié)。“抑制表達(dá)”指靶基因相應(yīng)蛋白和/或mRNA缺失或含量水平可探測(cè)性下降，如抑制衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5或DHS?！霸隽空{(diào)節(jié)”或”過(guò)度表達(dá)”指靶基因相應(yīng)蛋白和/或mRNA含量水平可探測(cè)性上升，如衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5或DHS。本發(fā)明中的分離的多核苷酸包括那些從天然來(lái)源分離出的，重組產(chǎn)生的或人工合成的多核苷酸。本發(fā)明中的分離的肽包括那些從天然來(lái)源分離出的，重組產(chǎn)生的或人工合成的肽。本發(fā)明的分離蛋白包括以融合蛋白形式表達(dá)的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A或DHS，優(yōu)選包含eIF-5A或DHS與麥芽糖結(jié)合蛋白融和的蛋白。本發(fā)明的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A或DHS肽的“功能性衍生物”包括衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A或DHS的片段、變異體、類似物或化學(xué)衍生物，它們至少保持部分活性或者保持與eIF-5A同工型或DHS的特異抗體進(jìn)行免疫交叉反應(yīng)的能力。eIF-5A或DHS肽的片段指蛋白分子的任一亞組。變異體肽可通過(guò)直接化學(xué)合成得到，例如使用該領(lǐng)域的已知方法。eIF-5A或DHS肽的類似物是指與整個(gè)蛋白或其片段具有基本相似性的非天然蛋白。eIF-5A或DHS的化學(xué)衍生物含有附加的肽或肽片段非正常部分的化學(xué)組成部分。通過(guò)使用能與選定的側(cè)鏈或末端殘基進(jìn)行反應(yīng)的有機(jī)衍生劑將修飾引入到肽或其片段上的靶氨基酸殘基上。依照本發(fā)明，eIF-5A或DHS肽可通過(guò)培養(yǎng)由本發(fā)明的多核苷酸(以正義方向)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行，根據(jù)克隆方案使細(xì)胞以游離或融合蛋白形式合成蛋白，再?gòu)募?xì)胞提取物或培養(yǎng)基中分離蛋白。或者，可在一個(gè)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)蛋白。Ranu，等Meth.Enzymol.，60459-484，(1979)。質(zhì)粒DNA的制備、限制性內(nèi)切酶消化、DNA瓊脂糖凝膠電泳、蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR、DNA雜交印跡、RNA雜交印跡、DNA連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化這些操作按本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行。參見如Sambrook，J.etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989。Sambrook公開了核酸的雜交技術(shù)。與本發(fā)明一致的構(gòu)建重組核酸分子的程序參見，Sambrook，J.etal.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989.，和Maniatis，T.etal，MolecularmechanismintheControlofGeneexpression，eds.，Nierlich，etal，eds.，Acad.Press，N.Y.(1976)。后兩者通過(guò)引用完全結(jié)合到本文。與本發(fā)明一致的轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的植物轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化來(lái)制備。植物轉(zhuǎn)化方法包括直接與根癌土壤菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培養(yǎng)植株、組織或細(xì)胞，或直接感染(Miki，等Meth.inPlantMol.Biol.andBiotechnology，(1993))；直接將基因轉(zhuǎn)移入原生質(zhì)體或原生質(zhì)攝取(Paszkowski，etal.，EMBOJ.，122717(1984))；電穿孔(Fromm，等Nature，319719(1986))；微粒轟擊(Klein等BioTechnology，6559-563(1988))；注射進(jìn)苗或植物的分生組織(DeLaPena，等Nature，325274-276(1987))；注射進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞或組織的原生質(zhì)體(Reich，等BioTechnology，41001-1004(1986))。通常從轉(zhuǎn)化過(guò)程得到一個(gè)完整植物。植物從原生質(zhì)、愈傷組織、部分組織或移植體等中再生。從eIF-5A同工型或DHS表達(dá)被改變的再生轉(zhuǎn)基因植物得到的植物部分，如葉、花、果實(shí)、種子等都包含在這里所用的“植物”定義內(nèi)。再生植物的后裔、變異體、突變體也包含在“植物”的定義內(nèi)。eIF-5A總述本發(fā)明涉及三種不同亞型的eIF-5A衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A。本發(fā)明提供分離自不同種植物的eIF-5A不同亞型及其分離方法。本發(fā)明也提供了編碼這些不同亞型的多核苷酸。本發(fā)明還提供了eIF-5A同工型的反義多核苷酸，以及包含這些多核苷酸和反義多核苷酸的表達(dá)載體。在一些實(shí)施方案中，提供通過(guò)使用包含eIF-5A同工型反義多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以抑制內(nèi)源eIF-5As表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，提供通過(guò)使用eIF-5A同工型正義多核苷酸來(lái)增量調(diào)節(jié)內(nèi)源eIF-5A的方法。自然狀態(tài)下，不同eIF-5A同工型根據(jù)植物生命階段或外部條件進(jìn)行增量或減量調(diào)節(jié)。如在衰老組織中，衰老-誘導(dǎo)eIF-5A受到增量調(diào)節(jié)。衰老-誘導(dǎo)eIF-5A被認(rèn)為通過(guò)將特定種類的mRNAs(涉及衰老途徑)穿梭運(yùn)出胞核到胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行翻譯從而參與植株或植物組織的進(jìn)一步衰老。當(dāng)減量調(diào)節(jié)或抑制衰老-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)時(shí)，植株和/或組織的衰老被推遲。轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)基因植物具有更大生物量產(chǎn)出、延長(zhǎng)的果實(shí)貯藏時(shí)間、延長(zhǎng)的花貯藏時(shí)間、種子變大、種子產(chǎn)量提高，證明了它們的衰老推遲。當(dāng)植株和/或植物組織被暴露于損傷事件如低溫、脫水或機(jī)械損傷時(shí)，損傷-誘導(dǎo)eIF-5A受到增量調(diào)節(jié)。通過(guò)減量調(diào)節(jié)損傷-誘導(dǎo)eIF-5A，與未轉(zhuǎn)化株或野生型株相比，轉(zhuǎn)基因株有更強(qiáng)的對(duì)病原體入侵引起的致命損害的抵御能力。當(dāng)植株處于生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)eIF-5A受到增量調(diào)節(jié)。通過(guò)增量調(diào)節(jié)生長(zhǎng)eIF-5A，使得轉(zhuǎn)基因株有更大的種子、更高的生物量產(chǎn)出及種子產(chǎn)量。圖1顯示了分離自擬南芥(“AT”)的三種eIF-5A同工型的對(duì)比。圖2顯示了這些同工型編碼區(qū)域的對(duì)比。圖3-5提供了這些同工型的基因組序列。蛋白質(zhì)雜交印跡(見圖8)顯示這三種同工型在植物體生命不同階段的表達(dá)。圖8揭示當(dāng)葉齡增長(zhǎng)，衰老-誘導(dǎo)eIF-5A含量增加。而其在未開放花蕾、長(zhǎng)角果或莖芽中觀察不到，但在吸漲(imbibed)種子中可觀察到。在吸漲種子中，有子葉組織和發(fā)育中的胚胎。因此衰老-誘導(dǎo)eIF-5A在吸漲種子里存在是由于當(dāng)胚胎發(fā)育時(shí)子葉正在衰老。生長(zhǎng)eIF-5A存在于吸漲種子的原因在于胚胎在活躍生長(zhǎng)。損傷-誘導(dǎo)eIF-5A存在于長(zhǎng)角果、種子、莖中的原因是采集這些部位時(shí)引起了損傷。盡管不同同工型間和來(lái)自不同種植物的同工型間有高度同源性(約85％)，但不同同工型的3’UTR區(qū)域不同。同工型間和不同種植物同工型間的一個(gè)高度保守區(qū)域確信為羥丁賴氨酸位點(diǎn)。羥丁賴氨酸位點(diǎn)確信為以下氨基酸5’-CKVVEVSTSKTGKHGHAKCHFV-3’(SEQIDNO＿)。圖85顯示不同eIF-5A同工型和幾種植物的對(duì)比。衰老-誘導(dǎo)eIF-5A衰老-誘導(dǎo)eIF-5A在衰老組織中表達(dá)。本發(fā)明涉及到在擬南芥、番茄和康乃馨中發(fā)現(xiàn)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A。衰老-誘導(dǎo)eIF-5A在衰老組織中受增量調(diào)節(jié)，并且在植物和植物組織中涉及與形態(tài)變化相關(guān)的衰老誘導(dǎo)。抑制衰老-誘導(dǎo)eIF-5A在植株中的表達(dá)可改變衰老和衰老相關(guān)過(guò)程?？赏ㄟ^(guò)使用反義構(gòu)建體或使用正義構(gòu)建體以引起共抑制來(lái)進(jìn)行減量調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)基因植物中抑制衰老-誘導(dǎo)eIF-5A引起不同形態(tài)學(xué)變化，包括生物量提高、果實(shí)變軟或壞死推遲、花切片或植物組織如萵苣葉切段的褐變推遲、種子變大和種子產(chǎn)量提高。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是從擬南芥分離的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A。氨基酸序列見圖59，(SEQIDNO＿)。其編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖59，(SEQIDNO＿)。另一實(shí)施方案是從番茄分離的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A。氨基酸序列見圖57和86，(SEQIDNO＿)。其編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖57和86，(SEQIDNO＿)。還有一實(shí)施方案是從康乃馨分離的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A。氨基酸序列見圖58，(SEQIDNO＿)。其編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖58，(SEQIDNO＿)。本發(fā)明也提供分離的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A多核苷酸，其與上述列舉的衰老-誘導(dǎo)eIF-5A編碼多核苷酸有90％同源性，并可在嚴(yán)格條件下與這些多核苷酸的互補(bǔ)序列或與其它編碼衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的多核苷酸進(jìn)行雜交。本發(fā)明也提供衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的反義多核苷酸。這種反義多核苷酸可以為任何長(zhǎng)度，只要它能夠抑制表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所用的反義多核苷酸包括全長(zhǎng)編碼區(qū)，在另一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案里，反義多核苷酸定位在3’UTR，因?yàn)椴煌膃IF-5A同工型在3’UTR有高度的差異。在一些實(shí)施方案里，反義多核苷酸會(huì)定位至5’非編碼區(qū)。已知與5’非編碼區(qū)基本互補(bǔ)的反義多核苷酸是轉(zhuǎn)錄因子編碼基因表達(dá)的有效抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993)。這里及權(quán)利要求書所用的術(shù)語(yǔ)“衰老-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補(bǔ)序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體，不管來(lái)自天然或人工制備，與衰老-誘導(dǎo)eIF-5A相應(yīng)部分至少有80％的同源性并且可在高度嚴(yán)格條件下與相應(yīng)部分發(fā)生雜交。此外，變異體必須具有本發(fā)明需要的功能，也就是說(shuō)，當(dāng)將它們引入一個(gè)表達(dá)載體并且此載體被整合到至少一個(gè)植物細(xì)胞的基因組時(shí)，變異體能夠調(diào)節(jié)內(nèi)源衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用這一特點(diǎn)，即在反義多核苷酸中進(jìn)行非實(shí)質(zhì)改變不會(huì)對(duì)反義多核苷酸結(jié)合至轉(zhuǎn)錄物并減少或抑制基因表達(dá)的能力產(chǎn)生有害的影響。因此，術(shù)語(yǔ)“反義多核苷酸”包括那些與轉(zhuǎn)錄物基本互補(bǔ)的序列和那些仍可特異結(jié)合轉(zhuǎn)錄物并抑制或減少基因表達(dá)的能力的反義序列。反義多核苷酸綜述見，Alberts，etal.，MolecularBiologyoftheCell，2nded，GarlandPubIishing，Inc.NewYork，1989(尤其是195-196頁(yè)，通過(guò)引用結(jié)合至本文)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供包含衰老-誘導(dǎo)eIF-5A多核苷酸(本發(fā)明中如上述)或衰老-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸(本發(fā)明中如上述)的表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒(優(yōu)選)，或是病毒，或者是本領(lǐng)域內(nèi)已知的用以在植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)其上編碼基因的其它載體。載體被整合至染色體上，使得它可以被轉(zhuǎn)錄出所需的衰老-誘導(dǎo)eIF-5ARNA的反義多核苷酸?？捎帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，重組DNA技術(shù)來(lái)構(gòu)建這樣的質(zhì)粒或病毒載體。例如，載體可以是含有可在原核宿主中發(fā)揮功能的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明的反義多核苷酸的質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是含有可在土壤桿菌(Agrobacterium)中發(fā)揮功能的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明中的反義多核苷酸的質(zhì)粒?？稍谕寥罈U菌中復(fù)制的質(zhì)粒在本領(lǐng)域內(nèi)已得到充分認(rèn)識(shí)。參見Miki，etal.，ProceduresforIntroducingForeignDNAIntoPlants，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，Eds.B.R.GlickandJ.E.Thompson.CRCPress(1993)，PP.67-63。此外載體包含有效連于所述多核苷酸的調(diào)節(jié)序列，以允許多核苷酸的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列可包括在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中作用的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型、組成型或組織特異型。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這些啟動(dòng)子?？捎行c本發(fā)明的不同eIF-5A同工型和DHS組合并產(chǎn)生該基因的正義或反義轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件總體上包括任何植物啟動(dòng)子，更詳細(xì)的講，包括組成性啟動(dòng)子如無(wú)花果瘤鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子、花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、MAS啟動(dòng)子，或組織特異性的或衰老-誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如康乃馨花瓣GST1啟動(dòng)子或擬南芥SAG12啟動(dòng)子(參見如J.C.Palaqui等PlantPhysiol.，1121447-1456(1996)；Morton等MolecularBreeding.1123-132(1995)；Fobert等PlantJournal，6567-577(1994)；Gan等PlantPhysiol.，113313(1997)，均通過(guò)引用結(jié)合到本文)。優(yōu)選在本發(fā)明使用組成型啟動(dòng)子。當(dāng)使用衰老-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸時(shí)優(yōu)選使用SAG12啟動(dòng)子，見實(shí)施例23。本發(fā)明中的有效啟動(dòng)子的表達(dá)水平可使用常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)測(cè)量，例如通過(guò)測(cè)量報(bào)告基因的產(chǎn)物量，如測(cè)量導(dǎo)入了啟動(dòng)子/報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植物的花、葉、果實(shí)和其它組織細(xì)胞提取物中相應(yīng)蛋白或mRNA的含量。典型報(bào)告基因例如GUS。調(diào)節(jié)序列可任意包含5’非翻譯前導(dǎo)序列或多聚腺嘌呤信號(hào)或增強(qiáng)子。此外本發(fā)明也考慮了為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明也提供經(jīng)包含衰老-誘導(dǎo)eIF-5A正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、產(chǎn)生自這種細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因苗或成熟的轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因植物的部分如花、果實(shí)、葉、種子等。本發(fā)明還提供抑制內(nèi)源衰老-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)的方法。包括將本發(fā)明中包含衰老-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸的表達(dá)載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該反義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并抑制內(nèi)源衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)。在另一種抑制內(nèi)源衰老-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)的方法里，包含本發(fā)明中衰老-誘導(dǎo)eIF-5A正義多核苷酸的表達(dá)載體被整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該正義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并引起外源衰老-誘導(dǎo)eIF-5A共表達(dá)，從而減量調(diào)節(jié)或抑制內(nèi)源衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)。損傷-誘導(dǎo)eIF-5A損傷-誘導(dǎo)eIF-5A在損傷組織里表達(dá)。本發(fā)明涉及在擬南芥和番茄中對(duì)損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)這種同工型在植物受損傷時(shí)受增量調(diào)節(jié)。增量調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。此外，發(fā)生致病感染后，它只在蛋白水平受到增量調(diào)節(jié)，引起細(xì)胞死亡，因而推論損傷-誘導(dǎo)eIF-5A在病原體入侵事件中驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡。圖9顯示衰老-誘導(dǎo)eIF-5A在對(duì)照植株、模擬處理(mocktreatment)株、Avr處理株和Vir處理株內(nèi)的含量保持恒定(在植株4周齡時(shí)檢測(cè)得到)。而損傷-誘導(dǎo)eIF-5A在Vir處理株里受到增量調(diào)節(jié)。圖10顯示一個(gè)用止血鉗損傷葉子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分別在損傷后立即、1h、9h測(cè)量衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A的含量水平。RNA雜交印跡分析顯示衰老-誘導(dǎo)eIF-5A含量不變，但損傷-誘導(dǎo)eIF-5A含量顯著上升。生長(zhǎng)eIF-5A的含量水平在損傷事件里開始下降。本發(fā)明證實(shí)當(dāng)損傷-誘導(dǎo)eIF-5A受到增量調(diào)節(jié)同時(shí)植株遭損傷時(shí)(如移植幼苗)這個(gè)損傷會(huì)引起對(duì)生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)的非常強(qiáng)的抑制。見圖14-17。結(jié)果植株生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈阻礙。但是當(dāng)用卡那霉素浸泡種子并直接播種于土壤(無(wú)需移植因而無(wú)移植損傷)，種子會(huì)長(zhǎng)成正常大小的植株。均有正義損傷-誘導(dǎo)eIF-5A構(gòu)建體整合入的不同試驗(yàn)株間的差異(圖15)是由于損傷-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)水平不同引起的。當(dāng)引入一個(gè)基因(正義或反義)時(shí)可得到不同程度的增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用這一特性。差異的程度取決于基因的整合位置與整合拷貝數(shù)。通過(guò)表達(dá)水平差異可將不同表型與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)起來(lái)。一旦所需表型產(chǎn)生，即可選出該植株并用來(lái)產(chǎn)生所需后代。因而在圖15中，對(duì)損傷-誘導(dǎo)eIF-5A實(shí)施強(qiáng)增量調(diào)節(jié)的植株在受損傷后幾乎不生長(zhǎng)(標(biāo)簽10-株)，而生長(zhǎng)稍好的植株(但也不如野生型株)(標(biāo)簽4-株)的增量調(diào)節(jié)強(qiáng)度遜于前者。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是從擬南芥分離的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A。氨基酸序列見圖41(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖41(SEQIDNO＿)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是從番茄分離的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A。氨基酸序列見圖103(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖103(SEQIDNO＿)。本發(fā)明也提供分離的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A多核苷酸，具有與上述列舉多核苷酸序列90％的同源性，可在嚴(yán)格條件下與所列舉多核苷酸的互補(bǔ)序列或其它編碼損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的序列進(jìn)行雜交。本發(fā)明還提供損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的反義多核苷酸。這種反義多核苷酸可以為任何長(zhǎng)度，只要它能夠抑制表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所用的反義多核苷酸包括全長(zhǎng)編碼區(qū)，在另一些更優(yōu)選的實(shí)施方案里，定位至3’UTR，因?yàn)椴煌膃IF-5A同工型在3’UTR有更高程度的差異。在一些實(shí)施方案里，反義多核苷酸定位至5’非編碼區(qū)。已知與5’非編碼區(qū)基本互補(bǔ)的反義多核苷酸是轉(zhuǎn)錄因子編碼基因表達(dá)的有效抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993).這里及權(quán)利要求書所用的術(shù)語(yǔ)“損傷-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補(bǔ)序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體如上文描述。變異體發(fā)揮本發(fā)明預(yù)期的功能，也就是當(dāng)其被導(dǎo)入一個(gè)表達(dá)載體并且此載體被整合到至少一個(gè)植物細(xì)胞的基因組內(nèi)時(shí)，變異體可調(diào)節(jié)內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一個(gè)表達(dá)載體，包含本發(fā)明中如上描述的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A多核苷酸或本發(fā)明中如上描述的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸。載體同上文描述。本發(fā)明也提供經(jīng)包含損傷-誘導(dǎo)eIF-5A正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、產(chǎn)生自這種細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因苗或成熟的轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因植物的部分如花、果實(shí)、葉、種子等。本發(fā)明還提供抑制內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)的方法。包括將本發(fā)明的包含損傷-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸的表達(dá)載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該反義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并抑制內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)。在另一種抑制內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)方法里，含本發(fā)明的損傷-誘導(dǎo)eIF-5A正義多核苷酸的表達(dá)載體被整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該正義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并引起外源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致減量調(diào)節(jié)或抑制內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)。