本發(fā)明涉及一種基于CRISPR的大腸桿菌ST131系菌株檢測引物，同時(shí)還涉及包含該引物的試劑盒以及大腸桿菌ST131系菌株檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大腸桿菌ST131系是近年來在腸外致病性大腸桿菌中興起的一個(gè)主要譜系，該類菌株常伴隨著多耐藥性狀的出現(xiàn)，其常攜帶編碼超光譜β-內(nèi)酰胺酶、產(chǎn)KPC-2碳青霉烯類等的耐藥基因，對于多耐藥菌株在世界范圍內(nèi)擴(kuò)散和流行具有重要意義(Yasufumi Matsumura,Johann D.D.Pitout,Ryota Gomi,et al.Global Escherichia coli Sequence Type 131Clade with blaCTX-M-27Gene[J].Emerging Infectious Diseases,2016,22(11):1900-1907)。國內(nèi)相關(guān)研究也證實(shí)，ST131系大腸桿菌對臨床上常用的13種抗生素的耐藥率比非ST131系大腸桿菌高(董敏,鄭書發(fā),余斐等.尿道致病性大腸埃希菌克隆株毒力和耐藥性的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(7):531-534)。因此，實(shí)現(xiàn)對ST131系大腸桿菌的檢測及監(jiān)控對于預(yù)防和控制多耐藥菌株的出現(xiàn)具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

目前，ST131系大腸桿菌的檢測方法主要借助于Thierry Wirth教授創(chuàng)建的MLST分型法，該方法通過對大腸桿菌的7個(gè)管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)進(jìn)行擴(kuò)增和測序分析，獲得一個(gè)等位基因編號，從而證實(shí)ST131系大腸桿菌的存在(Wirth T,Falush D,Lan R,Colles F,et al.Sex and virulence in Escherichia coli:an evolutionary perspective[J].Mol.Microbiol,2006,60(5),1136-1151)。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)由正向重復(fù)序列(Direct Repeats，DR)和插入其中的間隔序列(spacer)構(gòu)成，最初由Ishino Y等在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)(Ishino Y,Shinagawa H,Makino K,et al.Nucleotide Sequence of the IapGene,Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia Coli,and Identification of the Gene Product[J].Journal of Bacteriology,1987,169(12):5429-5433)。近年來研究表明CRISPR結(jié)構(gòu)存在于45％的細(xì)菌和90％的古生菌中(Bhaya D,Davison M,Barrangou R.CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea:versatile small RNAs for adaptive defense and regulation[J].Annu.Rev.Genet,2011,45:273-297)。目前已證實(shí)大腸桿菌中存在4個(gè)CRISPR位點(diǎn)，分別命名為CRISPR1、CRISPR2、CRSPR3、CRSPR4。CRISPR1位于基因iap與cysH之間，CRISPR2位于ygcE與ygcF之間，CRISPR3位于clpA與tRNA-ser之間，CRISPR4位于tRNA-infA之間，CRISPR1、CRISPR2與其臨近的Cas基因共同構(gòu)成I-E型CRISPR/Cas系統(tǒng)，而CRISPR3、CRISPR4與其臨近的Cas基因構(gòu)成I-F型CRSPR/Cas系統(tǒng)(Yin S,Jensen MA,Bai J,Debroy C，et al.The evolutionary divergence of Shiga toxin-producing Escherichia coli is reflected in clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)spacer composition[J].Appl.Environ.Microbiol.,2013,79:5710-5720)。在大腸桿菌的CRISPR結(jié)構(gòu)中，正向重復(fù)序列是高度保守的，CRISPR1與CRISPR2的重復(fù)序列高度一致，CRISPR3與CRISPR4的重復(fù)序列高度一致，但是間隔序列高度多變，即使在同一株大腸桿菌的同一個(gè)CRISPR位點(diǎn)中也是高度變異的(Díez-C,Almendros C,García-Martínez J,et al.Diversity of CRISPR loci in Escherichia coli[J].Microbiology,2010,156(5):1351-1361)。由此可見，間隔序列的高度可變性為區(qū)分不同類型的大腸桿菌提供了可能。比如公布號CN105112519A的發(fā)明專利公開的一種基于CRISPR的大腸桿菌O157:H7菌株檢測引物(如SEQ ID NO.1～2所示)，針對CRISPR1位點(diǎn)基因序列(包括4條重復(fù)序列和3條獨(dú)特的間隔序列)設(shè)計(jì)合成，PCR擴(kuò)增后測序分析，如能檢測出CRISPR1中3條獨(dú)特的間隔序列(如SEQ ID NO.5～7所示)即可判定細(xì)菌陽性，操作簡單，敏感性、特異性高，與大腸桿菌O157:H7血清分型結(jié)果相一致。因此，開發(fā)出一種基于CRSIRP的菌株檢測技術(shù)將為大腸桿菌ST131系檢測提供極大的便利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于CRISPR的大腸桿菌ST131系菌株檢測引物。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種包含上述引物的檢測試劑盒。

最后，本發(fā)明再提供一種基于CRISPR的大腸桿菌ST131系菌株檢測方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

大腸桿菌ST131系菌株檢測引物，根據(jù)CRISPR3位點(diǎn)基因序列或者與該序列同源性達(dá)95％以上的同源序列設(shè)計(jì)合成，引物如下所示：

上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y為C或T；

下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。

大腸桿菌ST131系菌株檢測試劑盒，包含以下引物：

上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y為C或T；

下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。

所述試劑盒還可以包括：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)、滅菌超純水、陽性對照(大腸桿菌ST131系菌株基因組DNA或甘油保存菌液)、10×PCR菌落增強(qiáng)劑以及DNA Marker DL 2000等。

大腸桿菌ST131系菌株檢測方法，包括以下步驟：

1)以待測樣本基因組DNA或單菌落為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析與陽性對照有相同條帶的判定為疑似陽性；

2)回收疑似陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序分析，檢測出SEQ ID NO.4所示序列的判定為細(xì)菌陽性；

步驟1)中引物如下所示：

上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y為C或T；

下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。

步驟1)中待測樣本基因組DNA可采用煮沸法或者利用DNA提取試劑盒制得。

步驟1)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/mL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，5～10ng/μL待測樣本基因組DNA 2μL，滅菌超純水8.5μL，總計(jì)25μL。

或者，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/mL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，單菌落，1×PCR菌落增強(qiáng)劑2.5μL，滅菌超純水補(bǔ)足至25μL。

步驟1)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min。

步驟1)中陽性對照為大腸桿菌ST131系菌株。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過對GenBank數(shù)據(jù)庫中大腸桿菌ST131系全基因組測序結(jié)果進(jìn)行分析及對實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌ST131系菌株檢測發(fā)現(xiàn)，其具有CRISPR3位點(diǎn)，且CRISPR3中存在一段SEQ ID NO.4所示的獨(dú)特序列。針對CRISPR3位點(diǎn)基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳分析，與陽性對照有相同條帶的判定為疑似陽性，回收疑似陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序分析，檢測出SEQ ID NO.4所示序列的判定為大腸桿菌ST131系菌株陽性。該檢測方法操作簡單，靈敏度高，特異性好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。試驗(yàn)證實(shí)，該方法與大腸桿菌ST131系菌株MLST分型結(jié)果相一致，但比MLST法省時(shí)、省力，檢測費(fèi)用低。

附圖說明

圖1為試驗(yàn)例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例1

大腸桿菌ST131系菌株檢測引物，根據(jù)CRISPR3位點(diǎn)基因序列或者與該序列同源性達(dá)95％以上的同源序列設(shè)計(jì)合成，引物如下所示：