通過(guò)抑制內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)，使所得的轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的抵御病原體引起的致命損害的能力。見實(shí)施例16和圖43，44。生長(zhǎng)eIF-5A本發(fā)明也涉及生長(zhǎng)eIF-5A。生長(zhǎng)eIF-5A在生長(zhǎng)組織中表達(dá)。當(dāng)用生長(zhǎng)eIF-5A正義多核苷酸增量調(diào)節(jié)生長(zhǎng)eIF-5A時(shí)，注意到三種表型改變種子變大、產(chǎn)量提高、生物量提高。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是從擬南芥分離生長(zhǎng)eIF-5A。氨基酸序列見圖1(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸見圖2(SEQIDNO＿)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是從番茄分離的生長(zhǎng)eIF-5A。氨基酸序列見圖101(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸見圖101(SEQIDNO＿)。本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案是從油菜分離的生長(zhǎng)eIF-5A。氨基酸序列見圖95(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸見圖95(SEQIDNO＿)。本發(fā)明也提供分離的生長(zhǎng)eIF-5A多核苷酸，具有與上述列舉多核苷酸序列90％的同源性，可在嚴(yán)格條件下與所列舉多核苷酸的互補(bǔ)序列或其它編碼生長(zhǎng)eIF-5A的序列進(jìn)行雜交。本發(fā)明也提供生長(zhǎng)eIF-5A的反義多核苷酸。這種反義多核苷酸可以為任何長(zhǎng)度，只要它能夠抑制表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所用的反義多核苷酸包括全長(zhǎng)編碼區(qū)，在另一些更優(yōu)選的實(shí)施方案里，反義多核苷酸定位至3’UTR，因?yàn)椴煌膃IF-5A同工型在3’UTR有更高程度的差異。在一些實(shí)施方案里，反義多核苷酸會(huì)定位至5’非編碼區(qū)。已知與5’非編碼區(qū)基本互補(bǔ)的反義多核苷酸是轉(zhuǎn)錄因子編碼基因表達(dá)的有效抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993).這里及權(quán)利要求書所用的“生長(zhǎng)eIF-5A反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補(bǔ)序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體如上文描述。變異體發(fā)揮本發(fā)明預(yù)期的功能，也就是當(dāng)其被導(dǎo)入一個(gè)表達(dá)載體并且此載體被整合到至少一個(gè)植物細(xì)胞的基因組內(nèi)時(shí)，變異體可調(diào)節(jié)內(nèi)源生長(zhǎng)eIF-5A的表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一個(gè)表達(dá)載體，包含本發(fā)明的生長(zhǎng)eIF-5A多核苷酸或本發(fā)明的如上描述的生長(zhǎng)eIF-5A反義多核苷酸。載體同上文描述。本發(fā)明也提供經(jīng)包含生長(zhǎng)eIF-5A正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、產(chǎn)生自這種細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因苗或成熟的轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因植物的部分如花、果實(shí)、葉、種子等。本發(fā)明還提供抑制內(nèi)源生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)的方法。包括將本發(fā)明的包含損傷-誘導(dǎo)eIF-5A反義多核苷酸的表達(dá)載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該反義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并抑制內(nèi)源生長(zhǎng)eIF-5A的表達(dá)。在另一種抑制內(nèi)源生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)方法里，含本發(fā)明的生長(zhǎng)eIF-5A正義多核苷酸的表達(dá)載體被整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該正義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并引起外源生長(zhǎng)eIF-5A基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致減量調(diào)節(jié)或抑制內(nèi)源生長(zhǎng)eIF-5A的表達(dá)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了增量調(diào)節(jié)生長(zhǎng)eIF-5A的方法。包含本發(fā)明的生長(zhǎng)eIF-5A正義多核苷酸的表達(dá)載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該正義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并引起外源生長(zhǎng)eIF-5A基因的共表達(dá)，從而使細(xì)胞表達(dá)比非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞更多的生長(zhǎng)eIF-5A。圖19顯示生長(zhǎng)eIF-5A受增量調(diào)節(jié)的植物比對(duì)照植株有更高的生物量。生長(zhǎng)eIF-5A按正義方向被插入擬南芥植株以增量調(diào)節(jié)生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)。測(cè)定了16個(gè)母品系(1-16)以確定生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)的一般水平。每個(gè)母品系產(chǎn)生8個(gè)子品系(A-H)。測(cè)量每個(gè)母品系的生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)水平，結(jié)果見圖20。注意到由始至終母品系的表達(dá)水平差異。例如，品系2和10有很高的表達(dá)水平而品系11和16則很低或不表達(dá)。圖21和22顯示來(lái)自品系1和2的植株。這些植株大于對(duì)照株。因?yàn)樯L(zhǎng)eIF-5A是一個(gè)細(xì)胞分裂同工型而且因?yàn)樗墙M成型表達(dá)，細(xì)胞分裂作用增強(qiáng)。衰老減弱的出現(xiàn)是因?yàn)橹参锉还潭ㄓ谏L(zhǎng)模式并且不能轉(zhuǎn)換到衰老途徑。圖23和24為來(lái)自生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)水平中等的品系植株。它們顯示有更大的葉和衰老推遲。圖25和26為來(lái)自低水平增量調(diào)節(jié)的品系。它們有大的葉子和大的蓮座。圖27和28為來(lái)自無(wú)增量調(diào)節(jié)(可能由于基因共抑制)的品系植株。因?yàn)橹仓暧锌敲顾乜剐裕钥剐曰蚩隙ù嬖谝允怪仓暝谂囵B(yǎng)基上生長(zhǎng)。衰老-誘導(dǎo)eIF-5A也被共抑制，因此引起植株變大。除了生物量增加，增量調(diào)節(jié)生長(zhǎng)eIF-5A的植株種子變大。所有品系的種子大小均被測(cè)量。可觀察到生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)水平最高的品系種子變大了3倍以上。這是因?yàn)樯L(zhǎng)eIF-5A受到增量調(diào)節(jié)，增強(qiáng)細(xì)胞分裂作用，因而使種子變大。在以上例子中生長(zhǎng)eIF-5A(來(lái)自擬南芥)被組成型表達(dá)，也就是通過(guò)使用一個(gè)通用啟動(dòng)子使它在植株的所有部位均表達(dá)。相反，通過(guò)使用一個(gè)組織特異啟動(dòng)子，可使增量調(diào)節(jié)在特定組織里進(jìn)行。例如，通過(guò)使用種子特異啟動(dòng)子，生長(zhǎng)eIF-5A僅在種子中受增量調(diào)節(jié)，這樣允許葉子正常生長(zhǎng)而種子產(chǎn)量提高。因此，使用一個(gè)特異啟動(dòng)子，生長(zhǎng)eIF-5A可在所需植株部位受增量調(diào)節(jié)，以得到一個(gè)所需表型。通過(guò)增量調(diào)節(jié)生長(zhǎng)eIF-5A所得的三種表型——生物量提高、種子變大和產(chǎn)量提高，不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)(或表現(xiàn)在同一植株內(nèi))。例如，如果一個(gè)植株表現(xiàn)出種子變大，那么就會(huì)出現(xiàn)較小的植株。生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)水平最高的品系產(chǎn)生最大的種子，但植株較小，因?yàn)楸榧罢麄€(gè)植株的大量細(xì)胞分裂是在損害細(xì)胞變大的情況下(需要更大的葉)進(jìn)行的。在較低的生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)水平，可觀察到影響葉(變大)但不影響種子。因此可使用組織特異表達(dá)并選取所需表型。例如，可將生長(zhǎng)eIF-5A基因置于木質(zhì)部特異啟動(dòng)子控制下以獲得更高的木質(zhì)部產(chǎn)量。這樣，可用任何所需啟動(dòng)子來(lái)獲得所需組織特異型的增量調(diào)節(jié)。DHS激活eIF-5A必須有DHS參與，DHS在衰老組織中表達(dá)。因而本發(fā)明提供了分離自擬南芥、番茄、康乃馨、油菜、萵苣、苜蓿、香蕉、三角葉楊和球腔菌(mycosphaerella)的DHS。因此本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為分離自擬南芥的DHS。氨基酸序列見圖46(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖46(SEQIDNO＿)。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自番茄的DHS。氨基酸序列見圖45A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖45A和B(SEQIDNO＿)。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自康乃馨的DHS。氨基酸序列見圖54(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖54(SEQIDNO＿)。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自油菜的DHS。氨基酸序列見圖97(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖97(SEQIDNO＿)。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自萵苣的DHS。圖105為萵苣DHS編碼多核苷酸的部分序列。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自苜蓿的DHS。氨基酸序列見圖107A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖107A和B(SEQIDNO＿)。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自香蕉的DHS。氨基酸序列見圖108A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖108A和B(SEQIDNO＿)。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自三角葉楊的DHS。氨基酸序列見圖109A和B(SEQIDNO＿)，編碼該氨基酸的核苷酸序列見圖109A和B(SEQIDNO＿)。另一個(gè)實(shí)施方案為分離自球腔菌的DHS。圖110為球腔菌DHS編碼多核苷酸的部分序列。本發(fā)明也提供了分離的DHS多核苷酸，其與上文列舉的多核苷酸有90％同源性，并能在高度嚴(yán)格條件下與所列舉多核苷酸的互補(bǔ)序列或與其它編碼DHS的多核苷酸進(jìn)行雜交。本發(fā)明還提供了DHS的反義多核苷酸。該反義多核苷酸可為任意長(zhǎng)度，只要能夠抑制基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，反義多核苷酸包含全長(zhǎng)編碼序列，可定位到3’UTR或5’非編碼序列。已知與5’非編碼序列基本互補(bǔ)的反義多核苷酸是轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的有效表達(dá)抑制劑。Branch，M.A.，Molec.CellBiol.，134284-4290(1993).這里及權(quán)利要求書所用的術(shù)語(yǔ)“DHS反義多核苷酸”不僅包括與上文所列舉多核苷酸的互補(bǔ)序列有100％同源性的反義多核苷酸，也包括那些反義多核苷酸功能變異體。功能變異體如上文描述。變異體發(fā)揮本發(fā)明預(yù)期的功能，也就是當(dāng)其被導(dǎo)入一個(gè)表達(dá)載體并且此載體被整合到至少一個(gè)植物細(xì)胞的基因組內(nèi)時(shí)，變異體可調(diào)節(jié)內(nèi)源DHS的表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一個(gè)表達(dá)載體，包含DHS多核苷酸(本發(fā)明中如上描述的)或DHS反義多核苷酸(本發(fā)明中如上描述的)。載體同上文描述。本發(fā)明還提供經(jīng)包含DHS正義或反義多核苷酸的載體或組合載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、產(chǎn)生自這種細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因苗或成熟的轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因植物的部分如花、果實(shí)、葉、種子等。本發(fā)明也提供抑制內(nèi)源DHS表達(dá)的方法。包括將本發(fā)明包含DHS反義多核苷酸的表達(dá)載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該反義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并抑制內(nèi)源DHS的表達(dá)。在另一種抑制內(nèi)源DHS表達(dá)方法里，含本發(fā)明的DHS正義多核苷酸的表達(dá)載體被整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)。該正義多核苷酸被轉(zhuǎn)錄并引起外源DHS基因的共表達(dá)，從而導(dǎo)致減量調(diào)節(jié)或抑制內(nèi)源DHS的表達(dá)。通過(guò)抑制內(nèi)源DHS的表達(dá)，所得轉(zhuǎn)基因植株將缺失或顯著減少用以活化eIF-5A的DHS。如前文討論，eIF-5A必須經(jīng)活化方具有生物活性。因而，通過(guò)反義多核苷酸，或正義多核苷酸的共抑制來(lái)抑制或減少DHS的表達(dá)，所得轉(zhuǎn)基因株將缺失活性eIF-5A或只有減活的eIF-5A。這些轉(zhuǎn)基因株將表現(xiàn)出生物量的提高、種子變大和/或產(chǎn)量提高。包含DHS反義多核苷酸的轉(zhuǎn)基因株表現(xiàn)出更強(qiáng)的光合作用和更高的淀粉含量。見實(shí)施例24和25。使用DHS特異抑制劑處理康乃馨的實(shí)驗(yàn)是進(jìn)一步的證據(jù)，支持了DHS和eIF-5A調(diào)節(jié)衰老的論點(diǎn)。亞精胺和eIF-5A是DHS的底物(Park等1993；Park等1997)。一些結(jié)構(gòu)特征與亞精胺相似的單胺、二胺或多胺在體外抑制DHS的活性(Jakus等1993)。一些多胺，如亞精胺、腐胺、精胺，已被廣泛用來(lái)延長(zhǎng)康乃馨的花瓶保鮮時(shí)間(vaselife)(Wang和Baker，1980)。通過(guò)使用不同濃度的不同多胺，Wang等(unpublishedb)成功的將康乃馨的花瓶保鮮時(shí)間延長(zhǎng)了兩倍。使用瞬時(shí)感染系統(tǒng)來(lái)減量調(diào)節(jié)DHS的進(jìn)一步研究正在進(jìn)行。初步的數(shù)據(jù)顯示，用真空滲入瞬時(shí)感染可表達(dá)反義DHS的系統(tǒng)處理后，康乃馨花在切下后第8天的存活率高于未處理花4倍(Wang等unpublishedb)。農(nóng)業(yè)上農(nóng)作物損失除了由于生長(zhǎng)過(guò)程中壓力造成以外，另一主要損失來(lái)自收割后的環(huán)境壓力誘導(dǎo)的衰老(McCabe等2001)。這一點(diǎn)在部分收割植物上表現(xiàn)得尤為明顯，如收割后的萵苣。提示收割萵苣的信號(hào)之一為褐變，這是由酚類產(chǎn)物引起的(Matile等1999)。具有萵苣eIF-5A(LeIF-5A)反義多核苷酸或DHS全長(zhǎng)反義多核苷酸的轉(zhuǎn)基因萵苣的田間實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因萵苣收割后的抗褐變能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)表明即使由于收割引起的壓力誘導(dǎo)的衰老有不同的作用途徑(Page等2001)，褐變的翻譯上游控制和其它可能的衰老信號(hào)，至少在部分上被DHS和eIF-5A所調(diào)節(jié)。衰老的下游調(diào)節(jié)由執(zhí)行基因進(jìn)行，這些基因能夠影響衰老并引起代謝變化，產(chǎn)生衰老信號(hào)。當(dāng)eIF-5A和DHS受到減量調(diào)節(jié)，能負(fù)作用于衰老引起的所有信號(hào)。本發(fā)明也涉及識(shí)別這三種eIF-5A同工型的抗體，即衰老-誘導(dǎo)因子eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)因子eIF-5A和生長(zhǎng)因子eIF-5A。本發(fā)明也提供了在其它植物和真菌內(nèi)鑒別衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A、生長(zhǎng)eIF-5A或DHS的方法。通過(guò)使用這里的方法和提供的序列，來(lái)設(shè)計(jì)用以分離/鑒別所需同工型或DHS的探針。因?yàn)閑IF-5A同工型(衰老-誘導(dǎo)eIF-5A、損傷-誘導(dǎo)eIF-5A和生長(zhǎng)eIF-5A)通常在編碼區(qū)有高度同源性(見圖2)，為確保鑒定甚至改變所需同工型的擴(kuò)增，優(yōu)選自5’UTR的開始序列和3’UTR末端序列(見圖3，4和5)設(shè)計(jì)探針或引物。優(yōu)選的一組用以擴(kuò)增損傷-誘導(dǎo)eIF-5A基因或鑒別損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的探針的引物序列如下。下游引物5’GAGCTCAAGAATAACATCTCATAAGAAAC3’(SEQIDNO＿)，上游引物5’CTCGAGTGCTCACTTCTCTCTCTTAGG3’(SEQIDNO＿)。在從植株或植株某部分分離損傷-誘導(dǎo)eIF-5A前，最好對(duì)其進(jìn)行損傷處理以使該植株開始表達(dá)損傷-誘導(dǎo)eIF-5A。任何損傷事件均可接受，這種典型的損傷事件包括將葉片沿中央葉脈壓碎。類似的在分離衰老-誘導(dǎo)eIF-5A以前，最好對(duì)其實(shí)施壓力以誘導(dǎo)衰老。至此已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了廣泛的描述，通過(guò)參考以下實(shí)施例將能更易于理解本發(fā)明，舉出下列實(shí)施例的目的是為了說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。實(shí)施例實(shí)施例1信使RNA(mRNA)的分離從番茄處于不同發(fā)育階段的花和果實(shí)中分離出總RNA，也從葉中(未處理或低溫處理或山梨醇處理)分離總RNA。取5g組織在液氮中快速磨碎。然后將研磨粉末與30ml胍緩沖液(4M異硫氰酸胍，2.5mMNaOAc，PH8.5，0.8％□-巰基乙醇)混合。用四層干酪包布(cheesecloth)過(guò)濾混合物后于4℃，10,000×g離心30min。取上清液進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，26,000×g離心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC處理過(guò)的水重懸浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl3MNaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10μgRNA在1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用通過(guò)隨機(jī)引物獲得的并用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過(guò)夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。隨后將膜置于X射線膠片下，-70℃過(guò)夜。用Promega公司的PolyA+tractmRNA分離系統(tǒng)從總RNA中分離出PolyA+mRNA。使用Stratagene(LaJolla，Calif)的ZAPExpresscDNA合成系統(tǒng)，以PolyA+mRNA為模板合成cDNA。番茄葉cDNA文庫(kù)篩選取MatchF1雜交番茄株葉子，用2M山梨醇處理6h，從中分離得到的cDNA文庫(kù)稀釋至約5×106PFU/ml。使用32P標(biāo)記的600bpRT-PCR片段對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。切下所得的三個(gè)陽(yáng)性cDNA，并按照說(shuō)明書將其整合到pBK-CMV噬菌體載體上(Stratagene)。全長(zhǎng)cDNA被插入到pBK-CMV載體中。質(zhì)粒DNA分離和DNA測(cè)序用Sanbrook等人(Supra)描述的堿裂解法分離質(zhì)粒DNA。使用雙脫氧法對(duì)全長(zhǎng)陽(yáng)性cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序(Sanger，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467.)。使用BLASTsearch對(duì)開放閱讀框進(jìn)行編輯和分析(GenBank，BethesdaMD)，并使用BCMsearchlauncher多序列對(duì)比模式-誘導(dǎo)的多對(duì)比法(MultipleSequenceAlignmentsPattern-InducedMultipleAligmentMethod)(見F.Corpet，Nuc.AcidsRes.，1610881-10890(1987))獲得編碼基因相應(yīng)的氨基酸序列與五個(gè)同源性最高的蛋白序列間的對(duì)比。用MultipleFinder來(lái)鑒別所得氨基酸序列的功能基序。番茄RNA的印跡雜交分析從不同階段的番茄花(花蕾、開花和完全開放或變干的衰老花瓣)、番茄葉子和不同成熟階段的番茄果實(shí)(果實(shí)花端著色(breaker)，也就是綠果實(shí)只有不到10％為紅色；粉紅色，就是整個(gè)果實(shí)為橙色或粉紅色；紅色(硬或軟))中分離得到總RNA，取10μg上述RNA在1％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離并固定于尼龍膜上。使用隨機(jī)引物試劑盒(BoehringerMannheim)標(biāo)記32P-dCTP得到的全長(zhǎng)番茄cDNA被用作探針檢測(cè)濾膜(7×107cpm)。室溫下，用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次。濾膜干燥后，置于X射線膠片下，-70℃過(guò)夜。所得結(jié)果見圖50-52。擬南芥RNA的RNA印跡雜交分析同上文方法分別從5周齡(泳道1)、6周齡(泳道2)、7周齡(泳道3)的擬南芥葉中分離總RNA，在1％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離并固定于尼龍膜上。使用隨機(jī)引物試劑盒(BoehringerMannheim)標(biāo)記32P-dCTP得到的全長(zhǎng)擬南芥衰老-誘導(dǎo)DHScDNA被用作探針檢測(cè)濾膜(7×107cpm)。室溫下，用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次。濾膜干燥后，置于X射線膠片下，-70℃過(guò)夜。所得結(jié)果見圖55?？的塑癛NA的RNA印跡雜交分析同上文方法從康乃馨植株花的不同發(fā)育階段的花瓣，即緊實(shí)花蕾(tightbud)(泳道1)、開始開放(beginningtoopen)(泳道2)、完全開放(fullyopen)(泳道3)、內(nèi)卷花瓣(inrollingpetals)(泳道4)中分離總RNA。使用隨機(jī)引物試劑盒(BoehringerMannheim)標(biāo)記32P-dCTP得到的全長(zhǎng)康乃馨衰老-誘導(dǎo)DHScDNA被用作探針檢測(cè)濾膜(7×107cpm)。室溫下，用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜一次，65℃下用0.2×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次。濾膜干燥后，置于X射線膠片下，-70℃過(guò)夜。所得結(jié)果見圖56。實(shí)施例2山梨醇誘導(dǎo)番茄衰老-誘導(dǎo)DHS基因在密閉容器里用2M山梨醇處理番茄葉6h。按以下方法從山梨醇處理后的番茄葉中提取RNA。取5g葉在液氮中磨碎。研磨粉末與30ml胍緩沖液(4M異硫氰酸胍、2.5mMNaOAc、0.8％□-巰基乙醇、PH8.5)混合。用四層干酪包布(cheesecloth)過(guò)濾混合物后于4℃，10,000×g離心30min。取上清液進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，26,000×g離心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC處理過(guò)的水重懸浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl3MNaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10gRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用通過(guò)隨機(jī)引物獲得的并用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過(guò)夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃過(guò)夜。結(jié)果見圖52，可見山梨醇處理的葉細(xì)胞中DHS基因被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例3番茄衰老花中的DHS基因的誘導(dǎo)收獲緊實(shí)花蕾和開放、衰老番茄花，并如實(shí)施例2提取RNA。取10μgRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。用通過(guò)隨機(jī)引物獲得的并用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過(guò)夜。用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃下過(guò)夜。結(jié)果見圖50，可見在衰老花中DHS基因被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例4番茄成熟過(guò)程中果實(shí)的DHS基因的誘導(dǎo)如實(shí)施例2方法，從番茄的果實(shí)花端著色、粉紅和成熟階段果實(shí)中提取RNA。取10μgRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。用通過(guò)隨機(jī)引物獲得的并用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過(guò)夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃下過(guò)夜。結(jié)果見圖51?？梢娂t色成熟果實(shí)的DHS基因的轉(zhuǎn)錄作用是最強(qiáng)的，果實(shí)處于導(dǎo)致變質(zhì)的衰老起始階段前。實(shí)施例5低溫誘導(dǎo)番茄的衰老-誘導(dǎo)DHS種植于罐中的番茄植株(7-8周齡)在生長(zhǎng)室中于6℃下暴露2天、3天或6天。光周期設(shè)置為8h黑暗和16h光照。將植株搬回溫室以復(fù)溫。未復(fù)溫的植株則在搬離生長(zhǎng)室后立即采摘。按下文方法從葉中提取RNA。取5g葉在液氮中磨碎。研磨粉末與30ml胍緩沖液(4M異硫氰酸胍、2.5mMNaOAc、0.8％□-巰基乙醇、PH8.5)混合。用四層干酪包布(cheesecloth)過(guò)濾混合物后于4℃，10,000×g離心30min。取上清液進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，26,000×g離心20h。用75％乙醇清洗RNA沉淀后用600μlDEPC處理過(guò)的水重懸浮，然后加入0.75ml95％乙醇和30μl3MNaOAc，于-70℃沉淀RNA。取10gRNA在1.2％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用通過(guò)隨機(jī)引物獲得的并用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)DHScDNA(SEQIDNO1)為探針與尼龍膜在42℃下溫育過(guò)夜。然后用含0.1％SDS的1×SSC溶液室溫下洗滌膜一次，15min，再用含0.1％SDS的0.2×SSC溶液65℃下洗膜三次，每次15min。膜置于X射線膠片下，-70℃過(guò)夜。結(jié)果見圖53?？梢姷蜏睾蛷?fù)溫過(guò)程可誘導(dǎo)葉中DHS基因的轉(zhuǎn)錄，并且增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄作用與低溫造成的損傷相關(guān)，損傷程度以細(xì)胞膜泄漏程度衡量。實(shí)施例6使用基于未鑒定的擬南芥基因組序列的引物獲得擬南芥PCR產(chǎn)物使用一對(duì)根據(jù)擬南芥基因組序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，以擬南芥cDNA為模板得到部分長(zhǎng)度的衰老-誘導(dǎo)DHS基因序列。5’引物長(zhǎng)19mer，序列為5’GGTGGTGTTGAGGAAGATC3’(SEQIDNO7)；3’引物長(zhǎng)20mer，序列為5’GGTGCACGCCCTGATGAAGC3’(SEQIDNO8)。用ExpandHighFidelityPCRSystem(BoehringerMannheim)，以擬南芥衰老葉cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件如下。反應(yīng)液組成cDNA1μl(5×107pfu)dNTP(各10mM)1μlMgCl2(5mM)+10x緩沖液5μl引物1和2(各100μM)2μlExpandHighFidelityDNA聚合酶1.75U反應(yīng)體積50μl反應(yīng)參數(shù)94℃3min94℃/1min，58℃/1min，72℃/2min，45個(gè)循環(huán)72℃15min實(shí)施例7基因組DNA的分離和DNA雜交印跡分析從番茄葉中提取基因組DNA。取10g葉組織，在液氮中磨成細(xì)粉。將25ml勻漿緩沖液(100mMTris-HCl、100mMEDTA、250mMNaCl、1％肌氨酰、1％2-巰基乙醇、10μg/mlRNase、PH8.0)和12.5ml苯酚混合，將這37.5ml混合物預(yù)熱至60℃后加到磨碎的組織中。振搖15min，加入12.5ml氯仿-異戊醇(24∶1)，再振搖15min。然后離心，所得水相用25ml苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)和氯仿-異戊醇(24∶1)再提取。室溫下加入15ml異丙醇得到核酸沉淀。用1ml水重懸浮沉淀。按下文用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA取10μg基因組DNA，40μl10×反應(yīng)緩沖液和100U限制性內(nèi)切酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HinDIII)，總反應(yīng)體積400μl，反應(yīng)5到6小時(shí)?；旌衔镌儆帽椒映樘岵⒂靡页恋?。消化后的DNA用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，15V約15h。再將凝膠浸沒(méi)于變性緩沖液(87.66gNaCl和20gNaOH/L)中，輕輕攪動(dòng)30min。再用蒸餾水清洗，再浸沒(méi)于中和緩沖液(87.66gNaCl和60.55gTris-HClpH7.5/L)中30min并輕輕攪動(dòng)。DNA用毛細(xì)管印跡法轉(zhuǎn)移到Hybond-N+帶正電荷尼龍膜上。用1×106cpm/ml32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)DHScDNA或DHScDNA3’-非編碼區(qū)序列進(jìn)行雜交，42℃反應(yīng)過(guò)夜。在含有50％甲酰胺、6×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.1％SDS和100mg/ml變性鮭魚精子DNA的緩沖液中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。膜預(yù)雜交2到4小時(shí)，雜交反應(yīng)過(guò)夜。雜交完成后，室溫下用2×SSC和0.1％SDS漂洗，再用2×SSC和0.1％SDS沖洗15min，0.2×SSC和0.1％SDS沖洗15min。膜置于X射線膠片下-80℃過(guò)夜。結(jié)果見圖49。實(shí)施例8擬南芥衰老-誘導(dǎo)基因的分離以擬南芥衰老中葉子的cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR得到一個(gè)在擬南芥葉中表達(dá)的衰老-誘導(dǎo)基因全長(zhǎng)cDNA克隆。最初，相應(yīng)于該基因5’和3’的PCR產(chǎn)物通過(guò)使用以下引物獲得簡(jiǎn)并上游引物<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQIDNO17)與T7載體引物<AATACGACTCACTATAG>(SEQIDNO18)配對(duì)，簡(jiǎn)并下游引物<TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQIDNO19)與T3載體引物<ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQIDNO20)配對(duì)。PCR產(chǎn)物亞克隆至pBluescript上測(cè)序。然后用5’特異引物<CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQIDNO21)和配對(duì)的3’特異引物<AGAAGAAAGTATAAAAACCAT>(SEQIDNO22)得到全長(zhǎng)cDNA，并亞克隆至pBluescript上測(cè)序。實(shí)施例9番茄果實(shí)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因的分離以番茄果實(shí)cDNA文庫(kù)為模板PCR得到在番茄果實(shí)中表達(dá)的衰老-誘導(dǎo)基因全長(zhǎng)cDNA克隆。最初，相應(yīng)于該基因5’和3’端的PCR產(chǎn)物通過(guò)使用以下引物獲得簡(jiǎn)并上游引物(SEQIDNO17)與T7載體引物SEQIDNO18)配對(duì)，簡(jiǎn)并下游引物(SEQIDNO19)與T3載體引物(SEQIDNO20)配對(duì)。PCR產(chǎn)物亞克隆至pBluescript上測(cè)序。然后使用5’特異引物<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQIDNO23)和T7載體引物(SEQIDNO18)得到全長(zhǎng)cDNA，并亞克隆至pBluescript上測(cè)序。實(shí)施例10康乃馨衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因的分離以康乃馨處于衰老中的花的cDNA為模板得到在處于衰老中的康乃馨花中表達(dá)的衰老-誘導(dǎo)基因全長(zhǎng)cDNA克隆。最初，相應(yīng)于該基因5’和3’的PCR產(chǎn)物通過(guò)使用以下引物獲得簡(jiǎn)并上游引物(SEQIDNO17)與T7載體引物(SEQIDNO18)配對(duì)，簡(jiǎn)并下游引物(SEQIDNO19)與T3載體引物(SEQIDNO20)配對(duì)。PCR產(chǎn)物亞克隆至pBluescript上測(cè)序。然后用5’特異引物<TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQIDNO24)和配對(duì)的3’特異引物<ACCAAAAACCTGTGTTATAACT>(SEQIDNO25)得到全長(zhǎng)cDNA，并亞克隆至pBluescript上測(cè)序。實(shí)施例11擬南芥衰老-誘導(dǎo)基因的分離在擬南芥衰老中葉子的cDNA文庫(kù)中篩選得到在擬南芥葉子里表達(dá)的衰老-誘導(dǎo)基因全長(zhǎng)cDNA克隆。用以篩選的探針序列(SEQIDNO26)見圖82。該探針是通過(guò)以衰老葉cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò)Genbank中未鑒定序列(AB017060)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR獲得的。PCR產(chǎn)物亞克隆至pBluescript上測(cè)序。實(shí)施例12康乃馨衰老-誘導(dǎo)DHS基因的分離在康乃馨衰老中花瓣cDNA文庫(kù)中篩選得到在康乃馨花瓣里表達(dá)的衰老-誘導(dǎo)DHS基因全長(zhǎng)cDNA。用以篩選的探針序列(SEQIDNO27)見圖83。該探針是以衰老花瓣cDNA文庫(kù)為模板和簡(jiǎn)并引物(上游5’TTGARGAAGATYMAARTGCCT3’)(SEQIDNO28)；下游(5’CCATCAAAYTCYTGKGCRTT3’)(SEQIDNO29)進(jìn)行PCR獲得的。PCR產(chǎn)物亞克隆至pBluescript上測(cè)序。實(shí)施例13以擬南芥DHS基因全長(zhǎng)或3’區(qū)域的反義多核苷酸轉(zhuǎn)化擬南芥用二元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化土壤桿菌，載體含有擬南芥衰老-誘導(dǎo)DHS基因(SEQIDNO30，圖80)全長(zhǎng)或3’區(qū)域的多核苷酸且均表達(dá)為反義構(gòu)型，并處于雙35S啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下。轉(zhuǎn)化后的土壤桿菌以真空滲入法轉(zhuǎn)化擬南芥植株，用氨芐青霉素選擇所得T0株的轉(zhuǎn)化種子。圖65-68為轉(zhuǎn)化的擬南芥株照片，顯示DHS基因或其3’末端的反義方向表達(dá)導(dǎo)致了生物量提高，如葉子變大和植株變大。圖69說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥株的種子產(chǎn)量提高。實(shí)施例14以番茄DHS基因全長(zhǎng)或3’區(qū)域的反義多核苷酸轉(zhuǎn)化番茄用二元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化土壤桿菌，載體含有番茄衰老-誘導(dǎo)DHS基因(SEQIDNO31，圖81)全長(zhǎng)或3’區(qū)域的多核苷酸且均表達(dá)為反義構(gòu)型，并處于雙35S啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下。用這些轉(zhuǎn)化的土壤桿菌構(gòu)建番茄葉移植體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的愈傷組織和幼苗并以標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法進(jìn)行選擇。在溫室中種植轉(zhuǎn)化幼苗以獲得成熟的產(chǎn)果實(shí)T1株。圖70-79的照片顯示轉(zhuǎn)化株中番茄衰老-誘導(dǎo)DHS基因表達(dá)的減少引起了生物量提高，如葉子變大和植株變大，如同轉(zhuǎn)化擬南芥株所表現(xiàn)的一樣，同時(shí)也觀察到番茄果實(shí)軟化和壞死的推遲。實(shí)施例15用番茄DHS基因3’區(qū)域的反義多核苷酸轉(zhuǎn)化番茄植株以二元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化土壤桿菌，載體包含DHS基因(圖81)的3’末端多核苷酸且表達(dá)為反義構(gòu)型，并處于雙35S啟動(dòng)子控制之下。用這些轉(zhuǎn)化的土壤桿菌構(gòu)建番茄葉移植體，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的愈傷組織和幼苗并以標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法進(jìn)行選擇。在溫室中種植轉(zhuǎn)化幼苗以獲得成熟的產(chǎn)果實(shí)T1株。這些DHS表達(dá)減少的轉(zhuǎn)基因株的果實(shí)完全沒(méi)有花蒂腐現(xiàn)象(blossomendrot)，而相同條件下的對(duì)照株果實(shí)中有約33％發(fā)病?；ǖ俑且环N生理疾病，是由于營(yíng)養(yǎng)壓力引起果實(shí)底端(花的末端)的衰老和腐爛。圖84A和B的照片顯示了對(duì)照株果實(shí)的花蒂腐和轉(zhuǎn)基因株果實(shí)的正常。實(shí)施例16擬南芥翻譯起始因子5A(AteIF-5A)同工型在野生型哥倫比亞生態(tài)型-植物材料中的表達(dá)將擬南芥哥倫比亞生態(tài)型株的種子種植于盛有PromixBX土壤(PremierBrands，Brampton，ON，Canada)的6英寸罐中。新播種的罐于4℃保持2天，然后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室中22℃下16h光照/8h黑暗的光周期。使用冷-白熒光燈泡提供光強(qiáng)為150μmolm-2·s-1的光照。從2周齡到7周齡，間隔一周采集一次整個(gè)蓮座，5周齡時(shí)采集莖生葉，6周齡時(shí)采集莖、長(zhǎng)角果、花蕾和花，并采集吸漲種子(水中24h)，于液氮中速凍，保存于-80℃。丁香假單孢菌(pseudomonassyringae)感染擬南芥株將擬南芥哥倫比亞生態(tài)型株的種子播種到含64個(gè)生長(zhǎng)單元(cell)的平臺(tái)上，用PromixBX土壤(PremierBrands，Brampton，ON，Canada)培養(yǎng)。播種后的平臺(tái)置于4℃保持2天后轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)室中，9h光照/15h黑暗的光周期。所有處理均在植株4周齡時(shí)進(jìn)行，盡管生理上由于光照時(shí)間縮短導(dǎo)致這些植株生長(zhǎng)緩慢。用無(wú)致病力(avr)和有致病力(vir)的丁香假單孢菌番茄致病變種(Pseudomonassyringepv.Tomato)DC3000(得自RobinCamer博士，UniversityOfToronto，Toronto，Canana)感染4周齡植株的蓮座葉。用1ml無(wú)針頭的注射器給每株的蓮座葉的背軸面接種。參試株分成四組無(wú)接種、模擬接種(用10mMMgCl2)、無(wú)致病力丁香假單孢菌接種(106cfu/ml，10mMMgCl2)，有致病力丁香假單孢菌接種(106cfu/ml，10mMMgCl2)。進(jìn)行兩次細(xì)菌計(jì)數(shù)，一次于接種后立即進(jìn)行，第二次于接種后3天進(jìn)行，為確保在用無(wú)致病力菌株處理時(shí)有足夠數(shù)量的細(xì)菌被導(dǎo)入以誘導(dǎo)組織獲得抗性。在預(yù)先確定的時(shí)間點(diǎn)采集接種葉進(jìn)行后續(xù)分析。通過(guò)將DHS基因或損傷-誘導(dǎo)eIF-5A基因以反義方向插入T-DNA，發(fā)展了DHS或損傷-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)減少的植株。這些品系表現(xiàn)出對(duì)丁香假單孢菌番茄致病變種(Pseudomonassyringepv.Tomato)DC300的顯著抗性，轉(zhuǎn)基因株相對(duì)于野生型株的細(xì)菌載量呈現(xiàn)高至99％的下降。見圖43和44。使用農(nóng)作物得到的數(shù)據(jù)也顯示其對(duì)病原的抗性提高。用止血鉗損傷擬南芥根據(jù)Stotz等人(2000)所述，用止血鉗將正常光照條件下生長(zhǎng)的4周齡葉沿主葉脈夾傷(約損傷至葉面積的10％)。在0min、1h和9h時(shí)分別采集葉組織，并立即速凍于液氮中，-80℃保存以進(jìn)一步分析。RNA的分離和RNA印跡雜交分析根據(jù)Davis等人所述(1986)從擬南芥的蓮座葉中分離總RNA以進(jìn)行雜交印跡分析。RNA在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Daviset.al.，1986)。用放射性標(biāo)記的衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A、損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A、生長(zhǎng)AteIF-5A基因的3’UTR部分與固定的RNA在42℃下雜交過(guò)夜。這些3’UTR序列通過(guò)隨機(jī)引物試劑盒(BoehringerMannheim)標(biāo)記上[α-32P]-dCTP。雜交后的膜用含0.1％SDS的2×SSC42℃洗滌2次每次15min，再用含0.1％SDS的1×SSC42℃洗滌2次每次30min。-80℃下放射自顯影過(guò)夜可見雜交?？贵w的生產(chǎn)和純化擬南芥(AT)的真核翻譯起始因子5A(eIF-5A)同工型在氨基酸水平上具有高度同源性，尤其是在蛋白的N末端區(qū)域和中央?yún)^(qū)域(圖1)。為了獲得特異的同工型的抗體，根據(jù)AteIF-5A同工型相互間表現(xiàn)出獨(dú)特性的區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)多肽。將一個(gè)額外的半胱氨酸殘基添加到每條肽的N末端以與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)結(jié)合。所用序列為衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A的CNDDTLLQQIKS；損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A的CTDDGLTAQMRL；生長(zhǎng)AteIF-5A的CTDEALLTQLKN。當(dāng)這些序列被遞交到蛋白BLAST(近乎精確的短序列，由擬南芥限定；expectednumber2000；wordsize2；MatrixPAM90；Gapcost91)分析時(shí)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的有意義序列只有匹配的AteIF-5A而無(wú)其他。肽合成于西安大略大學(xué)多肽合成實(shí)驗(yàn)室(UniversityofWesternOntarioPeptideSynthesisfacility)。根據(jù)Drenckhahnetal.(1993)和Collawn和Patterson(1999)所述，通過(guò)使用間-馬來(lái)酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯將載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin(Sigma))與肽的N末端半胱氨酸殘基結(jié)合。將連接后的肽注射入兔體內(nèi)，每隔兩周注射一次共四次。最后一次注射后兩周放血法收集兔血，收集的血凝固以收集抗血清。蛋白分級(jí)分離和蛋白雜交印跡分析將上文所列組織在緩沖液(50mMEPPS、pH7.4、0.25M山梨醇、10mMEDTA、2mMEGTA、1mMDTT、10mM氨基-正-己酸、植物組織蛋白酶抑制劑混合物(ProteaseInhibitorCocktailforPlanttissues(Sigma)))中，用微量離心管和小杵或大研缽與杵使組織勻質(zhì)(～0.5g/ml)。在微量離心機(jī)以最高轉(zhuǎn)速短暫離心勻漿并丟棄沉淀。按Ghosh等(1988)所述測(cè)總蛋白量，用MiniproteinDualSlabcell(BioRad，Mississauga，Ontario)進(jìn)行SDS-PAGE，凝膠(12％聚丙烯酰胺)用考馬斯亮藍(lán)R250(Faribanks等，1971)染色，或用半干轉(zhuǎn)移法(半干轉(zhuǎn)移槽，Bio-Rad，Hercules，CA)將蛋白轉(zhuǎn)印至聚二氟乙烯(PVDF)膜上。用1mg/ml聚乙烯乙醇封閉印跡30s(Miranda等，1993)，再于含0.1％(v/v)吐溫20和5％(w/v)奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)中封閉1h。一抗(從第二次注射后的血中得到)用含0.1％(v/v)吐溫20和1％(w/v)奶粉的PBS按1∶50稀釋。用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體作為二抗，和堿性磷酸酶底物NBT和BCIP(BioRad，Mississauga，ON)，來(lái)顯示抗原。實(shí)施例17制備過(guò)表達(dá)三種eIF-5A同工型的轉(zhuǎn)化擬南芥植株引物設(shè)計(jì)擬南芥(AT)的真核翻譯起始因子5A(eIF-5A)同工型在編碼區(qū)高度同源(圖2)。為避免出現(xiàn)擴(kuò)增正確基因的問(wèn)題，用以擴(kuò)增衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A、損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A、生長(zhǎng)AteIF-5A的引物設(shè)計(jì)基于5’UTR的接近開始區(qū)和3’UTR的末端區(qū)，分別見圖3、4和5。基于EST資料和來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列信息評(píng)估5’UTR和3’UTR序列。在引物末端添加合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以方便后續(xù)在二元載體pKYLX71(圖6)中按正義方向進(jìn)行連接反應(yīng)。擴(kuò)增衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A基因所用的上游引物是5’AAGCTTGATCGTGGTCAACTTCCTCTGTTACC3’，下游引物是5’GAGCTCAGAAGAAGTATAAAAACCATC3’。損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A所用上游引物是5’CTCGAGTCGTCACTTCTCTCTCTTAGG3’，下游引物是5’GAGCTCAAGAATAACATCTCATAAGAAAC3’。生長(zhǎng)AteIF-5A所用上游引物是5’CTCGAGCTAAACTCCATTCGCTGACTTCGC3’，下游引物是5’GAGCTCTAGTAAATATAAAGAGTGTCTTGC3’。衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A引物所加的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為HindIII和SacI位點(diǎn)，損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A引物添加XhoI和SacI位點(diǎn)，生長(zhǎng)AteIF-5A引物添加XhoI和SacI位點(diǎn)，如上文引物序列的下劃線部分所示。擬南芥基因組DNA的分離從3周齡蓮座葉中分離基因組DNA。將葉組織在提取緩沖液(200mMTris、pH7.5、250mMNaCl、25mMEDTA、0.5％SDS)中勻漿化，所得勻漿渦旋混合15s。用微量離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速離心1min以除去殘留碎片。收集上清液并與異丙醇按1∶1混合，渦旋混合后室溫放置2min。微量離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速離心5min收集沉淀，70％乙醇洗滌沉淀，真空干燥2min。干燥物用水重懸，按體積1∶1加入氯仿處理并渦旋混合。微量離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速離心2min，收集上層液體并用20μl鹽溶液(2M醋酸鈉)和2倍體積的乙醇處理，-20℃下沉淀30min。然后用微量離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速離心30min得到純化的基因組DNA沉淀，干燥后重懸于水中以進(jìn)行PCR?；蚪MDNA的PCR用上文所述引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)混合物含1xTsg或Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液、1UTsg或Taq聚合酶、0.2mMdNTP、2mMMgCl2、相應(yīng)的各自特異引物各15nmol。反應(yīng)開始于熱啟動(dòng)95℃10min，第一個(gè)循環(huán)包括95℃變性1min，55℃退火2min，72℃延伸2min。隨后29循環(huán)進(jìn)行遞降程序即每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃，最后一個(gè)循環(huán)退火溫度為40℃。最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)說(shuō)明書，使用MilliporeUltrafree-DA切膠并回收DNA用以從瓊脂糖spin柱提取DNA(MilliporeCorporation，Bedford，MA)。連接到pGEM-TEasy根據(jù)Promega公司說(shuō)明書將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-TEasyVector載體上(見圖7)。簡(jiǎn)要的說(shuō)，將PCR產(chǎn)物與pGEMT-EasyVector載體按3∶1混合，與3WeissUT4DNA連接酶在由PromegapGEM-TEasyVectorSystem(PromegaCorporatio，MadisonWI)提供的快速連接緩沖液(30mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mMDTT、1mMATP、5％聚乙烯乙二醇(MW8000，ACSGrade)pH7.8)中15℃連接反應(yīng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細(xì)胞懸液(用RbCl/CaCl法制備感受態(tài)細(xì)胞，Kushner，1978)。先將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液置于冰上30min，隨后42℃熱激90s，再加入1ml2×YT肉湯培養(yǎng)基于37℃復(fù)蘇1h。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞聚集，用小體積的2×YT肉湯培養(yǎng)基重懸，并涂布于含有50μg/ml氨芐青霉素的瓊脂糖平板上培養(yǎng)以進(jìn)行選擇。pGEMT-Easy載體提供了細(xì)胞對(duì)氨芐青霉素的耐藥性，只有發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能在氨芐平板上生長(zhǎng)。篩選并挑選出PCR產(chǎn)物連接到pGEMT-Easy載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)篩選插入到pGEMT-Easy載體的PCR產(chǎn)物挑取選擇平板上的克隆接種至含50μg/ml氨芐青霉素的2×YT肉湯培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。使用WizardPrepDNA純化試劑盒(Promega)從選出的克隆里純化重組質(zhì)粒。EcoRI37℃消化質(zhì)粒DNA1h，1％瓊脂糖凝膠電泳后觀察，以確定存在AteIF-5As基因大小的插入片段。陽(yáng)性質(zhì)粒隨后由CoreMolecularBiologyFacility(UniversityofWaterloo，Waterloo，ON)測(cè)序，以確定序列適合在植物中(inplanta)過(guò)表達(dá)。