上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y為C或T；

下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。

實(shí)施例2

大腸桿菌ST131系菌株檢測試劑盒，包含：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)20mL，滅菌超純水30mL，陽性對照(甘油保存菌液：甘油500μL，大腸桿菌菌液800μL)1.5mL，8μmol/L上、下游引物各1μL，DNA Marker 2000及試劑盒說明書一份。引物如下所示：

上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y為C或T；

下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。

檢測原理：試劑盒中含有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需的各種試劑組分，如引物、dNTPs、緩沖液、Taq酶等，在PCR反應(yīng)液中加入檢測樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析出現(xiàn)與陽性對照相同條帶的判定為疑似陽性，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序分析，檢測出SEQ ID NO.4所示序列的判定為大腸桿菌ST131系細(xì)菌陽性?？捎糜讷@知各種待檢測樣本(如糞便、食物等)中大腸桿菌ST131系菌株的污染狀況。

操作說明：

1)提取待檢測樣本的基因組DNA或者挑取單菌落；

2)利用上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，配制如下反應(yīng)體系：

2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，待測樣本基因組DNA 2μL，滅菌超純水8.5μL，總計(jì)25μL；

或者，2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，單菌落，1×PCR菌落增強(qiáng)劑(市售商品，主要成分為甜菜堿，為10倍濃度，使用時(shí)需稀釋為1倍濃度)2.5μL，補(bǔ)加滅菌超純水至25μL；

設(shè)置反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min；

3)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析，分析條件：2.0％瓊脂糖凝膠，電壓5V/cm，時(shí)間20min；在紫外燈下觀察結(jié)果，若出現(xiàn)與陽性對照相同的條帶即判定為疑似陽性，陰性對照不出現(xiàn)特異性條帶或者條帶不一致；

4)回收疑似陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序分析，檢測出SEQ ID NO.4所示序列的判定為大腸桿菌ST131系細(xì)菌陽性。

實(shí)施例3

大腸桿菌ST131系菌株檢測方法，包括以下步驟：

1)樣本的收集和預(yù)處理

將500μL待檢測樣本(糞便)加入到10mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃增菌5h，臺(tái)式高速離心機(jī)12000rpm/min離心5分鐘，棄上清，沉淀用作檢測模板；

2)PCR擴(kuò)增

利用上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物如下所示：

上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y為C或T，

下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'；

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，單菌落(從增菌沉淀中挑取)，1×PCR菌落增強(qiáng)劑2.5μL，補(bǔ)加滅菌超純水至25μL；

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min；

3)檢測結(jié)果

取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于20g/L瓊脂糖凝膠中電泳，用DNA Marker 2000作分子量標(biāo)記，設(shè)置電壓5V/cm，電泳20min后，在紫外燈下觀察結(jié)果，出現(xiàn)與陽性對照相同的條帶，判定為疑似陽性；

凝膠回收疑似陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示與SEQ ID NO.4所示序列，判定樣本受到大腸桿菌ST131系菌株污染。

對比例1

根據(jù)國際上公認(rèn)的大腸桿菌ST131系菌株標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，通過7對管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)的擴(kuò)增識別ST131系菌株。

檢測方法為：依據(jù)http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_html公布的大腸桿菌MLST分型的7對管家基因合成相應(yīng)的引物，擴(kuò)增相應(yīng)的管家基因并進(jìn)行測序，將序列提交至http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli，獲得相應(yīng)的等位基因編號，從而獲得菌株的MLST分型結(jié)果。

以adk基因?yàn)槔?，步驟如下：

1)合成引物，

依據(jù)http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_html公布的大腸桿菌MLST分型信息合成adk管家基因的擴(kuò)增引物，引物序列如下所示：

上游引物：5'-ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG-3'，

下游引物：5'-CCGTCAACTTTCGCGTATTT-3'。

預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為536bp，引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