連接到pKYLX71pGEM損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和pGEM生長(zhǎng)AteIF-5A構(gòu)建體均用XhoI和SacI進(jìn)行雙酶切，連接到也用XhoI和SacI酶切的二元載體pKYLX71。這種酶切消化可以確保損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和生長(zhǎng)AteIF-5A能以正義方向插入二元載體pKYLX71，并處于花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動(dòng)子控制之下。使用1μg二元載體和3μg損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A或生長(zhǎng)AteIF-5A進(jìn)行連接反應(yīng)。連接在連接緩沖液(30mMTris-HCl、10mMMgCl2，10mMDTT、1mMATP、5％聚乙烯乙二醇(MW8000，ACSGrade)pH7.8)及3weissUT4DNA連接酶中進(jìn)行。15℃連接反應(yīng)過(guò)夜，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細(xì)胞懸液(用RbCl/CaCl法制備感受態(tài)，Kushner，1978)。先將轉(zhuǎn)化混合液置于冰上30min，隨后42℃熱激90s，再加入1ml2×YT肉湯培養(yǎng)基于37℃復(fù)蘇1h。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞聚集，用小體積的2×YT肉湯培養(yǎng)基重懸，并涂布于含有50μg/ml四環(huán)素的瓊脂糖平板上培養(yǎng)以進(jìn)行選擇。pGEMT-Easy載體提供了細(xì)菌細(xì)胞對(duì)四環(huán)素的耐藥性，只有發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能在四環(huán)素平板上生長(zhǎng)。通過(guò)PCR和XhoI和SacI雙酶切篩選并檢出插入損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A或生長(zhǎng)AteIF-5A基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨后的PCR擴(kuò)增(同上文所述基因組DNA擴(kuò)增)和消化反應(yīng)所得產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠電泳分離，以確定有正確大小的插入片段。土壤桿菌的電穿孔和選擇pKYLX71損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和pKYLX71生長(zhǎng)AteIF-5A構(gòu)建體被電穿孔導(dǎo)入根癌土壤桿菌GV3010感受態(tài)細(xì)胞。制備感受態(tài)細(xì)胞，先將一個(gè)單克隆接種到含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素的5ml2×YT肉湯培養(yǎng)基中，用FormaScientificOrbitalShaker(FisherScientific)280rpm轉(zhuǎn)速28℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，然后按不同稀釋度(1∶500、1∶1000、1∶2000)接種到含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素30ml2×YT肉湯培養(yǎng)基中。當(dāng)菌液OD600達(dá)到0.5-0.8時(shí)，冷卻菌液并離心，在SS-34轉(zhuǎn)子(Sorvall)中2000g轉(zhuǎn)速進(jìn)行15min。沉淀用50ml冰冷水懸浮，再用2000g轉(zhuǎn)速離心15min。如此洗滌程序重復(fù)4次以除去鹽分和死細(xì)胞。最后得到沉淀用40ml冰冷的10％(v/v)甘油重懸，并于2000g轉(zhuǎn)速離心15min，重復(fù)一次。用100μl冰冷10％(v/v)甘油重懸并混合均勻。將細(xì)胞分裝為每份100μl貯存于冰上。為將DNA電穿孔導(dǎo)入土壤桿菌感受態(tài)細(xì)胞，取上述100μl細(xì)胞與500ngDNA構(gòu)建體混合均勻。隨后將細(xì)菌載體混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電穿孔杯中并置于GenePluser(Biorad)，調(diào)節(jié)至以下設(shè)置2.5kv，25μF和200Ω。電穿孔后加入1ml2×YT肉湯培養(yǎng)基，將整個(gè)懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)試管中。該電穿孔培養(yǎng)物28℃280rpm振搖培養(yǎng)3h使細(xì)胞復(fù)蘇，再加入含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素的2×YT肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)。電穿孔細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天后，涂布于含四環(huán)素、慶大霉素、利福平各50μg/ml的平板上再培養(yǎng)2天。最后得到的克隆用PCR和SacI-XhoI雙酶切及在1％瓊脂糖凝膠上分離顯示進(jìn)行篩選，得到正確導(dǎo)入了pKYLX71損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A或pKYLX71生長(zhǎng)AteIF-5A構(gòu)建體的克隆。植株的轉(zhuǎn)化含有pKYLX71損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A或pKYLX71生長(zhǎng)AteIF-5A的根瘤土壤桿菌GV3010陽(yáng)性克隆被用來(lái)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥哥倫比亞生態(tài)型植株。制備轉(zhuǎn)化植株所用的菌液時(shí)，首先挑取含pKYLX71損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A或pKYLX71生長(zhǎng)AteIF-5A構(gòu)建體的陽(yáng)性單克隆，接種至各含50μg/ml四環(huán)素、慶大霉素和利福平的5ml2×YT肉湯培養(yǎng)基中，置于FormaScientificOrbitalShaker(FisherScientific)以280rpm轉(zhuǎn)速28℃振搖培養(yǎng)2天，再接種至35ml(總量)也含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素2×YT肉湯培養(yǎng)基中。這35ml菌液以280rpm轉(zhuǎn)速28℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，并接種至535ml(總量)含50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素2×YT肉湯培養(yǎng)基中。以280rpm轉(zhuǎn)速28℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，到OD600約為2.0為止。用兩個(gè)250ml離心管，以1945g轉(zhuǎn)速4℃在GSA轉(zhuǎn)子(Sorvall)中離心上述菌液15min。用500ml滲透培養(yǎng)基(1.1gMS鹽、25g蔗糖、0.25gMES、KOH調(diào)pH5.7、100ng/ml芐基氨基嘌呤、50μlVac-In-Stuff(SilwetL-77；LehleSeeds))重懸浮沉淀，然后置于一個(gè)大塑料盤中，再放入有4個(gè)橡皮塞的真空干燥器中。取5只罐，每只長(zhǎng)有8株處于正確發(fā)育階段的植株用以連續(xù)的滲透。每只罐先在垃圾筒上倒置以除去所有松土，然后置于一個(gè)塑料容器內(nèi)(罐仍然倒置)并放進(jìn)玻璃干燥器中，這樣使得4個(gè)大橡皮塞可以支持住倒置罐子使花苔(bolt)浸入土壤桿菌漿液而不是植株的蓮座浸入。植株保持這種倒轉(zhuǎn)狀態(tài)，抽真空(400mmHg)10min。經(jīng)真空滲入的植株恢復(fù)后與平常一樣在生長(zhǎng)室條件下(見植物材料部分)生長(zhǎng)。幾周后，當(dāng)長(zhǎng)角果變干種子成熟后，采集種子。每只罐的種子放在一起。轉(zhuǎn)化植株的選擇和分離分析為鑒定初級(jí)轉(zhuǎn)化株，從真空滲入株收集的種子先用1％(v/v)次氯酸鈉和0.1％(v/v)吐溫80進(jìn)行表面消毒，在轉(zhuǎn)子(Barbsterd/Thermolyne)中進(jìn)行20min，用無(wú)菌水漂洗4次，再用0.8％無(wú)菌瓊脂重懸。然后種入無(wú)菌的半濃度MurashingandSkoog(MS)培養(yǎng)基中(2.2g/L)，并補(bǔ)充1％(w/v)蔗糖、0.5g/L2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)、0.7％(w/v)細(xì)菌用瓊脂和40-50μg/ml卡那霉素(MurashigeandShoog，1962)。只有轉(zhuǎn)化植株才能在卡那霉素平板上生長(zhǎng)，因?yàn)槎d體給轉(zhuǎn)化植株提供了卡那霉素抗性基因(圖6)。因?yàn)闊o(wú)卡那霉素抗性基因，不含二元載體的幼苗變黃并死亡。野生型幼苗作為對(duì)照種植于不含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，同時(shí)含空白pKYLX71載體的純合株種子也作為對(duì)照種植于卡那霉素平板上。空白載體對(duì)照用來(lái)證明卡那霉素對(duì)幼苗生長(zhǎng)影響和二元載體隨機(jī)整合至擬南芥基因組所產(chǎn)生的影響。在每塊含MS培養(yǎng)基和40-50μg/ml卡那霉素平板上的一個(gè)小區(qū)域里種植少量野生型種子。這么做是為了確保培養(yǎng)基有足夠的選擇性來(lái)選出轉(zhuǎn)化植株，并同時(shí)試驗(yàn)卡那霉素的濃度。播種后的平板于4℃保持3天以使發(fā)芽同步化。3天后平板轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室，在16h光照/8h黑暗的光周期下于20±2℃再生長(zhǎng)7天。光照保持在150umolm-2·s-1，使用冷白熒光燈泡。pKYLX71損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和pKYLX71生長(zhǎng)AteIF-5A載體轉(zhuǎn)化擬南芥的效率得以確定。自播種起總計(jì)10天后，分別取正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化植株各14或16株，移植到有32個(gè)生長(zhǎng)單元的PromixBX土壤(PremierBrands，Brampton，ON，Canada)平臺(tái)上。這些T1代植株隨即轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生長(zhǎng)室，該生長(zhǎng)室被控制為22℃、16h光照/8h黑暗光周期。使用冷白熒光燈泡提供光強(qiáng)150μmolm-2·s-1。T1代植株成熟并產(chǎn)生T2代種子。采集這些種子并保藏于-20℃以利進(jìn)一步篩選。T1代植株命名為1，2，3等。所有16個(gè)品系的正義生長(zhǎng)AteIF-5A株均存活并產(chǎn)種，但14株正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A轉(zhuǎn)化株中僅有9株存活并產(chǎn)種。用選擇T1代轉(zhuǎn)化植株的方法來(lái)選擇T2代轉(zhuǎn)化植株。含正義生長(zhǎng)AteIF-5A的品系12沒(méi)能在選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植株，未包括到進(jìn)一步的工作中。含正義生長(zhǎng)AteIF-5A的品系1到16(除去品系12)每種均產(chǎn)生8個(gè)亞品系。這些亞品系被命名為A到H，因此如在T1品系1中，T2代植株被命名為1A、1B、1C等。正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A植株品系1、2、3、4、5、7、9和11每種產(chǎn)生8個(gè)亞品系(A-H)。T1株的品系12僅產(chǎn)生約30粒T2種子，僅產(chǎn)生一個(gè)T2亞品系。正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A植株的T2品系仍在生長(zhǎng)和鑒定中。正義生長(zhǎng)AteIF-5A的T2植株已經(jīng)成熟并產(chǎn)種，采集種子并保藏于-20℃直至進(jìn)一步分析。正義生長(zhǎng)AteIF-5AT3代轉(zhuǎn)化植株的選擇用與T2同樣的方法來(lái)進(jìn)行。根據(jù)表型分析和正義生長(zhǎng)AteIF-5A的過(guò)量表達(dá)程度選出8個(gè)品系。表達(dá)水平分成四類高水平表達(dá)、中等水平表達(dá)、低水平表達(dá)和無(wú)表達(dá)(由共抑制引起)。每種水平選出兩個(gè)品系，每個(gè)品系移植12株。這個(gè)四種表達(dá)水平的相應(yīng)品系為1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C。正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株的T3代仍在生長(zhǎng)和鑒定中。實(shí)施例18正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和正義生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)化植株的表型分析照片記錄正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和正義生長(zhǎng)AteIF-5A品系的形態(tài)表型在分離過(guò)程中用拍照記錄，相應(yīng)野生型植株對(duì)照(擬南芥哥倫比亞生態(tài)型)和空白二元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化植株對(duì)照的表型也被同樣記錄。種子度量收集正義生長(zhǎng)AteIF-5AT2植株的T3種子，測(cè)量種子總產(chǎn)量(重量和體積)、種子大小(長(zhǎng)和寬)并計(jì)算所產(chǎn)種子的單個(gè)重量和體積。用Sartorius電子分析天平(analytcaldigitizedscale)稱量種子總重，將每棵植株的種子倒入一個(gè)最小刻度為100μl的1ml玻璃針筒內(nèi)來(lái)測(cè)量種子總體積。為了確定種子大小(長(zhǎng)、寬和計(jì)算得出單個(gè)體積)，將種子放在含有測(cè)微計(jì)的載玻片上，用OlympusBX51顯微鏡觀測(cè)。聯(lián)用SpotInsightColorCamera(DiagosticInstitutionInc.)和CompaqEvoD500(CompaqCompanyCorporation；IntelPentium4CPU1.7GHz，262MGRAM，Windows2000)進(jìn)行顯微拍照。使用Windows系統(tǒng)的Image-ProExpressVersion4.0程序。用照片中的測(cè)微計(jì)作為標(biāo)度測(cè)量每個(gè)亞品系的10粒種子。測(cè)量結(jié)果輸入MicrosoftExcel分析并計(jì)算諸如標(biāo)準(zhǔn)差和體積。實(shí)施例19正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和正義生長(zhǎng)AteIF-5A蛋白分級(jí)分離流分的生化分析和蛋白雜交印跡分析收集每個(gè)亞品系的正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株的T2植株的第一片莖生葉并按上文描述提取蛋白。品系1A、2A到16A的總蛋白用12％SDS-PAGE分級(jí)分離，并轉(zhuǎn)移到PDVF膜上。用生長(zhǎng)αAteIF-5A抗體(1∶50稀釋度)作探針檢測(cè)印跡。收集野生型和空白二元載體對(duì)照株的第一片莖生葉并提取總蛋白作為對(duì)照。實(shí)施例20擬南芥翻譯起始因子5A(AteIF-5A)同工型在野生型哥倫比亞生態(tài)型植株中的表達(dá)采集不同發(fā)育階段的若干植物組織并提取總蛋白以進(jìn)行蛋白雜交印跡分析。圖8中的蛋白雜交印跡分析結(jié)果顯示在2周齡蓮座葉中未見衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A，但從3周齡葉子開始衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A上調(diào)并大量增加直至5周齡，其后大量減少但7周齡時(shí)仍然存在。在PEG處理植株或?qū)φ罩仓曛芯礄z測(cè)到衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A，但在花泳道中(包括衰老花)和吸漲種子泳道中存在，反映有子葉的組織的衰老。當(dāng)用損傷-誘導(dǎo)αAteIF-5A抗體作探針檢測(cè)印跡時(shí)，在長(zhǎng)角果、吸漲種子和莖的泳道可觀察到淺帶。在長(zhǎng)角果和莖泳道中可觀察到損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A可能是由于采集組織導(dǎo)致的損傷所引起。因?yàn)椴杉L(zhǎng)角果和莖的操作困難，它們并沒(méi)有被速凍，使得損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A同工型一定程度增量調(diào)節(jié)。當(dāng)用生長(zhǎng)αAteIF-5A抗體作探針檢測(cè)印跡時(shí)，只有吸漲種子顯示有帶，支持了這個(gè)同工型參與細(xì)胞分裂的觀點(diǎn)。在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集未處理株、用MgCl2模擬接種株、無(wú)致病力或有致病力的丁香假單孢菌處理株的組織以分析AteIF-5A在病原體入侵時(shí)的表達(dá)。植株識(shí)別無(wú)致病力菌株并誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)，導(dǎo)致感染區(qū)域的細(xì)胞死亡或壞死，因而抵御了病原體引起的疾病。而且，局部性反應(yīng)逐步變成系統(tǒng)性反應(yīng)以保護(hù)植物不受進(jìn)一步的侵犯。這種作用被稱為系統(tǒng)獲得性抗性(SystemicAcquiredResistance，SAR)，它包括一套基因的表達(dá)，這套基因稱為病原體應(yīng)答(PathogenResponse，PR)基因。另一方面，植株不能識(shí)別有致病力的菌株，因而不產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)并會(huì)導(dǎo)致疾病。擬南芥病態(tài)癥狀包括葉子變黃和感染后幾天細(xì)胞死亡。感染后72h，采集對(duì)照株、模擬感染株、無(wú)致病力的菌種處理株和有致病力的菌株處理株組織，用三種αAteIF-5A抗體(圖9)為探針進(jìn)行蛋白雜交印跡分析。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，SAR和疾病分別在無(wú)致病力的菌種處理株和有致病力的菌種處理株中都被觀察到。當(dāng)用衰老-誘導(dǎo)αAteIF-5A抗體為探針時(shí)，在所有樣品中均可觀察到一條大致相同的帶。既然所有植株均為4周齡，所以這并不奇怪，因?yàn)樗ダ贤ば驮?周齡開始可被觀察到(圖8)。當(dāng)用損傷-誘導(dǎo)αAteIF-5A抗體為探針檢測(cè)印跡時(shí)，在未處理對(duì)照株、模擬處理株和無(wú)致病力的菌種處理株可檢測(cè)到一條淺帶，而在有致病力的菌種處理株可檢測(cè)到一條顏色很深的帶。這種損傷同工型的增量調(diào)節(jié)可歸咎于疾病導(dǎo)致的細(xì)胞死亡(也是一種細(xì)胞損傷)。用生長(zhǎng)αAteIF-5A抗體為探針檢測(cè)印跡時(shí)未顯示任何帶，因此圖中未反映。在這些處理株中衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A的表達(dá)未見變化，證明其特異于自然衰老。損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A表達(dá)的提高也證明它特異于損傷引起的死亡。為了進(jìn)一步探索這種可能性，用擬南芥的損傷葉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。損傷實(shí)驗(yàn)顯示了與病理實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果(圖10)。用RNA雜交印跡分析顯示衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A、損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A、生長(zhǎng)AteIF-5A的轉(zhuǎn)錄變化。探針特異于每種AteIF-5As并且含有各自的3’UTR序列。觀察到與病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A表達(dá)未變化，因?yàn)檫@些為4周齡株且樣品采集僅間隔9h。這再次與衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A是特異的自然衰老同工型的事實(shí)一致。然而損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A的表達(dá)9h后上升。很可能發(fā)生了一些翻譯控制，因?yàn)槲凑T導(dǎo)時(shí)轉(zhuǎn)錄物表現(xiàn)為組成型(圖10)，但是不誘導(dǎo)蛋白不表現(xiàn)出高表達(dá)(圖9)。生長(zhǎng)AteIF-5A轉(zhuǎn)錄物在所有樣品中幾乎都檢測(cè)不到，并且表現(xiàn)出損傷后的表達(dá)下降。實(shí)施例21過(guò)量表達(dá)三種eIF-5A同工型的擬南芥轉(zhuǎn)化植株的產(chǎn)生從基因組DNA用PCR分離AteIF-5A(圖11)。PCR產(chǎn)物連接到pGEM(圖12)上，并且序列經(jīng)證實(shí)適合在植物中過(guò)表達(dá)。用XhoI和SacI雙酶切將損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和生長(zhǎng)AteIF-5A基因從pGEM上切下，以正義方向連接到pKYLX71上，位于花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動(dòng)子后。用酶切和PCR確定陽(yáng)性連接反應(yīng)產(chǎn)物(圖13)。然后用pKYLX71損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A和pKYLX71生長(zhǎng)AteIF-5A電穿孔轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌GV3010，再用轉(zhuǎn)化的菌株通過(guò)真空滲入感染野生型擬南芥哥倫比亞生態(tài)型植株。采集轉(zhuǎn)化后植株的種子并用含卡那霉素的MS平板上選擇轉(zhuǎn)化植株。過(guò)量表達(dá)損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A(正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A)的擬南芥植株T1代植株種于含50μg/ml卡那霉素的MS平板上，4℃貯存3天，在生長(zhǎng)室中7天(圖14)。有14棵轉(zhuǎn)化植株移植到土中。這14棵T1代植株的一個(gè)共同表型是發(fā)育障礙。品系1、4、6、8、10、11、12、13和14的生長(zhǎng)被嚴(yán)重阻礙而且品系6、8、10、13和14不產(chǎn)種。品系2和3中度受阻而品系5、7和9的生長(zhǎng)與野生型相似(圖15和16)。T1代正義損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A植株的其它一些表型包括黃色葉子、紫色子葉、卷曲葉和花形差異。值得注意的是，直到植株被移植到土壤中才觀察到生長(zhǎng)受阻的現(xiàn)象。這一點(diǎn)可能的一個(gè)解釋是，在移植時(shí)根發(fā)生了輕微損傷(移植不可避免的一個(gè)后果)而且不能恢復(fù)。事實(shí)上在預(yù)備實(shí)驗(yàn)里，用卡那霉素溶液浸泡種子并直接播種到土壤中，未見生長(zhǎng)受阻的現(xiàn)象(而上文70％的植株在一定程度上生長(zhǎng)受阻)，是因?yàn)闆](méi)有移植所以根沒(méi)有被損傷。品系1、2、3、4、5、7、8、11和12產(chǎn)生T2種子(圖17)。除了只長(zhǎng)出一株轉(zhuǎn)化植株的品系12，每個(gè)T2品系中有8個(gè)亞品系A(chǔ)-H并用于當(dāng)前分析。過(guò)量表達(dá)生長(zhǎng)AteIF-5A(正義生長(zhǎng)AteIF-5A)的擬南芥植株正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株的T1代種子長(zhǎng)于選擇培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出16棵轉(zhuǎn)化植株(圖18)。用照片記錄這些轉(zhuǎn)化植株的整個(gè)生命階段。其表型從與野生型相似(品系1、2、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15和16)到生長(zhǎng)中度受阻且植株顯黃色(品系2、4和9，圖19)間變化。所有品系都用于產(chǎn)生T2代種子，每個(gè)品系有8個(gè)用A-H標(biāo)記的亞品系。品系12未產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植株，認(rèn)為是野生型。T2代植株有比T1代植株更大的表型。產(chǎn)生T3代的品系將被詳細(xì)討論。根據(jù)轉(zhuǎn)入的生長(zhǎng)AteIF-5A基因的表達(dá)水平來(lái)分組描述正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株T2代的性質(zhì)。從每個(gè)品系的莖生葉提取蛋白并進(jìn)行蛋白質(zhì)雜交印跡(圖20)。因?yàn)樵谕黄废祪?nèi)A-H這些亞品系的大多數(shù)有相似表型，所以只對(duì)每個(gè)品系的亞品系A(chǔ)進(jìn)行蛋白質(zhì)雜交印跡分析以從總體上概括生長(zhǎng)AteIF-5A的表達(dá)水平。從野生型植株和空白二元載體轉(zhuǎn)化植株的莖生葉提取的蛋白作為凝膠電泳的對(duì)照。這些亞品系中觀察到的表達(dá)水平可分類為高(品系1、2、3、10和13)、中(品系4、5、6和15)、低(品系7、8、9和14)或無(wú)表達(dá)(品系11和16，以及野生型和空白載體對(duì)照株)。也用抗衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A和抗損傷-誘導(dǎo)AteIF-5A的抗體為探針作印跡。蛋白質(zhì)雜交印跡結(jié)果顯示正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株中表達(dá)提高的是由于生長(zhǎng)AteIF-5A，而未見另兩種AteIF-5A同工型的總體增量調(diào)節(jié)，因?yàn)槲礄z測(cè)到可觀數(shù)量的任一種AteIF-5A同工型。這也證明了同工型特異抗體的特異性是可以接受的。根據(jù)表型和生長(zhǎng)AteIF-5A表達(dá)水平(見表1對(duì)每個(gè)品系表型的概要)來(lái)選擇產(chǎn)生T3代種子的正義生長(zhǎng)AteIF-5A品系。每種表達(dá)水平組中各選出兩個(gè)品系。這些將被使用的品系為1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C。根據(jù)圖20中的蛋白雜交印跡結(jié)果，品系1高水平表達(dá)生長(zhǎng)AteIF-5A。該品系植株相比野生型植株有大而深綠色的蓮座，而且葉子相當(dāng)圓(圖21)。品系1的蓮座也有渦旋狀表型，其上的葉都向同一方向卷曲。這些正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株比野生型植株稍晚些抽苔。品系2也高水平表達(dá)生長(zhǎng)AteIF-5A，但與品系1不同的是這些植株小且黃(圖22)。品系2也比野生型和空白載體對(duì)照植株稍晚些抽苔，并產(chǎn)生較小的花苔(約一半大小)和較少的長(zhǎng)角果。在中等水平表達(dá)品系中，品系4表現(xiàn)出與野生型相似的葉子/蓮座大小和花苔大小，雖然它比野生型和空白載體對(duì)照株早幾天抽苔。第二個(gè)中等水平表達(dá)生長(zhǎng)AteIF-5A的是品系15。這些植株如同品系14，與野生型非常相似，但是蓮座所占區(qū)域大于對(duì)照組(圖23和24)，蓮座的葉的尖端也比對(duì)照組更圓。但是它的花苔未表現(xiàn)出任何與眾不同的表型。低水平表達(dá)品系中準(zhǔn)備用來(lái)產(chǎn)生T3代的為品系8和9。品系8與對(duì)照組植株相比有很大的葉子和蓮座(圖25)，葉子也比對(duì)照組植株更寬、更圓。而抽苔時(shí)間，花苔大小和數(shù)目似乎與對(duì)照組一致。正義生長(zhǎng)AteIF-5A品系9的葉子形狀與品系8相似，但遠(yuǎn)比品系8的黃而且小(圖26)。如同品系2(高水平表達(dá)品系之一)，這些品系的植株表現(xiàn)出發(fā)育障礙和更短的花苔，但不同于品系2的是品系9約與對(duì)照組同時(shí)抽苔。根據(jù)蛋白質(zhì)雜交印跡結(jié)果(圖20)，正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株的兩個(gè)品系11和16沒(méi)有增量調(diào)節(jié)表達(dá)生長(zhǎng)AteIF-5A。這可能歸咎于轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的共抑制。盡管這些植株看起來(lái)與對(duì)照組相像(圖27和28)，但由于幾個(gè)原因相信轉(zhuǎn)基因被整合到品系11和16植株的基因組中。首先，通過(guò)卡那霉素MS平板的選擇性說(shuō)明它們確實(shí)有卡那霉素抗性。其次，品系16的蓮座、花苔和葉(圖28)比對(duì)照組至少大50％。但最有力的證據(jù)是它們產(chǎn)生的T3代種子的大小和組成。測(cè)量所有正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株的T2代品系的T3種子。每個(gè)品系種子均被拍照(圖29中突出顯示了最大和最小者)，用照片上的測(cè)微計(jì)為標(biāo)度使用計(jì)算機(jī)(insilico)測(cè)量大小。對(duì)于每個(gè)品系和對(duì)照組，測(cè)量視野中最大的10粒種子并用以計(jì)算。發(fā)現(xiàn)高水平表達(dá)的品系2的種子是野生型和空白載體對(duì)照株的3倍大。而表達(dá)水平最低的品系(品系11和16)有一些最小的種子，大小僅為野生型和空白載體對(duì)照株的88％。每個(gè)品系種子的平均大小以nm3為單位(圖30)表示。由于擬南芥的種子近似橢圓體，計(jì)算時(shí)使用橢圓體體積計(jì)算公式。測(cè)得的對(duì)照組種子大小與Boyes等人(2001)確定并發(fā)表的指導(dǎo)方針是一致的。由單個(gè)種子大小的測(cè)量值和種子總產(chǎn)量(重量和體積)，計(jì)算單個(gè)種子的平均重量并繪圖(圖31)?？梢姶蠖鄶?shù)品系的種子大小都與對(duì)照組不同，但在單個(gè)種子重量上有與對(duì)照組相同的趨勢(shì)。事實(shí)上，當(dāng)用種子重量對(duì)種子大小(體積)作圖時(shí)，關(guān)系基本是線性的，R2＝0.7142。有5個(gè)品系例外要么是密度提高(其中3個(gè))，要么是密度減小(其中兩個(gè))。密度提高的品系之一為8D，將用來(lái)產(chǎn)生T3代。所有T2植株的種子總產(chǎn)量變化很大，幾乎無(wú)趨勢(shì)。然而值得注意是一個(gè)中等水平表達(dá)正義生長(zhǎng)AteIF-5A的品系4D，它的種子產(chǎn)量最大(重量和體積都是)。事實(shí)上，它的種子產(chǎn)量比對(duì)照組高2.5倍并用來(lái)產(chǎn)生T3代。T3種子按前所述種于選擇平板上。品系1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C和16C被移植到土中。正義生長(zhǎng)AteIF-5A植株的品系1的其它幾個(gè)亞品系的種子未發(fā)芽。品系2H也沒(méi)有發(fā)芽，它是未發(fā)芽亞品系種子中最大的。來(lái)自品系11(發(fā)生共抑制的品系之一)的植株沒(méi)有這個(gè)年齡典型植株那樣健康。產(chǎn)自它的種子也是所測(cè)種子中最小的種子之一。可見這些品系仍然在分離，因?yàn)樗衅废等匀挥袩o(wú)卡那霉素抗性的植株和產(chǎn)生不發(fā)芽種子的植株。這很可能是轉(zhuǎn)基因的副作用而非由技術(shù)引起，因?yàn)橄嗤绞教幚淼膶?duì)照組種子全發(fā)芽。實(shí)施例22擬南芥衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的鑒定制備全長(zhǎng)擬南芥衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的方法學(xué)基于幾種植物eIF-5A基因的簡(jiǎn)并引物與T3&T7載體引物組合用以從擬南芥cDNA文庫(kù)里PCR擴(kuò)增出eIF-5A基因。具體的說(shuō)，eIF-5A基因的5’區(qū)域通過(guò)使用T3引物(定位于載體中eIF-5A基因的上游)和一個(gè)下游(反向)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到。同樣的，3’區(qū)域通過(guò)使用T7引物(定位于文庫(kù)載體中eIF-5A基因的下游)和一個(gè)下游(正向)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到。全長(zhǎng)eIF-5A基因源自對(duì)該基因5’和3’區(qū)域的序列對(duì)比分析。每個(gè)PCR反應(yīng)有2-3個(gè)主要產(chǎn)物。這些片段被克隆到pBluescript質(zhì)粒并測(cè)序。依靠Genbank進(jìn)行作圖分析來(lái)鑒定eIF-5A基因陽(yáng)性PCR片段。對(duì)擬南芥只有一個(gè)上游和下游陽(yáng)性eIF-5A基因PCR片段。根據(jù)5’和3’PCR片段測(cè)序結(jié)果來(lái)設(shè)計(jì)特異的5’和3’末端引物。通過(guò)使用特異的5’和3’末端引物和相應(yīng)cDNA文庫(kù)為模板來(lái)擴(kuò)增得到全長(zhǎng)擬南芥eIF-5A基因。所得全長(zhǎng)基因通過(guò)測(cè)序被進(jìn)一步確認(rèn)。最后，我們克隆到一個(gè)擬南芥eIF-5A同工型基因，它被稱作衰老-誘導(dǎo)eIF-5A。T3和T7引物T35’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’T75’-AATACGACTCACTATAG-3’擴(kuò)增擬南芥eIF-5A基因的簡(jiǎn)并引物正向(上游)引物5’-AAARRYCGMCCYTGCAAGGT-3’反向(下游)引物5’-TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC-3’將全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因的反義序列亞克隆到pKYLX71載體(含SAG12啟動(dòng)子)為擬南芥衰老-誘導(dǎo)eIF-5A反義全長(zhǎng)構(gòu)建體使用的特異(同源)引物正向全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A引物(30mer)5’-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGATCC-3’(注下劃線部分為SacI識(shí)別位點(diǎn)，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript的多克隆位點(diǎn)(MCS))。反向全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A引物(36mer)5’-ACCTCGAGCGGCCGCAGAAGAAGTATAAAAAACCATC-3’(注下劃線部分為NotI識(shí)別位點(diǎn)，用以將PCR片段連接到pBluescript的多克隆位點(diǎn)(MCS))。在pBluescript的多克隆位點(diǎn)(MCS)中，SacI和NotI位點(diǎn)的排列方向必須保證基因以反義方向插入(也就是NotI位點(diǎn)在SacI的上游)。實(shí)施例23使用SAG12啟動(dòng)子反義表達(dá)全長(zhǎng)擬南芥衰老-誘導(dǎo)eIF-5A實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明一套“衰老-相關(guān)基因”(″senescence-associatedgenes″)或SAG的轉(zhuǎn)錄在衰老起始時(shí)提高(Lohman等1994；Weaver等1998)。事實(shí)上，衰老首先表現(xiàn)于新mRNA的合成而且很可能減量調(diào)節(jié)其它mRNA，這提示選擇性合成蛋白對(duì)衰老來(lái)說(shuō)是必需的(Nooden，1988)。Watanabe和Imaseki(1982)使用體外翻譯并隨后以凝膠電泳，來(lái)探測(cè)發(fā)生在可譯mRNA群體上的改變，從而首先證明衰老程序伴隨著基因表達(dá)的改變。這項(xiàng)最早的工作和后續(xù)的體外翻譯蛋白分析揭示在衰老過(guò)程中，大部分mRNA量顯著減少而其余可譯mRNA量則增加(WatanabeandImaseki，1982；DaviesandGrierson，1989；BeckerandApel，1993Buchanan-Wollaston，1994；Smaretal，1995)。對(duì)來(lái)自衰老葉組織的mRNA的cDNA文庫(kù)的差示篩選也證明在衰老過(guò)程中許多基因表達(dá)受到減量調(diào)節(jié)，而其它基因受到增量調(diào)節(jié)。已經(jīng)從多種植物中鑒別出SAG，包括擬南芥(Henseletal.1993；Taylor等1993；Lohman等1994；Oh等1996)、蘆筍(King等1995)、大麥(BeckerandApel，1993)、歐洲油菜(Brassicanapus)(Buchanan-Wollaston，1994)、玉米(Smart等1995)、蘿卜(AzumiandWatanabe，1991)和番茄(DaviesandGrierson，1989；Drake等1996)?？蓮男螒B(tài)學(xué)上鑒別衰老，如葉片特征性模式的變黃，從葉邊緣開始最終到達(dá)葉脈(Weaker等1998)。擬南芥蓮座葉的明顯衰老表現(xiàn)在發(fā)芽后的約21天，同時(shí)伴隨SAG12的劇烈增量調(diào)節(jié)(NohandAmasino，1996)。SAG12是最接近自然衰老的特異性基因，因而被稱作衰老標(biāo)志。SAG在嫩葉沒(méi)有可探測(cè)到的表達(dá)，而在～20％變黃后的較老葉子中被誘導(dǎo)，但是不被不能誘導(dǎo)葉子變黃的處理所誘導(dǎo)(Weaker等1998)。它高度特異于自然衰老過(guò)程，可用以下事實(shí)解釋SAG12的產(chǎn)物與半胱氨酸蛋白酶相似，并且可能參與衰老過(guò)程中的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)(proteinturnover)(Lohman等1994；Weaker等1998)。轉(zhuǎn)基因株的描述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，表達(dá)轉(zhuǎn)入的全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A反義序列，這個(gè)反義序列處于SAG12(特異于葉衰老)的啟動(dòng)子控制下。這個(gè)啟動(dòng)子在葉自然衰老起始時(shí)被活化，約為發(fā)芽后21d(NohandAmasino，1996)。但在環(huán)境壓力誘導(dǎo)的衰老事件中不被活化。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A被抑制的表型。在轉(zhuǎn)基因擬南芥反義全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A株的3-8周齡采集蓮座葉。制備純合SAG12啟動(dòng)子控制的反義全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A的轉(zhuǎn)基因擬南芥方法學(xué)將SAG12-反義全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A構(gòu)建體插入pKYLX71首先，用EcoRI和HindIII雙酶切pKYLX71質(zhì)粒以除去雙35S啟動(dòng)子，所得粘末端用Klenow酶處理以得到平末端。然后連接不含該啟動(dòng)子的pKYLX71以再次環(huán)化質(zhì)粒。第二步，用以下描述的含SacI和XbaI位點(diǎn)的引物從基因組DNAPCR擴(kuò)增得到擬南芥SAG12啟動(dòng)子。然后使用限制性酶SacI和XbaI酶切并用T4DNA連接酶將啟動(dòng)子序列插入到pBluescript的多克隆位點(diǎn)(MCS)。正向SAG12引物為5’-GGCCGTCGACGATATCTCTTTTTATATTCAAAC-3’(下劃線部分為SacI識(shí)別位點(diǎn)，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript的多克隆位點(diǎn)(MCS)的SacI位點(diǎn)上)。反向SAG12引物5’-CGTCTAGACATTGTTTTAGGAAAGTTAAATGA-3’(下劃線部分為XbaI識(shí)別位點(diǎn)，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript的多克隆位點(diǎn)(MCS)的XbaI位點(diǎn)上)。第三步，為構(gòu)建pBluescript-SAG12反義全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A構(gòu)建體，使用如下描述的含SacI和NotI位點(diǎn)的引物，從擬南芥cDNA文庫(kù)PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因，并如上文描述亞克隆到pBluescript-SAG12上。注意，pBluescript-SAG12載體的MCS中的SacI和NotI位點(diǎn)方向必須使基因以反義方向亞克隆入(也就是NotI位點(diǎn)在SacI的上游)。正向全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A引物5’-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGTACC-3’(注下劃線部分為SacI識(shí)別位點(diǎn)，用以將PCR片段的5’末端連接到pBluescript-SAG12的多克隆位點(diǎn)(MCS))。反向全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A引物5’-ACCTCGAGCGGCCGCCAGAAGAAGTATAAAAACCATC-3’(下劃線部分為NotI識(shí)別位點(diǎn)，用以將PCR片段連接到pBluescript-SAG12的多克隆位點(diǎn)(MCS))。最后，通過(guò)用SacI和XhoI消化pKYLX71，也用SacI和SalI從pBluescript-SAG12消化SAG12全長(zhǎng)衰老-誘導(dǎo)eIF-5A盒，在二元載體pKYLX71中構(gòu)建所需構(gòu)建體。XhoI和SalI形成的粘末端部分互補(bǔ)，因此這兩個(gè)消化得到結(jié)構(gòu)的突出端(具體的是XhoI和SalI、SacI和SacI)能夠在T4連接酶的作用下連接起來(lái)，構(gòu)成最終構(gòu)建體(pKYLX71上的SAG12反義衰老-誘導(dǎo)eIF-5A)。轉(zhuǎn)化和T1種子采集在大腸桿菌DHα細(xì)胞中擴(kuò)大培養(yǎng)pKYLX71-SAG12反義eIF-5A構(gòu)建體，隨后分離并電穿孔轉(zhuǎn)入土壤桿菌感受態(tài)細(xì)胞。然后將土壤桿菌轉(zhuǎn)化菌株滲入4.5周齡的擬南芥野生型植株，所得滲入植株記為“T0”株，它們被培養(yǎng)到生命末期。采集種子，記為T1種子。用10個(gè)卡那霉素平板(1/2MS鹽、50μg/ml卡那霉素)篩選T1種子，以野生型作為對(duì)照，只有含pKYLX71-SAG12反義eIF-5A構(gòu)建體的種子可以存活并在卡那霉素(K50)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。從這些平板中選出24株T1幼苗并種于土中。從T1轉(zhuǎn)基因植株采集的種子記為T2種子。每株幼苗產(chǎn)生一個(gè)植株品系(#1＝含一植株的一個(gè)品系，#2＝含一植株的一個(gè)品系，等等)表型篩選和鑒定一旦鑒別出卡那霉素抗性的T1種子，就連續(xù)長(zhǎng)出T2，T3和T4代植株。通過(guò)在K50培養(yǎng)基上篩選種子，使區(qū)別開繼承了遺傳構(gòu)建體的植株和具有純合的該構(gòu)建體的植株成為可能。當(dāng)在罐中培養(yǎng)時(shí)，在T3代植株中觀察到一個(gè)表現(xiàn)發(fā)育障礙表型的品系。但是，當(dāng)同樣的種子組在相同條件下再次培育時(shí)，未見到這個(gè)表型。根據(jù)種子高產(chǎn)，從24棵T1代植株中選出4個(gè)品系(品系T2.14、T2.18、T2.19和T2.23)種于K50培養(yǎng)基平板上，用野生型種子作為對(duì)照。每個(gè)品系約有75％的種子在K50培養(yǎng)基上存活并按外形分成小、中、大三類。每個(gè)品系的小、中、大幼苗從平板上轉(zhuǎn)移到土中。在溫室條件下，小幼苗恢復(fù)不如中和大幼苗快。在第6周，小幼苗剛開始有抽苔征兆，而其它植株已經(jīng)抽苔和開花。共有6棵T2代植株(來(lái)自共3個(gè)品系×8棵＝96棵轉(zhuǎn)基因植株)表現(xiàn)明顯的抽苔推遲，被認(rèn)為是“晚花苔”(latebolt)株。這些植株的種子產(chǎn)量也顯著低于其它轉(zhuǎn)基因植株。從96棵T2代植株中選出3個(gè)品系以產(chǎn)生T3代植株(品系T3.19.S8和T3.14.L7是晚抽苔株；T3.23.S3是非晚抽苔株)。當(dāng)種于K50培養(yǎng)基上時(shí)，這些植株表現(xiàn)出純合性存活。移植13株幼苗到罐中(每罐10株)。在這組植株中，可觀察到T3.14.L7品系的一個(gè)醒目的矮小表型。采集T4代種子，并且觀察到該品系有更低的種子產(chǎn)量。在品系T3.19.S8中觀察到一個(gè)密集生長(zhǎng)表型(長(zhǎng)角果密集生長(zhǎng)，有更多的枝)，而在T3.23.S3中觀察到與野生型相似的表型。比較了來(lái)自3個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的種子大小，但沒(méi)能找到顯著的統(tǒng)計(jì)差異。也進(jìn)行了葉綠素水平分析，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與野生型對(duì)照的顯著差異。品系T3.19.S8、T3.14.L7和T3.23.S3的T4代種子用K50培養(yǎng)基篩選以得到下一代植株。與死亡的野生型種子相比，篩選結(jié)果顯示這些種子繼承基因構(gòu)建體的證據(jù)(在平板上均綠色生長(zhǎng))。但是當(dāng)幼苗移植到單獨(dú)的平臺(tái)上時(shí)，沒(méi)有矮小表型出現(xiàn)，這提示轉(zhuǎn)入的反義eIF-5A已經(jīng)丟失。最后，收集所有T5代植株的種子并在K50平板上篩選，它們表現(xiàn)出對(duì)卡那霉素的抗性?，F(xiàn)正進(jìn)行研究以確認(rèn)轉(zhuǎn)入的反義序列已經(jīng)丟失和T4代植株中轉(zhuǎn)入的基因不成對(duì)。從母系T2.14、T2.19和T2.23中選出8個(gè)子品系，并在K50培養(yǎng)基平板上用野生型種子作為對(duì)照進(jìn)行篩選。根據(jù)低種子產(chǎn)量選出3個(gè)品系T3.14.S8、T3.14.L8和T3.23.S1。另5個(gè)選出品系為T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.18.S5和T3.23.S6。在K50培養(yǎng)基平板上篩選的所有品系均表現(xiàn)出純合性存活，而T3.14.L8、T3.14.S8和T3.23.S1的幼苗表現(xiàn)出雜合性存活。品系T3.14.L8和T3.14.S8的幼苗存活，表現(xiàn)白色上有綠色脈管組織，而T3.23.S6則表現(xiàn)為完全深綠色存活。這些幼苗被選出進(jìn)行移植。共有來(lái)自每個(gè)品系的28株幼苗被移植到生長(zhǎng)單元，在溫室條件下生長(zhǎng)。在第3周，除了品系T3.14.L8和T3.23.S1的所有植株和T3.14.S7、T3.14.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1和T3.23.S6中的一些植株外，所有植株開始抽苔。在T3.14.S8和T3.14.L8中觀察到不規(guī)則的蓮座葉外形(第二對(duì)葉變長(zhǎng)的表型)。第5周，在T3.18.S7和T3.23.S6中觀察到另外的不規(guī)則葉外形(蓮座葉增多和皺邊緣蓮座葉的表型)。第7周，在T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1、T3.23.S6中觀察到紡錘形莖和無(wú)延長(zhǎng)莖的表型。分別在第5和第6周采集所有植株的第一和第二莖生葉，以研究衰老-誘導(dǎo)eIF-5A蛋白的表達(dá)。實(shí)施例24產(chǎn)氧量的確定采集葉子，測(cè)重量前先測(cè)量面積。使用1ml冷脫氣研磨緩沖液、研缽和研杵將葉子仔細(xì)磨碎。隨后將勻漿轉(zhuǎn)移到一個(gè)EP管中并立即置于冰上。分離番茄葉勻漿還需要用Miracloth膜過(guò)濾。所有樣品均取50μl勻漿，加入到盛有5ml研磨緩沖液和25μlDCPIP(2，6-二氯靛酚)的10ml試管中。充分振蕩，然后一組樣品置于一對(duì)燈光照下15min，另一組置于黑暗15min。溫育15min后，向兩組樣品中均加入50μlDCMU(3-(3，4-二氯苯基)-1，1-二甲基脲)以停止反應(yīng)，隨后用微量離心機(jī)以14,000g離心2min。以研磨緩沖液為空白對(duì)照，讀取所得上清液在590nm處的吸光度。該分析所用的摩爾消光系數(shù)為16×103，也就是1mol/L的濃度變化所改變的溶液吸光度為16×103μmolDCPIP減少(/h/ml)，即＝(吸光度差值)×[1/16×103(umol/L)]×[反應(yīng)體積(ml)]×[106(ml/L)]×[60(min/h)/反應(yīng)時(shí)間(min)]×[1/樣品體積(ml)]。每減少2molDCPIP，產(chǎn)生1molO2。參考文獻(xiàn)AllenJ.F.andHolmesN.g.1986.ElectronTransportandRedoxTitrationsinPhotosynthesisEnergyTransduction.EditedbyM.F.Hipkins&N.R.Baker，IRLPress，OxfordPp107-108.實(shí)施例25淀粉含量的確定使用改進(jìn)的Lustinec等人所提出的方法來(lái)確定番茄莖中的淀粉含量。使用玻璃纖維紙來(lái)確定植物組織中的淀粉、支鏈淀粉、直鏈淀粉的含量。使用Omnimixer(每5s12reps)，和3倍體積的水使番茄莖組織勻漿化。隨后用Polytron勻漿機(jī)處理30s。勻漿分裝成10ml一份，分析前保存于-20℃。分析時(shí)，取10ml勻漿解凍并與等體積高氯酸(HClO4，70％w/w)混合，室溫溫育20min以溶解淀粉。同時(shí)準(zhǔn)備一些馬鈴薯淀粉溶液(濃度范圍為0.1-1.0mg/ml)以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。攪拌勻漿(或馬鈴薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液)，并使用一個(gè)真空燒瓶和一臺(tái)吸氣器，將勻漿于WhatmanGF/A玻璃微纖維紙(直徑9.0cm)上過(guò)濾。每1ml濾液與3ml碘溶液(8mMI2、17mMKI、514mMNaCl)混合，4℃溫育30min以形成淀粉-碘沉淀。在WhatmanGF/A玻璃微纖維紙(直徑9.0cm)上收集沉淀，使用一個(gè)真空燒瓶和一臺(tái)吸氣器。然后如下洗滌并過(guò)濾10ml碘溶液B(83mMI2、180mMKI、8％高氯酸(HClO4))一次，5ml乙醇-NaCl液(67％乙醇、342mMNaCl)一次，3ml乙醇-NaOH液(67％乙醇、250mMNaOH)兩次。一旦乙醇揮發(fā)干凈，從吸氣器移走微纖維紙并插入到有可調(diào)蓋的玻璃管中。取9ml硫酸(0.75MH2SO4加入這個(gè)玻璃管，然后將管子置于沸水浴30min。三次吸取洗提液每次1ml，加入到玻璃試管中，向每只試管加入1ml5％苯酚并迅速加入濃硫酸5ml。旋轉(zhuǎn)試管并于室溫溫育30min以充分顯色。同時(shí)準(zhǔn)備分光光度計(jì)空白樣將1ml0.75M硫酸和1ml5％苯酚混合，并迅速加入5ml濃硫酸?？瞻淄瑯佑谑覝鼗旌?0min。在480nm處用空白校準(zhǔn)光度計(jì)，測(cè)量所有樣品和馬鈴薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液并記錄結(jié)果。通過(guò)馬鈴薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線，來(lái)讀出每個(gè)樣品的淀粉含量。實(shí)施例26用擬南芥正義衰老-誘導(dǎo)eIF-5A(AteIF-5A)和番茄正義衰老-誘導(dǎo)eIF-5A基因各自轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞生態(tài)型植株。這些基因在轉(zhuǎn)基因植株整個(gè)生命周期中組成型表達(dá)。這些植株的開花莖的木質(zhì)部發(fā)育明顯提高。見圖89-94。轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的種子種于1/2MS培養(yǎng)基瓊脂平板上，置于生長(zhǎng)室在22℃，80％rh，16h光照/天條件下生長(zhǎng)9d。隨后，將幼苗移植到有32個(gè)生長(zhǎng)單元的平臺(tái)上的商品土壤中，生長(zhǎng)48d，維持如上條件。選出主要開花莖進(jìn)行顯微觀察。在蓮座上方2mm內(nèi)從主莖上橫切，將切面用間苯三酚-HCl染色。我們發(fā)現(xiàn)，莖的木質(zhì)部在這個(gè)年齡達(dá)到發(fā)育的最高峰。對(duì)比了轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的木質(zhì)部大小(切面面積)。此外，也測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照的韌皮部和木髓。組織面積如下測(cè)量。橫切面用Zeiss顯微鏡拍照，顯微照片用Photoshop數(shù)字化處理。這些照片打印在紙上，并切下不同組織。它們的面積用面積測(cè)量計(jì)加以測(cè)量。為計(jì)算每個(gè)組織的實(shí)際面積，使用以下公式實(shí)際面積＝(單個(gè)組織的紙面面積)/(放大倍率)2。結(jié)果顯示衰老-誘導(dǎo)eIF-5A也涉及聯(lián)系于木質(zhì)部發(fā)生作用的細(xì)胞程序性死亡。在擬南芥中組成性的反義抑制衰老-誘導(dǎo)AteIF-5A，減小了開花莖的密集度，也減小了木質(zhì)部細(xì)胞層的數(shù)目。與此對(duì)比，擬南芥或番茄衰老-誘導(dǎo)eIF-5A組成性過(guò)量表達(dá)的植株的莖平均比相應(yīng)野生型植株密1.7倍，而且開花莖每個(gè)橫切面的總木質(zhì)部面積是野生型植株的2倍。具有過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株也有顯著提高的蓮座葉生物量，并比野生型株生長(zhǎng)快，這可能反映了營(yíng)養(yǎng)攝取的增強(qiáng)。當(dāng)番茄衰老-誘導(dǎo)eIF-5A在擬南芥中過(guò)量表達(dá)時(shí)，也可觀察到相同的表型。這些結(jié)果共同表明衰老-誘導(dǎo)eIF-5A不僅調(diào)節(jié)葉和花的衰老，也參與木質(zhì)部發(fā)生。實(shí)施例27脫氧羥丁賴氨酸合酶的抑制推遲大氣環(huán)境下預(yù)包裝萵苣切段的褐變可買到的有包裝的沙拉通常保存在氣調(diào)(controlledatmosphere)條件下，其中氧含量水平較大氣濃度被大幅度降低，以延長(zhǎng)產(chǎn)品的儲(chǔ)藏時(shí)間。最普通的預(yù)包裝沙拉的腐敗征兆為萵苣切開面的褐變。盡管氣調(diào)包裝可推遲褐變，但這也可導(dǎo)致香氣和滋味的變淡。在這項(xiàng)研究里，脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)的減量調(diào)節(jié)表現(xiàn)了可作為推遲萵苣切面褐變可選策略的潛力。DHS催化真核起始因子5A(eIF-5A)的活化，eIF-5A作為一個(gè)核-質(zhì)穿梭蛋白對(duì)mRNA進(jìn)行選擇。DHS涉及萵苣切面的褐變，因?yàn)閷?duì)DHS表達(dá)的抑制(通過(guò)反義技術(shù))導(dǎo)致大氣條件下褐變起始的顯著推遲。具體的，80％的野生型萵苣段在被切下后6d顯示褐變，而在來(lái)自5個(gè)處于表型分離過(guò)程中的品系的轉(zhuǎn)基因植株中，平均僅有27％的萵苣段在相同時(shí)間褐變，甚至有一些植株不表現(xiàn)褐變。見圖51，53。實(shí)施例28油菜脫氧羥丁賴氨酸合酶的抑制提高種子產(chǎn)量脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)催化從無(wú)活性真核起始因子5A(eIF-5A)轉(zhuǎn)化為活性形式的兩個(gè)反應(yīng)的第一個(gè)，而活性eIF-5A促進(jìn)翻譯。