2)PCR擴(kuò)增

參照PCR反應(yīng)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)產(chǎn)品說明，配制25μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，實(shí)施例3中待測樣本基因組DNA 2μL，加滅菌超純水至25μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min；95℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min。

3)測序鑒定

凝膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交至http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli，獲得相應(yīng)的等位基因編號，依上述方法分別獲得其它6個(gè)基因的等位基因編號，并獲得其等位基因編號，最終獲得一個(gè)MLST分型編號。

4)檢測結(jié)果

將7對管家基因的測序結(jié)果提交至MLST分型數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示為ST131系菌株，判斷樣本受到ST131系菌株的感染。

試驗(yàn)例

一、試驗(yàn)中使用的細(xì)菌菌株

大腸桿菌菌株于2014年分離于河南睢縣，編號分別為2014011。

GeneBank中Escherichia coli ST131系菌株：Escherichia coli SE15，Escherichia coli NA114，Escherichia coli O25b:H4-ST131，Escherichia coli JJ1886，Escherichia coli MNCRE44，Escherichia coli CD306，Escherichia coli JJ2434，Escherichia coli JJ1897，Escherichia coli SaT040，Escherichia coli G749，Escherichia coli MVAST0167，Escherichia coli ZH193，Escherichia coli ZH063，Escherichia coli JJ1887，Escherichia coli strain Ecol_732，Escherichia coli strain Ecol_743，Escherichia coli strain Ecol_745，Escherichia coli strain Ecol_448。

二、試驗(yàn)中使用的試劑及儀器

(1)LB培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：稱取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化鈉，溶于100mL蒸餾水中，用10mol/L NaOH調(diào)pH值至7.2，121℃高壓滅菌20min，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LB固體培養(yǎng)基：稱取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化鈉、1.5g瓊脂粉，溶于100mL蒸餾水中，用10mol/L NaOH調(diào)pH值至7.2，121℃高壓滅菌20min，冷卻至約50℃時(shí)傾注平板，保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)PCR反應(yīng)試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，瓊脂糖為BIOWEST公司進(jìn)口分裝，酵母浸粉、胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，瓊脂粉購自Sigma公司，其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。

PTC-100型基因體外擴(kuò)增儀購自MJRESEARCH公司，DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀購自北京六一儀器廠，Gene snap圖像掃描儀購自美國Syngene公司。

未作特別說明的試驗(yàn)材料和方法均為公知技術(shù)，可在常用工具書包括《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克、D.W拉塞爾著，第三版，科學(xué)出版社，2002)等中查找。

三、大腸桿菌2014011的CRISPR3位點(diǎn)檢測

(1)DNA模板的制備

采用煮沸法從大腸桿菌菌液中提取全基因組DNA，具體操作為：從-80℃冰箱內(nèi)取出大腸桿菌2014011凍存保種管，置于4℃冰箱復(fù)溫5小時(shí)(4～6小時(shí)均可)，超凈臺(tái)中用無菌接種環(huán)快速取菌液，以分段劃線法轉(zhuǎn)種于LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫箱孵育21小時(shí)(18～24小時(shí)均可)，挑取LB瓊脂平板上單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)7小時(shí)(6～8小時(shí)均可)，取1mL菌液于1.5mL Eppdorf管中，14000r/min轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，棄上清，加入超純水100μL，震蕩混勻，煮沸10min，14000r/min轉(zhuǎn)速下再次離心10分鐘，取上清，即得大腸桿菌2014011基因組DNA，置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

(2)PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)大腸桿菌ST131系菌株的CRISPR3位點(diǎn)基因序列或者與該序列同源性達(dá)95％以上的同源序列設(shè)計(jì)引物，如下所示：

上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y為C或T，

下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'；

預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為700bp左右，引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

(3)PCR擴(kuò)增

參照PCR反應(yīng)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)產(chǎn)品說明，配制25μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反應(yīng)緩沖液，0.4mM dNTP，4mM MgSO₄)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，基因組DNA模板2μL，加滅菌超純水至25μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min。