從衰老葉cDNA文庫(kù)中分離一個(gè)油菜DHS編碼基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。通過(guò)在花椰菜鑲嵌病毒(CaMV-35S)啟動(dòng)子控制下反義表達(dá)油菜DHScDNA的3’UTR，在油菜轉(zhuǎn)基因植株中抑制DHS。反義表達(dá)該轉(zhuǎn)入基因的植株的葉DHS蛋白水平下降，并表現(xiàn)出葉的自然衰老的推遲。DHS表達(dá)抑制也使蓮座葉變大了1.5-2倍，提高種子產(chǎn)量90％。油菜中這些抑制DHS引起的多種影響與前文所得的擬南芥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(Wang等2003，PlantMol.Biol.521223-1225)，這提示這個(gè)蛋白在植物生長(zhǎng)和衰老中扮演重要角色。實(shí)施例29通過(guò)抑制物和反義技術(shù)抑制DHS延長(zhǎng)康乃馨的花瓶保鮮時(shí)間從康乃馨花瓣中分離編碼DHS的全長(zhǎng)cDNA克隆(AF396079)。DHS催化從無(wú)活性真核起始因子5A(eIF-5A)轉(zhuǎn)化為活性形式的兩個(gè)反應(yīng)的第一個(gè)。RNA雜交印跡技術(shù)分析揭示DHS表達(dá)相關(guān)于康乃馨花瓣衰老。用DHS反應(yīng)抑制物處理采摘下的康乃馨花，包括二氨基丁烷(腐胺)，二氨基丙烷，二氨基己烷，二氨基辛烷和精胺，如此延長(zhǎng)花的保鮮時(shí)間83％。為了更好的評(píng)估DHS在康乃馨花衰老中的作用，通過(guò)土壤桿菌轉(zhuǎn)化菌株將組成性花椰菜鑲嵌病毒雙35S啟動(dòng)子控制下的康乃馨DHScDNA的3’UTR反義序列導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株，以抑制蛋白的表達(dá)。分析三個(gè)DHS表達(dá)減少的轉(zhuǎn)基因植株品系，發(fā)現(xiàn)它們比野生型有相對(duì)較長(zhǎng)的花瓶保鮮時(shí)間。事實(shí)上，其中一個(gè)品系的花瓶保鮮時(shí)間延長(zhǎng)程度大于100％。這些發(fā)現(xiàn)表明DHS在花的衰老中扮演重要角色。實(shí)施例30GA3處理擬南芥以挽回抑制脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)引起的抽苔推遲的表型脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)是一種普遍存在的真核起始因子5A(eIF-5A)翻譯后活化所必需的酶，它是正常植物生長(zhǎng)和發(fā)育的基本要素。通過(guò)在衰老特異SAG12啟動(dòng)子控制下在擬南芥中反義表達(dá)全長(zhǎng)擬南芥DHScDNA，來(lái)抑制DHS。表達(dá)轉(zhuǎn)入基因的植株的葉中DHS蛋白水平下降，并表現(xiàn)出抽苔推遲和葉的衰老起始的顯著推遲(約2-5周)?；ㄌ?bolter)也變短，盡管這并不引起生物量或種子產(chǎn)量的降低。用GA3處理轉(zhuǎn)基因植株可反轉(zhuǎn)抽苔推遲表型。通過(guò)在GCT控制下反義表達(dá)DHS得到一個(gè)相似表型，GCI是一個(gè)糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)啟動(dòng)子，可被地塞米松(DEX)活化。GA3處理再次反轉(zhuǎn)這個(gè)表型，也就是說(shuō)，GA3處理過(guò)的轉(zhuǎn)基因植株抽苔正常，花苔大小正常，葉的衰老起始不推遲。這些結(jié)果共同證明DHS通過(guò)在擬南芥中活化三個(gè)eIF-5A同工型中的一個(gè)或更多，影響了GA代謝。參考文獻(xiàn)Azumi，YandWatanabe，A(1991)Evidenceforasenescence-associatedgeneinducedbydarkness.PlantPhysiol95577-583.BeckerW，ApelK(1993)Differencesingeneexpressionbetweennaturalandartificiallyinducedleafsenescence.Planta18974-79Bevec，D.，Jaksche，H.，Oft，M.，Wohl，T.，Himmelspach，M.，Pacher，A.，Schebesta，M.，Koettnitz，K.，Dobrovink，M.，Csonga，R.，Lottspeich，F(xiàn).，andHauber，J(1996)InhibitionofHIV-1replicationinlymphocytesbymutantsoftheRevcofactorofeIF-5A.Science2711858-1860.Bevec，D，andHauber，J(1997)Eukaryoticinitiationfactor5AactivityandHIV-1Revfunction.BiolSignals6124-133.Bleecker，A.B.，andPatterson，Se(1997)LastexitSenescence，abscission，andmeristemarrestinArabidopsis，PlantCell.91169-1179.Buchanan-Wollaston，V(1997)Themolecularbiologyofleafsenescence.JExpBot48181-191.Buchanan-WollastonV(1994)IsolationofcDNAclonesforgenesthatareexpressedduringleafsenescenceinBrassicanapus.PlantPhysiol105839-846Chen，KY，andLiu，AYC.(1997)Biochemistryandfunctionofhypusineformationoneukaryoticinitiationfactor5A.BiolSignals6105-109.DaviesKM，andGriersonD(1989)IdentificationofcDNAclonesfortomato(LycopersiconesculentumMill.)mRNAsthataccumulateduringfruitripeningandleafsenescenceinresponsetoethylene.PlantCell17973-80.DrakeR，JohnI，F(xiàn)arrellA，CooperW，SchuchW，andGriersonD(1996)IsolationandanalysisofcDNAsencodingtomatocysteineproteasesexpressedduringleafsenescence.PlantMolBiol30755-767Gan，SandAmasino，RM(1997).Moleculargeneticregulationandmanipulationofleafsenescence.PlantPhysiol113313-319.Gan，SandAmasino，RM(1995)Inhibitionofleafsenescencebyautoregulatedproductionofcytokinin.Science2701986-1988.Hanauske-Abel，H.M.，Hanauske，A.-R.，Popowicz，A.M.，Lalande，M.，andFolk，J.E.InhibitionofG1-Stransitionbyinhibitorsofdeoxyhypusinehydroxylation.BiochemBiophysActa1221115-124，1994.Henderson，BR，andPercipalle，P.(1997)InteractionsbetweenHIVRevandnuclearimportandexportfactorstheRevnuclearlocalizationsigualmediatespecificbindingtohumanimportin-beta.JMolBiol274693-707.Hensel，L.L.，V.Grbic，D.B.Baumgarten，andA.B.Bleecker.(1993).Developmentalandage-relatedprocessesthatinfluencethelongevityandsenescenceofphotosynthetictissuesinArabidopsis.PlantCell5553-564.Jakus，J.，Wolff，E.C.，Park，M.H.，andFolk，J.E.Featuresofthespermidine-bindingsiteofdeoxyhypusinesynthaseasderivedfrominhibitionstudieseffectiveinhibitionbybis-andMono-guanylateddiaminesandpolyamines.JBiolChem26813151-13159，1993.Kang，HA，andHershey，JWB(1994)EffectofinitiationfactoreIF-5AdepletiononproteinsynthesisandproliferationofSaccharomycescerevisiae.JBiolChem2693934-3940.Katahira，J，Ishizaki，T，Sakai，H，Adachi，A，Yamamoto，K，andshida，H.(1995)EffectsoftranslationinitiationfactoreIF-5AonthefunctioningofhumanT-cellleukemiavirustypeIRexandhumanimmunodeficiencyvirusRevtransdominantlybyaRexmutantdeficientinRNAbinding，JVirol693125-3133Kemper，WM，Berry，KW，andMerrick，WC(1976)PurificationandpropertiesofrabbitreticulocyteproteinsynthesisinitiationfactorsM2BαandM2Bβ.JBiolChem2515551-5557.Lohman，KN，Gan，S，John，MCandAmasino，R(1994)MolecularanalysisofnaturalleafsenescenceinArabidopsisthaliana.PhysPlant92322328.Lipowsky，G.，Bischoff，F(xiàn).R.，Schwarzmaier，P，Kraft，R.，Kostka，S.，Hartmann，E.，Kutay，U.，andGorlich，D.(2000)Exportin4amediatorofanovelnuclearexportpathwayinhighereukaryotes.EMBOJ.194362-4371.Liu，YP，Nemeroff，M，Yan，YP，andChen，KY.(1997)Interactionofeukaryoticinitiationfacto4Awiththehumanimmunodeficiencyvirustype1RevresponseelementRNAandU6snRNArequiresdeoxyhypusineorhypusinemodification.BiolSignals6166-174.Marinez-Zapater，JMandSalinas，J(1994)ArabidopsisProtocols.HumanPress；p.197.Mattaj，LW.，andEnglmeier，L.(1998)NucleocytoplasmictransportThesolublephase.AnnuRevBiochem67265-306Mehta，AM，Saftner，RA，Mehta，RA，andDavies，PJ(1994)Identificationofposttranslationallymodified18-kilodaltonproteinfromriceaseukaryotictranslationinitiationfactor5A.PlantPhysiol1061413-1419.Noh，Y-SandAmasino，R(1999)Identificationofapromoterregionresponsibleforthesenescence-specificexpressionofSAG12.PlantMolBiol41181-194.Noodén，LD，Guaimét，JJandJohn，I(1997)Senescence，mechanisms.PhysiolPlant101746-753.Noodén，LDandLeopold，AC(eds)(1988)Thephenomenaofsenescenceandaging.SenescenceandAginginPlants.AcademicPresspp.1-50.Ober，DandHartmann，T(1999)Deoxyhypusinesynthasefromtobacco.JBiolChem27432040-32047.OhSA，LeeSY，ChungIK，LeeCH，andNamHG(1996)Asenescence-associatedgeneofArabidopsisthalianaisdistinctivelyregulatedduringnaturalandartificiallyinducedleafsenescence.PlantMolBiol30739-754Page，DRandGrossniklaus，U(2002)TheartanddesignofgenticscreensArabidopsisthaliana.NatureReviewsGenetics3124-136Park，MH，Joe，YA，andKangKR(1998)DeoxyhypusinesynthaseactivityisessentialforcellviabilityintheyeastSaccharomysesCerevisiae.JBiolChem161677-1683.Park，MH，Wolff，EC，Lee，YBandFoIK，JE(1994)AntiproliferativeeffectsofinhibitorsofdeoxyhypusinesynthaseinhibitionofgrowthofChinesehamsterovarycellsbyguanyldiamines.JBiolChem26927827-27832.Park，M.H.，WolffE.C.，andFolkJ.E.(1993)Hypusineitspost-translationalformationineukaryoticinitiationfactor5Aanditspotentialroleincellularregulation.BiolFactors494-104.Park，MH，WolffEC，andFolkJE(1993)Ishypusineessentialforeukaryoticcellproliferation？TrendsBiochemSci18475-479.Park，MH，WolffEC，Smit-McBride，Z，Hershey，JWBandFolk，JE(1991)ComparisonoftheactivitiesofvariantformsofeIF-4Dtherequirementforhypusineordeoxyhypusine.JBiolChem2667988-7994，1991.Park，MHandWolffEC(1988)Cell-freesynthesisofdeoxyhypusine.JBiolChem26315264-15269.Quirino，BF，Noh，Y-S，Himelblau，EandAmasino，R(2000)Molecularaspectsofleafsenescence.TrendsPlantSci5278-282.Rosorius，O.，Reichart，B.，Kratzer，F(xiàn).，Heger，P.，Dabauvall，M.C.&Hauber，J.(1999)Nuclearporelocalization&nucleocytoplasmictransportofeIF-5AevidencefordirectinteractionwiththeexportreceptorCRM1.J.CellSci.112，2369-2380.Ruhl，M.，Himmelspach，M.，Bahr，G.M.，Hammerschmid，F(xiàn).，Jaschke，H.，Wolff，B.，Aschauer，H.，F(xiàn)arrington，G.K.，Probst，H.，Bevec，D.，andHauber，J.(1993)Eukaryoticinitiationfactor5Aisacellulartargetofthehumanimmunodeficiencyvirustype1Revactivationdomainmediatingtransactivation.JCellBiol1231309-1320.Schardl，CL，Byrd，AD，Bension，G，Altschuler，MS，Hildebrand，DFandHunt，AG(1987)Designandconstructionofversatilesystemfortheexpressionofforeigngenesinplants.Genes611-11.SchnierJ，SchwelbergerHG，Smit-McBrideZ，KangHAandHersheyJWB(1991)Translationinitiationfactor5AanditshypusinemodifcationareessentialforcellviabilityintheyeastSaccharomycescerevisiae.MolCellBiol113105-3114SmartCM，HoskenSE，ThomasH，GreavesJA，BlairBG，SchuchW(1995)Thetimingofmaizeleafsenescenceandcharacterizationofsenescenece-relatedcDNAs.PhysiolPlant93673-682Smart，CM(1994)Geneexpressionduringleafsenescenece.NewPhytologist126419-448.TaylorCB，BariolaPA，DelcardayreSB，RainesRT，GreenRT(1993)RNS2Asenescence-associatedRNaseofArabidopsisthatdivergedfromtheS-RNasesbeforespeciation.ProcNatlAcadSciUSA905118-5122Tome，m.，F(xiàn)iser，S.M.，Payne，C.M.，andGerner，EW.(1997)Excessputrescineaccumulationinhibitstheformationofmodifiedeukaryoticinitiationfactor5A(eIF-5A)andinducesapoptosis.Biochem.J.328847-854.Tome，M.，andGerner，EW.(1997)Cellulareukaryoticinitationfactor5Acontentasamediatorofpolyamineeffectsongrowthandapoptosis.BiolSignals6150-156.WalbotV(2000)Agreenchapterinthebookoflife.Nature408794-795.Wang，T-W，Lu，L，Wang，D，andThompson，JE(2003)Isolationandcharacterizationofsenescence-inducedcDNAsencodingdeoxyhypusinesynthaseandeukaryotictranslationinitiationfactor5Afromtomato.JBiolChem27617541-17549.Watanabe，AandImaseki，H(1982)ChangesintranslatablemRNAinsenescingwheatleaves.PlantCellPhysiol37455-469.Xu，A.andChen，K.Y.(2001)Hypusineisrequiredforasequence-specificinteractionofeukaryoticfactor5Awithpost-SELEXRNA.J.BiolChem.2762555-2561.Zuk，D.，andJacobson，A.(1998)AsingleaminoacidsubstitutioninyeasteIF-5AresultsinmRNAstabilization.EMBOJ.172914-2925.Boyes，D.C.，A.M.Zayed，R.Ascenzi，A.J.McCaskill，N.E.Hoffman，K.R.Davis，andJ.Goerlach.2001.Growthstage-basedphenotypicanalysisofArabidopsisAmodelforhighthroughputfunctionalgenomicsinplants.PlantCell，131499-1510.Collawn，J.F.，andY.Patterson.1999.Productionofantipeptideantibodies.InFMAusubel，RBrent，REKingston，DDMoore，JASmith，JGSeidman，KStruhl，eds，CurrentProtocolsinMolecularBiologyonCD.JohnWiley&Sons，NewYork.Chamot，D.andC.Kuhlemeier.1992.Differentialexpressionofgenesencodingthehypusine-containingtranslationinitiationfactor，eIF-5A，intobacco.NucleicAcidsRes20665-669.Clemens，MJ.，andU.-A.Bommer.1999.TrnslationalcontrolThecancerconnection.Int.J.ofBiochem.CellBiol.31:1-23.Davis，L.G.，M.D.Dibner，andJ.B.Battey.1986.Basicmethodsinmolecularbiology.ElsevierSciencePublishingCo.，Inc，NewYork，pp.130-5.Drenckhahn，D.，T.Jons，andF.Schmitz.1993.Productionofpolyclonalantibodiesagainstproteinsandpeptides.InDJAsai，ed，MethodsinCellBiology，Vol37.AcademicPress，NewYork，pp7-56.Dresselhaus，T.，C.Simone，andH.Lrz.1999.AtranscriptencodingtranslationfactoreIF-5Aisstoredinunfertilizedeggcellsofmaize.PlantMol.Biol.391063-1071.Fagard，M.andH.Vaucheret.2000.(Trans)GenesilencinginplantsHowmanymechanisms？Annu.Rev.PlantPhysiol.Mol.Biol.51167-94.Fairbanks，G.，T.L.Steck，andD.F.H.Wallach.1971.CoomassieblueR250usedinisopropanol-aceticacid.Biochem102606-2618.Ghosh，S.，S.Gepstein，J.J.Heikkila，andE.B.Dumbroff.1988.UseofascanningdensitometeroranELISAplatereaderformeasurementofnanogramamountsofproteinincrudeextractsfrombiologicaltissues.Anal.Biochem.169227-233.Jao，D.L.E.andK.Y.Chen.2002.Subcellularlocalizationofthehypusine-containingeukaryoticintiatiofactor5Abyimmunofluorescentstainingandgreenfluorescentproteintagging.J.Cell.Biochem.86590-600.Jakus，J.，E.C.Wolff，M.H.Park，andJ.E.Folk.1993.Featureofthespermidine-bindingsiteofdeoxyhypusinesynthesisasderivedfrominhibitionstudieseffectiveinhibitionbybis-andmono-guanlateddiaminesandpolyamines.J.Biol.Chem.268，13151-13159.Kushner，S.R.1978.AnimprovemethodfortransformationofEscherichiacoliwithColE1derivedplasmids.InGeneticEngineeringProceedingsoftheInternatioanalSymptomonGeneticEngineering(H.W.BoyerandS.Nicosia，eds.)，Elsevier/North-HollandPress，NewYork.Pp.17-23.Liu，Y，P.，M.Nemeroff，Y.P.Yan，K.Y.Chen.1997.Interactionofeukaryoticinitiationfactor5Awiththehumanimmunodeficiencyvirustype1RevresponseelementRNAandU6snRNArequiresdeoxyhypusineorhypusinemodification.Biol.Signals6(3)，166-74.Matile.P.，S.Hoertensteiner，andH.Thomas.1999.Chlorophylldegradation.Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.5069-75.McCabe，M.S，L.C.Garratt，F(xiàn).Schepers，W.J.R.M.Jordi，G.M.Stoopen，E.Davelaar，J.H.A.vanRhijn，J.B.Power，andM.R.Davey.2001.EffectsofPSAG12-IPTgeneexpressionondevelopmentandsenescenceintransgeniclettuce.PlantPhysiol.127505-516.Miranda，P.V.，A.Brandelli，andJ.G.Tezon.1993.Instantaneousblockingforimmunoblots.Anal.Biochem.209376-377.Murashige，T.andF.Skoog.1962.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissueculture.Physiol.Plant.15473-497.Nowack，LN.2002personalcommunications.Ober，DandT.Hartmann.1999.Deoxyhypusinesynthasefromtobacco.J.Biol.Chem.274(45)32040-32047.Page，T.，G.Griffiths，andV.Buchanan-Wollaston.2001.Molecularandbiochemicalcharacterizationofpostharvestsenescenceinbroccoli.PlantPhysiol.125718-727.Park，J.-H.，S.A.Oh，Y.H.Kim，H.R.Woo，andH.G.Nam.1998.Differentialexpressionofsenescence-associatemRNAsduringleafsenescenceinducedbydifferentsecescence-inducingfacorsinArabidopsis.PlantMol.Biol.37445-454.Park，M.H.Y.B.Lee，andY.A.Joe.1997.Hypusineisessentialforeukaryoticcellproliferation.Biol.Signals6，115-123.Park，M.H.，E.C.Wolff，andJ.E.Folk.1993.Hypusineitspost-translationalformationineukaryoticinitiationfactor5Aanditspotentialroleincellularregulation.BioFactor4(2)，95-104.Park，M.H.，E.C.Wolff，1998.Cell-freesynthesisofdeoxyhypusine.J.Biol.Chem.263(30)15264-15269.Rosorius，O.，B.Reicher，F(xiàn).Kraetzer，P.Heger，M.-C.Dabauvalle，andJ.Hauber.1999.NuclearporelocalizationandnucleocytoplasmictransportofeIF-5AevidencefordirectinteractionwiththeexportreceptorCRM1.J.CellSci.1122369-2380.Stotz2000Tome，M.E.andE.W.Gemer.1997.Cellulareukaryoticinitiationfactor5Acontentasamediatorofpolyamineeffectsofgrowthandapoptosis.Biol.Signals6，150-156.Wang，C.Y.andJ.E.Baker.1980.Extendingvaselifeofcarnationswithminooxyaceticacid，polyamines，EDU，andCCCP.HorSci.15，805-806.Wang，T.-W.，L.Lu，C.-G.Zhang，C.A.Taylor，andJ.E.Thompson.Unpublisheda.SuppressionofdeoxyhypusinesynthesieexpressioninArabidopsisthalianadelaysleafsecescence.Wang，T.-W.，W.Wu，C.Taylor，andJ.E.Thompson.Unpublishedb.Characerizationofeukaryotictranslatininitiationfactor-5AcDNAisoformsfromtomato.Wang，T.-W.，C.-G.Zhang，L.Lu，L.N.Nowack，andJ.E.Thompson.Unpublishedc.Extendingvaselifeofcarnationbydeoxyhypusinesynthesisinhibitorsandtransienttransfectionwithantisensedeoxyhypusinsynthase.Wang，T.-W.，L.Lu，D.Wang，andJ.E.Thompson.2001.Isolatinandcharacterizationofsenescence-induceddcDNAsecodingdeoxyhypusinesynthaseandeukarotictranslatoninitiationfactor5Afromtomato.J.Biol.Chem.276(20)17541-17549.Zuk，D.andA.Jacobson.1998.AsingleaminoacidsubsititutioninyeasteIF-5AresultinmRNAstabilization.EMBOJ.17(10)2914-2925.序列表<110>森尼斯科技術(shù)公司(SENESCOTECHNOLOGIES，INC.)<120>反義寡核苷酸或siRNA抑制eIF-5A1表達(dá)的用途<130>13.947-P<140><141><150>10/383,614<151>2003-03-10<150>10/277,969<151>2002-10-23<150>10/200,148<151>2002-07-23<150>10/141,647<151>2002-05-07<150>09/909,796<151>2001-07-23<150>60/451,677<151>2003-03-05<150>60/476,194<151>2003-06-06<150>60/504,731<151>2003-09-22<160>85<170>PatentInVer.3.2<210>1<211>1139<212>DNA<213>大鼠種(Rattussp.)<220><221>CDS<222>(33)..(494)<400>1caggtctagagttggaatcgaagcctcttaaaatggcagatgatttggacttc53MetAlaAspAspLeuAspPhe15gagacaggagatgcaggggcctcagccaccttcccaatgcagtgctca101GluThrGlyAspAlaGlyAlaSerAlaThrPheProMetGlnCysSer101520gcattacgtaagaatggttttgtggtgctcaagggccggccatgtaag149AlaLeuArgLysAsnGlyPheValValLeuLysGlyArgProCygLys253035atcgtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcatggccatgccaag197IleValGluMetSerThrSerLysThrGlyLysHisGlyHisAlaLys40455055gtccatctggttggtattgatatttttactgggaagaaatatgaagat245ValHisLeuValGlyIleAspIlePheThrGlyLysLysTyrGluAsp606570atctgcccgtcgactcataacatggatgtccccaacatcaaaaggaat293IleCysProSerThrHisAsnMetAspValProAsnIleLysArgAsn758085gatttccagctgattggcatccaggatgggtacctatccctgctccag341AspPheGlnLeuIleGlyIleGlnAspGlyTyrLeuSerLeuLeuGln9095100gacagtggggaggtacgagaggaccttcgtctgcctgagggagacctt389AspSerGlyGluValArgGluAspLeuArgLeuProGluGlyAspLeu105110115ggcaaggagattgagcagaagtatgactgtggagaagagatcctgatc437GlyLysGluIleGluGlnLysTyrAspCysGlyGluGluIleLeuIle120125130135acagtgctgtccgccatgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggcc485ThrValLeuSerAlaMetThrGluGluAlaAlaValAlaIleLysAla140145150atggcaaaataactggcttccagggtggcggtggtggcagcagtgatcc534MetAlaLysatgagcctacagaggcccctcccccagctctggctgggcccttggctggactcctatcca594atttatttgacgttttattttggttttcctcaccccttcaaactgtcggggagaccctgc654ccttcacctagctcccttggccaggcatgagggagccatggccttggtgaagctacctgc714ctcttctctcgcagccctgatgggggaaagggagtgggtactgcctgtggtttaggttcc774cctctccctttttctttttaattcaatttggaatcagaaagctgtggattctggcaaatg834gtcttgtgtcctttatcccactcaaacccatctggtcccctgttctccatagtccttcac894ccccaagcaccactgacagactggggaccagcccccttccctgcctgtgtctcttcccaa954acccctctataggggtgacaagaagaggagggggggaggggacacgatccctcctcaggc1014atctgggaaggccttgcccccatgggctttaccctttcctgtgggctttctccctgacac1074atttgttaaaaatcaaacctgaataaaactacaagtttaatatgaaaaaaaaaaaaaaaa1134aaaaa1139<210>2<211>154<212>PRT<213>大鼠種(Rattussp.)<400>2MetAlaAspAspLeuAspPheGluThrGlyAspAlaGlyAlaSerAla151015ThrPheProMetGlnCysSerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyArgProCysLysIleValG1uMetSerThrSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspPheGlnLeuIleGlyIleGlnAsp859095GlyTyrLeuSerLeuLeuGlnAspSerGlyGluValArgGluAspLeu100105110ArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGlnLysTyrAsp115120125CysGlyGluGluIleLeuIleThrValLeuSerAlaMetThrGluGlu130135140AlaAlaValAlaIleLysAlaMetAlaLys145150<210>3<211>462<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>3atggcagatgacttggacttcgagacaggagatgcaggggcctcagccaccttcccaatg60cagtgctcagcattacgtaagaatggctttgtggtgctcaaaggccggccatgtaagatc120gtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcacggccacgccaaggtccatctggttggt180attgacatctttactgggaagaaatatgaagatatctgcccgtcaactcataatatggat240gtccccaacatcaaaaggaatgacttccagctgattggcatccaggatgggtacctatca300ctgctccaggacagcggggaggtacgagaggaccttcgtctccctgagggagaccttggc360aaggagattgagcagaagtacgactgtggagaagagatcctgatcacggtgctgtctgcc420atgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggccatggcaaaa462<210>4<211>460<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>4atggcagacgaaattgatttcactactggagatgccggggcttccagcacttaccctatg60cagtgctcggccttgcgcaaaaacggcttcgtggtgctcaaaggacgaccatgcaaaata120gtggagatgtcaacttccaaaactggaaagcatggtcatgccaaggttcaccttgttgga180attgatattttcacgggcaaaaaatatgaagatatttgtccttctactcacaacatggat240gttccaaatattaagagaaatgattatcaactgatatgcattcaagatggttacctttcc300ctgctgacagaaactggtgaagttcgtgaggatcttaaactgccagaaggtgaactaggc360aaagaaatagagggaaaatacaatgcaggtgaagatgtacaggtgtctgtcatgtgtgca420atgagtgaagaatatgctgtagccataaaaccctgcaaat460<210>5<211>462<212>DNA<213>大鼠種(Rattussp.)<400>5atggcagatgatttggacttcgagacaggagatgcaggggcctcagccaccttcccaatg60cagtgctcagcattacgtaagaatggttttgtggtgctcaaaggccggccatgtaagatc120gtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcatggccatgccaaggtccatctggttggc180attgacatttttactgggaagaaatatgaagatatctgcccgtcgactcataatatggat240gtccccaacatcaaacggaatgacttccagctgattggcatccaggatgggtacctatcc300ctgctccaggacagtggggaggtacgagaggaccttcgtctgcctgaaggagaccttggc360aaggagattgagcagaagtatgactgtggagaagagatcctgatcacagtgctgtctgcc420atgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggccatggcaaaa462<210>6<211>606<212>DNA<213>大鼠種(Rattussp.)<220><221>CDS<222>(1)..(453)<400>6gctgtgtattattgggcccataagaaccacatacctgtgctgagtcct48AlaValTyrTyrTrpAlaHisLysAsnHisIleProValLeuSerPro151015gcactcacagacggctcactgggtgacatgatctttttccattcctat96AlaLeuThrAspGlySerLeuGlyAspMetIlePhePheHisSerTyr202530aaaaacccaggcttggtcctggacatcgttgaagacctgcggctcatc144LysAsnProGlyLeuValLeuAspIleValGluAspLeuArgLeuIle354045aacatgcaggccattttcgccaagcgcactgggatgatcatcctgggt192AsnMetGlnAlaIlePheAlaLysArgThrGlyMetIleIleLeuGly505560ggaggcgtggtcaagcaccacatcgccaatgctaacctcatgcggaat240GlyGlyValValLysHisHisIleAlaAsnAlaAsnLeuMetArgAsn65707580ggagctgactacgctgtttatatcaacacagcccaggagtttgatggc288GlyAlaAspTyrAlaValTyrIleAsnThrAlaGlnGluPheAspGly859095tcagactcaggagcccggccagatgaggctgtctcctggggcaagatc336SerAspSerGlyAlaArgProAspGluAlaValSerTrpGlyLysIle100105110cggatggatgcacagccagtaaaggtctatgctgatgcatctctggtt384ArgMetAspAlaGlnProValLysValTyrAlaAspAlaSerLeuVal115120125ttccccttgctggtggctgagacattcgcccaaaaggcagatgccttc432PheProLeuLeuValAlaGluThrPheAlaGlnLysAlaAspAlaPhe130135140agagctgagaagaatgaggactgagcagatgggtaaagacggaggcttctg483ArgAlaGluLysAsnGluAsp145150ccacacctttatttattatttgcataccaacccctcctgggccctctccttggtcagcag543catcttgagaataaatggcctttttgttggtttctgtaaaaaaaggactttaaaaaaaaa603aaa606<210>7<211>151<212>PRT<213>大鼠種(Rattussp.)<400>7AlaValTyrTyrTrpAlaHisLysAsnHisIleProValLeuSerPro151015AlaLeuThrAspGlySerLeuGlyAspMetIlePhePheHisSerTyr202530LysAsnProGlyLeuValLeuAspIleValGluAspLeuArgLeuIle354045AsnMetGlnAlaIlePheAlaLysArgThrGlyMetIleIleLeuGly505560GlyGlyValValLysHisHisIleAlaAsnAlaAsnLeuMetArgAsn65707580GlyAlaAspTyrAlaVa1TyrIleAsnThrAlaGlnGluPheAspGly859095SerAspSerGlyAlaArgProAspGluAlaValSerTrpGlyLysIle100105110ArgMetAspAlaGlnProValLysValTyrAlaAspAlaSerLeuVal115120125PheProLeuLeuValAlaGluThrPheAlaGlnLysAlaAspAlaPhe130135140ArgAlaGluLysAsnGluAsp145150<210>8<211>453<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>8tccgtgtattactgggcccagaagaaccacatccctgtgtttagtcccgcacttacagac60ggctcgctgggcgacatgatcttcttccattcctacaagaacccgggcctggtcctggac120atcgttgaggacctgaggctcatcaacacacaggccatctttgccaagtgcactgggatg180atcattctgggcgggggcgtggtcaagcaccacattgccaatgccaacctcatgcggaac240ggggccgactacgctgtttacatcaacacagcccaggagtttgatggctctgactcaggt300gcccgaccagacgaggctgtctcctggggcaagatccgggtggatgcacagcccgtcaag360gtctatgctgacgcctccctggtcttccccctgcttgtggctgaaacctttgcccagaag420atggatgccttcatgcatgagaagaacgaggac453<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<220><221>modified_base<222>(12)<223>a、t、c或g<400>9tcsaarachggnaagcaygg20<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>10gcgaagcttccatggctcgagttttttttttttttttttttt42<210>11<211>972<212>DNA<213>大鼠種(Rattussp.)<220><221>CDS<222>(1)..(327)<400>11tcgaagaccggtaagcacggccatgccaaggtccatctggttggtatt48SerLysThrGlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIle151015gatatttttactgggaagaaatatgaagatatctgcccgtcgactcat96AspIlePheThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHis202530aacatggatgtccccaacatcaaaaggaatgatttccagctgattggc144AsnMetAspValProAsnIleLysArgAsnAspPheGlnLeuIleGly354045atccaggatgggtacctatccctgctccaggacagtggggaggtacga192IleGlnAspGlyTyrLeuSerLeuLeuGlnAspSerGlyGluValArg505560gaggaccttcgtctgcctgagggagaccttggcaaggagattgagcag240GluAspLeuArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGln65707580aagtatgactgtggagaagagatcctgatcacagtgctgtccgccatg288LysTyrAspCysGlyGluGluIleLeuIleThrValLeuSerAlaMet859095acagaggaggcagctgttgcaatcaaggccatggcaaaataactggctt337ThrGluGluAlaAlaValAlaIleLysAlaMetAlaLys100105ccagggtggcggtggtggcagcagtgatccatgagcctacagaggcccctcccccagctc397tggctgggcccttggctggactcctatccaatttatttgacgttttattttggttttcct457caccccttcaaactgtcggggagaccctgcccttcacctagctcccttggccaggcatga517gggagccatggccttggtgaagctacctgcctcttctctcgcagccctgatgggggaaag577ggagtgggtactgcctgtggtttaggttcccctctccctttttctttttaattcaatttg637gaatcagaaagctgtggattctggcaaatggtcttgtgtcctttatcccactcaaaccca697tctggtcccctgttctccatagtccttcacccccaagcaccactgacagactggggacca757gcccccttccctgcctgtgtctcttcccaaacccctctataggggtgacaagaagaggag817ggggggaggggacacgatccctcctcaggcatctgggaaggccttgcccccatgggcttt877accctttcctgtgggctttctccctgacacatttgttaaaaatcaaacctgaataaaact937acaagtttaatatgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa972<210>12<211>109<212>PRT<213>大鼠種(Rattussp.)<400>12SerLyrThrGlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIle151015AspIlePheThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHis202530AsnMetAspValProAsnIleLysArgAsnAspPheGlnLeuIleGly354045IleGlnAspGlyTyrLeuSerLeuLeuGlnAspSerGlyGluValArg505560GluAspLeuArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGln65707580LysTyrAspCysGlyGluGluIleLeuIleThrValLeuSerAlaMet859095ThrGluGluAlaAlaValAlaIleLysAlaMetAlaLys100105<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>13caggtctagagttggaatcgaagc24<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>14atatctcgagccttgattgcaacagctgcc30<210>15<211>489<212>DNA<213>大鼠種(Rattussp.)<220><221>CDS<222>(33)..(485)<400>15caggtctagagttggaatcgaagcctcttaaaatggcagatgatttggacttc53MetAlaAspAspLeuAspPhe15gagacaggagatgcaggggcctcagccaccttcccaatgcagtgctca101GluThrGlyAspAlaGlyAlaSerAlaThrPheProMetGlnCysSer101520gcattacgtaagaatggttttgtggtgctcaagggccggccatgtaag149AlaLeuArgLysAsnGlyPheValValLeuLysGlyArgProCysLys253035atcgtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcatggccatgccaag197IleValGluMetSerThrSerLysThrGlyLysHisGlyHisAlaLys40455055gtccatctggttggtattgatatttttactgggaagaaatatgaagat245ValHisLeuValGlyIleAspIlePheThrGlyLysLysTyrGluAsp606570atctgcccgtcgactcataacatggatgtccccaacatcaaaaggaat293IleCysProSerThrHisAsnMetAspValProAsnIleLysArgAsn758085gatttccagctgattggcatccaggatgggtacctatccctgctccag341AspPheGlnLeuIleGlyIleGlnAspGlyTyrLeuSerLeuLeuGln9095100gacagtggggaggtacgagaggaccttcgtctgcctgagggagacctt389AspSerGlyGluValArgGluAspLeuArgLeuProGluGlyAspLeu105110115ggcaaggagattgagcagaagtatgactgtggagaagagatcctgatc437GlyLysGluIleGluGlnLyeTyrAspCysGlyGluGluIleLeuIle120125130135acagtgctgtccgccatgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggct485ThrValLeuSerAlaMetThrGluGluAlaAlaValAlaIleLysAla140145150cgag489<210>16<211>151<212>PRT<213>大鼠種(Rattussp.)<400>16MetAlaAspAspLeuAspPheGluThrGlyAspAlaGlyAlaSerAla151015ThrPheProMetGlnCysgerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyArgProCysLysIleValGluMetSerThrSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspPheGlnLeuIleGlyIleGlnAsp859095GlyTyrLeuSerLeuLeuGlnAspSerGlyGluValArgGluAspLeu100105110ArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGlnLysTyrAsp115120125CysGlyGluGluIleLeuIleThrValLeuSerAlaMetThrGluGlu130135140AlaAlaValAlaIleLysAla145150<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>17gtctgtgtattattgggccc20<210>18<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>18gcgaagcttccatggctcgagttttttttttttttttttttt42<210>19<211>1299<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>19ggcacgagggcggcggcggcggtagaggcggcggcggcggcggcagcgggctcggaggca60gcggttgggctcgcggcgagcggacggggtcgagtcagtgcgttcgcgcgagttggaatc120gaagcctcttaaaatggcagatgacttggacttcgagacaggagatgcaggggcctcagc180caccttcccaatgcagtgctcagcattacgtaagaatggctttgtggtgctcaaaggccg240gccatgtaagatcgtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcacggccacgccaaggt300ccatctggttggtattgacatctttactgggaagaaatatgaagatatctgcccgtcaac360tcataatatggatgtccccaacatcaaaaggaatgacttccagctgattggcatccagga420tgggtacctatcactgctccaggacagcggggaggtacgagaggaccttcgtctccctga480gggagaccttggcaaggagattgagcagaagtacgactgtggagaagagatcctgatcac540ggtgctgtctgccatgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggccatggcaaaataact600ggctcccaggatggcggtggtggcagcagtgatcctctgaacctgcagaggccccctccc660cgagcctggcctggctctggcccggtcctaagctggactcctcctacacaatttatttga720cgttttattttggttttccccaccccctcaatctgtcggggagcccctgcccttcaccta780gctcccttggccaggagcgagcgaagctgtggccttggtgaagctgccctcctcttctcc840cctcacactacagccctggtgggggagaagggggtgggtgctgcttgtggtttagtcttt900tttttttttttttttttttttttaaattcaatctggaatcagaaagcggtggattctggc960aaatggtccttgtgccctccccactcatccctggtctggtcccctgttgcccatagccct1020ttaccctgagcaccaccccaacagactggggaccagccccctcgcctgcctgtgtctctc1080cccaaacccctttagatggggagggaagaggaggagaggggaggggacctgccccctcct1140caggcatctgggagggccctgcccccatgggctttacccttccctgcgggctctctcccc1200gacacatttgttaaaatcaaacctgaataaaactacaagtttaatatgaaaaaaaaaaaa1260aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1299<210>20<211>462<212>DNA<213>大鼠種(Rattussp.)