(4)PCR產(chǎn)物分析

取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于20g/L瓊脂糖凝膠中電泳，用DNA Marker DL2000作分子量標(biāo)記，電壓5V/cm，電泳20min后，用凝膠圖像掃描儀進(jìn)行分析，電泳結(jié)果見圖1(圖中M為DNA Marker，1為大腸桿菌2014011擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果)。

從圖1可以看出，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度與預(yù)期長度符合，證實(shí)PCR擴(kuò)增CRISPR3基因成功。

(5)測序鑒定

回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO.3所示。將測序得到的基因序列與Gene bank上Escherichia coli SE15公布的CRIAPR3位點(diǎn)基因序列(GenBank：NC_013654.1)進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示二者99％相同。

(6)測序分析

對測序結(jié)果中CRISPR3位點(diǎn)基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在大腸桿菌ST131系的CRISPR3位點(diǎn)可以檢測到1條獨(dú)特的序列，如SEQ ID NO.4所示。將該序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與Escherichia coli SE15的第894816～894895位堿基完全匹配。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 鄭州大學(xué)、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院

<120> 一種基于CRISPR的大腸桿菌ST131系菌株檢測引物、試劑盒及檢測方法

<170> PatentIn version 3.5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 上游引物（Y為C或T）

<222> (1)..(21)

<400> 1

TTGTYAGGTA GGTTGGTGAA G 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 下游引物

<222> (1)..(20)

<400> 2

GCGAAGAGAA AGAACGAGTA 20

<211> 654

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增序列

<221> 大腸桿菌2014011的CRISPR3位點(diǎn)基因序列

<222> (1)..(654)

<400> 3

GGTAGGTTGG TGAAGTCCGT AATCTCGTCA GGGGTTACGG ACTTTTTATT TATGGGGGGA 60

GGAGGTTCAG ACCCTTTTTT TGATGATGAT GGTAAGTTAT TGATAATTAG TGCTGCGGGT 120

AGGTAAGGAT AAAAAAGGGT GGCAGCAGGA GATTGAGATG GTTTTGCTTT ATTAACAACG 180

GGCTAAACGT GTAGTATTTG AGTTCACTGC CGTACAGGCA GCTTAGAAAT TGCCGCGGAT 240

CCTGTCTGCC AATAATGACA AGTTCACTGC CGTACAGGCA GATAAAATGC GAAAAAAAAG 300

CCCGTACTTT CGTACGAGCT CTTCTTTAAA TATGGCGGTG AGGGGGGGAT TCGAACCCCC 360

GATACGTTGC CGTATACACA CTTTCCAGGC GTGCTCCTTC AGCCACTCGG ACACCTCACC 420

AAATTGTTTT TTTGCCTGAC CTCATGGGGG GCAACGGGGC GCTACTATAG GGAGTTGGAA 480

TAAAACGGTC AAGAAGAATT TTTATGATAA TTATTGTTTG CTCATACTGT AAACAAGTTG 540

TGCAGTATAT CTACATCGAG ACAAGTTACG GACTTATACT TCTAAAGTAC TCCATACATA 600

TCACAAAATA AAAAGGCCGG CTAAACCGAC CTTTTACTCG TTCTTTCTCT TCGC 654

<211> 80

<212> DNA

<213> 序列

<221> CRISPR3中獨(dú)特序列

<222> (1)..(80)

<400> 4

GTTCACTGCC GTACAGGCAG CTTAGAAATT GCCGCGGATC CTGTCTGCCA ATAATGACAA 60

GTTCACTGCC GTACAGGCAG 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> adk管家基因擴(kuò)增的上游引物

<222> (1)..(20)

<400> 5

ATTCTGCTTG GCGCTCCGGG 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> adk管家基因擴(kuò)增的下游引物

<222> (1)..(20)

<400> 6

CCGTCAACTT TCGCGTATTT 20