<400>20atggcagatgatttggacttcgagacaggagatgcaggggcctcagccaccttcccaatg60cagtgctcagcattacgtaagaatggttttgtggtgctcaagggccggccatgtaagatc120gtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcatggccatgccaaggtccatctggttggt180attgatatttttactgggaagaaatatgaagatatctgcccgtcgactcataacatggat240gtccccaacatcaaaaggaatgatttccagctgattggcatccaggatgggtacctatcc300ctgctccaggacagtggggaggtacgagaggaccttcgtctgcctgagggagaccttggc360aaggagattgagcagaagtatgactgtggagaagagatcctgatcacagtgctgtccgcc420atgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggccatggcaaaa462<210>21<211>l54<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>21MetAlaAspAspLeuAspPheGluThrGlyAspAlaGlyAlaSerAla151015ThrPheProMetGlnCysSerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyArgProCysLysIleValGluMetSerThrSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspPheGlnLeuIleGlyIleGlnAsp859095GlyTyrLeuSerLeuLeuGlnAspSerGlyGluValArgGluAspLeu100105110ArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGlnLysTyrAsp115120125CysGlyGluGluIleLeuIleThrValLeuSerAlaMetThrGluGlu130135140AlaAlaValAlaIleLysAlaMetAlaLys145150<210>22<211>153<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>22MetAlaAspGluIleAspPheThrThrGlyAspAlaGlyAlaSerSer151015ThrTyrProMetGlnCysSerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyArgProCysLysIleValGluMetSerThrSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspTyrGlnLeuIleCysIleGlnAsp859095GlyTyrLeuSerLeuLeuThrGluThrGlyGluValArgGluAspLeu100105110LysLeuProGluGlyGluLeuGlyLysGluIleGluGlyLysTyrAsn115120125AlaGlyGluAspValGlnValSerValMetCysAlaMetSerGluGlu130135140TyrAlaValAlaIleLysProCysLys145150<210>23<211>154<212>PRT<213>小鼠(Musmusculus)<400>23MetAlaAspAspLeuAspPheGluThrGlyAspAlaGlyAlaSerAla151015ThrPheProMetGlnCysSerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyArgProCysLysIleValGluMetSerThrSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuVa1GlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspPheGlnLeuIleGlyIleGlnAsp859095GlyTyrLeuSerLeuLeuGlnAspSerGlyGluValArgGluAspLeu100105110ArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGlnLysTyrAsp115120125CysGlyGluGluIleLeuIleThrValLeuSerAlaMetThrGluGlu130135140AlaAlaValAlaIleLysAlaMetAlaLys145150<210>24<211>153<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>24MetAlaAspGluIleAspPheThrThrGlyAspAlaGlyA1aSerSer151015ThrTyrProMetGlnCysSerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyArgProCysLysIleValGluMetSerThrSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspTyrGlnLeuIleCysIleGlnAsp859095GlyCysLeuSerLeuLeuThrGluThrGlyGluValArgGluAspLeu100105110LysLeuProGluGlyGluLeuGlyLysGluIleGluGlyLysTyrAsn115120125AlaGlyGluAspValGlnValSerValMetCysAlaMetSerGluGlu130135140TyrAlaValAlaIleLysProCysLys145150<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>25gacttggacttcgagacagg20<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>26gcacggccacgccaaggtc19<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>27ggacagcggggaggtacgag20<210>28<211>153<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明說(shuō)明性共有序列<400>28MetAlaAspGluIleAspPheThrThrGlyAspAlaGlyAlaSerSer151015ThrTyrProMetGlnCysSerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyArgProCysLysIleValGluMetSerThrSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspTyrGlnLeuIleCysIleGlnAsp859095GlyCysLeuSerLeuLeuThrGluThrGlyGluValArgGluAspLeu100105110LysLeuProGluGlyGluLeuGlyLysGluIleGluGlyLysTyrAsn115120125AlaGlyGluAspValGlnValSerValMetCysAlaMetSerGluGlu130135140TyrAlaValAlaIleLysProCysLys145150<210>29<211>1309<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>29ggcacgagggtagaggcggcggcggcggcggcagcgggctcggaggcagcggttgggctc60gcggcgagcggacggggtcgagtcagtgcgttcgcgcgagttggaatcgaagcctcttaa120aatggcagatgacttggacttcgagacaggagatgcaggggcctcagccaccttcccaat180gcagtgctcagcattacgtaagaatggctttgtggtgctcaaaggccggccatgtaagat240cgtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcacggccacgccaaggtccatctggttgg300tattgacatctttactgggaagaaatatgaagatatctgcccgtcaactcataatatgga360tgtccccaacatcaaaaggaatgacttccagctgattggcatccaggatgggtacctatc420actgctccaggacagcggggaggtacgagaggaccttcgtctccctgagggagaccttgg480caaggagattgagcagaagtacgactgtggagaagagatcctgatcacggtgctgtctgc540catgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggccatggcaaaataactggctcccaggat600ggcggtggtggcagcagtgatcctctgaacctgcagaggccccctccccgagcctggcct660ggctctggcccggtcctaagctggactcctcctacacaatttatttgacgttttattttg720gttttccccaccccctcaatctgtcggggagcccctgcccttcacctagctcccttggcc780aggagcgagcgaagctgtggccttggtgaagctgccctcctcttctcccctcacactaca840gccctggtgggggagaagggggtgggtgctgcttgtggtttagtcttttttttttttttt900ttttttttttaaattcaatctggaatcagaaagcggtggattctggcaaatggtccttgt960gccctccccactcatccctggtctggtcccctgttgcccatagccctttaccctgagcac1020caccccaacagactggggaccagccccctcgcctgcctgtgtctctccccaaaccccttt1080agatggggagggaagaggaggagaggggaggggacctgccccctcctcaggcatctggga1140gggccctgcccccatgggctttacccttccctgcgggctctctccccgacacatttgtta1200aaatcaaacctgaataaaactacaagtttaatatgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1260aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1309<210>30<211>23<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>30aaaggaatgacttccagctgatt23<210>31<211>23<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>31aagatcgtcgagatgtctacttc23<210>32<211>23<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>32aaggtccatctggttggtattga23<210>33<211>23<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>33aagctggactcctcctacacaat23<210>34<211>23<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>34aaagtcgaccttcagtaaggatt23<210>35<211>20<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>35cctgtctcgaagtccaagtc20<210>36<211>20<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>36gacttggacttcgagacagg20<210>37<211>20<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>37ggaccttggcgtggccgtgc20<210>38<211>20<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>38gcacggccacgccaaggtcc20<210>39<211>20<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>39ctcgtacctccccgctctcc20<210>40<211>19<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>40ggacagcggggaggtacga19<210>41<211>465<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>41atggcagatgacttggacttcgagacaggagatgcaggggcctcagccaccttcccaatg60cagtgctcagcattacgtaagaatggctttgtggtgctcaaaggccggccatgtaagatc120gtcgagatgtctacttcgaagactggcaagcacggccacgccaaggtccatctggttggt180attgacatctttactgggaagaaatatgaagatatctgcccgtcaactcataatatggat240gtccccaacatcaaaaggaatgacttccagctgattggcatccaggatgggtacctatca300ctgctccaggacagcggggaggtacgagaggaccttcgtctccctgagggagaccttggc360aaggagattgagcagaagtacgactgtggagaagagatcctgatcacggtgctgtctgcc420atgacagaggaggcagctgttgcaatcaaggccatggcaaaataa465<210>42<211>462<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>42atggcagacgaaattgatttcactactggagatgccggggcttccagcacttaccctatg60cagtgctcggccttgcgcaaaaacggcttcgtggtgctcaaaggacgaccatgcaaaata120gtggagatgtcaacttccaaaactggaaagcatggtcatgccaaggttcaccttgttgga180attgatattttcacgggcaaaaaatatgaagatatttgtccttctactcacaacatggat240gttccaaatattaagagaaatgattatcaactgatatgcattcaagatggttacctttcc300ctgctgacagaaactggtgaagttcgtgaggatcttaaactgccagaaggtgaactaggc360aaagaaatagagggaaaatacaatgcaggtgaagatgtacaggtgtctgtcatgtgtgca420atgagtgaagaatatgctgtagccataaaaccctgcaaataa462<210>43<211>154<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>43MetAlaAspAspLeuAspPheGluThrGlyAspAlaGlyAlaSerAla151015ThrPheProMetGlnCysSerAlaLeuArgLysAsnGlyPheValVal202530LeuLysGlyTrpProCysLysIleValGluMetSerAlaSerLysThr354045GlyLysHisGlyHisAlaLysValHisLeuValGlyIleAspIlePhe505560ThrGlyLysLysTyrGluAspIleCysProSerThrHisAsnMetAsp65707580ValProAsnIleLysArgAsnAspPheGlnLeuIleGlyIleGlnAsp859095GlyTyrLeuSerLeuLeuGlnAspSerGlyGluValProGluAspLeu100105110ArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGlnLysTyrAsp115120125CysGlyGluGluIleLeuIleThrLeuLeuSerAlaMetThrGluGlu130135140AlaAlaValAlaIleLysAlaMetAlaLys145150<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>44aaaggaatgacttccagctga21<210>45<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>45aaaggaaugacuuccagcugatt23<210>46<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>46ucagcuggaagucauuccuuutt23<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>47aagatcgtcgagatgtctact21<210>48<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>48aagaucgucgagaugucuacutt23<210>49<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>49aguagacaucucgacgaucuutt23<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>50aaggtccatctggttggtatt21<210>51<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>51aagguccaucugguugguauutt23<210>52<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>52aauaccaaccagauggaccuutt23<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>53aagctggactcctcctacaca21<210>54<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>54aagcuggacuccuccuacacatt23<210>55<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>55uguguaggaggaguccagcuutt23<210>56<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>56aaagtcgaccttcagtaagga21<210>57<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>57aaagucgaccuucaguaaggatt23<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA/RNA結(jié)合分子說(shuō)明合成寡核苷酸<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>58uccuuacugaaggucgacuuutt23<210>59<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>59gccaagcttaatggcagatgatttgg26<210>60<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>60ctgaattccagttattttgccatgg25<210>61<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>61aatgaattccgccatgacagaggaggc27<210>62<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成引物<400>62gcgaagcttccatggctcgagttttttttttttttttttttt42<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>63cctgtctcgaagtccaagtc20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>64ggaccttggcgtggccgtgc20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>65ctcgtacctccccgctctcc20<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>66cgtaccggtacggttccagg20<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>67ggaccttggcgtggccgtgc20<210>68<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成肽<400>68CysArgLeuProGluGlyAspLeuGlyLysGluIleGluGlnLysTyr151015Asp<210>69<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>69aaaggaatgacttccagctgacctgtctc29<210>70<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>70aatcagctggaagtcattcctcctgtctc29<210>71<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>71aagatcgtcgagatgtctactcctgtctc29<210>72<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>72aaagtagacatctcgacgatccctgtctc29<210>73<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>73aaggtccatctggttggtattcctgtctc29<210>74<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>74aaaataccaaccagatggacccctgtctc29<210>75<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>75aagctggactcctcctacacacctgtctc29<210>76<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>76aatgtgtaggaggagtccagccctgtctc29<210>77<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>77aaagtcgaccttcagtaaggacctgtctc29<210>78<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>78aatccttactgaaggtcgactcctgtctc29<210>79<211>20<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>79aagcuggacuccuccuacac20<210>80<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>80aaacacauccuccucaggucg21<210>81<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>81aaaggaatgacttccagctga21<210>82<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>82aagatcgtcgagatgtctact21<210>83<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>83aaggtccatctggttggtatt21<210>84<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>84aagctggactcctcctacaca21<210>85<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成寡核苷酸<400>85aaagtcgaccttcagtaagga2權(quán)利要求1.一種分離的擬南芥損傷-誘導(dǎo)eIF-5A。2.一種分離的番茄損傷-誘導(dǎo)eIF-5A。3.一段擬南芥損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的反義多核苷酸。4.一段番茄損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的反義多核苷酸。5.一種用于轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含權(quán)利要求3的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。6.一種用于轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含權(quán)利要求4的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。7.一種抑制植物體內(nèi)內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A表達(dá)的方法，該方法包括將載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)，該載體包含損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，由此所述反義多核苷酸的所述轉(zhuǎn)錄抑制該植株體內(nèi)內(nèi)源損傷-誘導(dǎo)eIF-5A的表達(dá)。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抑制表達(dá)賦予植物體比野生型植株更高的對(duì)病原體入侵引起的致病損害的抗性。9.一種分離的擬南芥生長(zhǎng)eIF-5A。10.一種分離的番茄生長(zhǎng)eIF-5A。11.一種分離的油菜生長(zhǎng)eIF-5A。12.一種用于轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含正義方向的生長(zhǎng)eIF-5A多核苷酸和操作性連接在該多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。13.一種提高植物體內(nèi)生長(zhǎng)eIF-5A表達(dá)的方法，該方法包括將載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)，該載體包含生長(zhǎng)eIF-5A的多核苷酸和操作性連接在該多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，由此所述多核苷酸的所述轉(zhuǎn)錄提高該植株體內(nèi)生長(zhǎng)eIF-5A的表達(dá)。14.一種分離的油菜DHS。15.一種分離的苜蓿DHS。16.一種分離的香蕉DHS。17.一種分離的三角葉楊DHS。18.一段油菜DHS的反義多核苷酸。19.一段苜蓿DHS的反義多核苷酸。20.一段香蕉DHS的反義多核苷酸。21.一種用于轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含權(quán)利要求18的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。22.一種用于轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含權(quán)利要求18的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。23.一種用于轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含權(quán)利要求20的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。24.一種抑制植物體內(nèi)內(nèi)源DHS表達(dá)的方法，該方法包括將載體整合進(jìn)植株的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)，該載體包含DHS的反義多核苷酸和操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，用以提供所述反義多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，由此所述反義多核苷酸的所述轉(zhuǎn)錄抑制該植株體內(nèi)內(nèi)源DHS的表達(dá)。25.一種通過(guò)抑制DHS表達(dá)來(lái)推遲萵苣褐變的方法，該方法包括將載體整合進(jìn)萵苣的至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)，該載體包含a)萵苣DHS的反義多核苷酸，和b)操作性連接在該反義多核苷酸上的調(diào)節(jié)序列，使該反義多核苷酸表達(dá)，且這種表達(dá)抑制內(nèi)源DHS的表達(dá)，用以產(chǎn)生DHS表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因萵苣，并且其中所述抑制內(nèi)源DHS的表達(dá)得到的所述轉(zhuǎn)基因萵苣與野生型萵苣相比，表現(xiàn)出褐變推遲。全文摘要本發(fā)明涉及真核起始因子5A(“eIF－5A”)的獨(dú)特的同工型衰老－誘導(dǎo)eIF－5A；損傷－誘導(dǎo)eIF－5A和生長(zhǎng)eIF－5A以及編碼這些因子的多核苷酸。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)這些因子表達(dá)的相關(guān)方法。本發(fā)明還涉及脫氧羥丁賴氨酸(hypusine)合酶(“DHS”)、編碼DHS的多核苷酸以及調(diào)節(jié)DHS表達(dá)的相關(guān)方法。文檔編號(hào)C07K14/47GK1839154SQ200480023751公開日2006年9月27日申請(qǐng)日期2004年6月21日優(yōu)先權(quán)日2003年6月20日發(fā)明者J·E·湯普遜申請(qǐng)人:森尼斯科技術(shù)公司