專利名稱：為預(yù)防和治療癌癥對(duì)癌細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度的藥理學(xué)調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及癌細(xì)胞中端粒延 長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。更具體地，本發(fā)明涉及無(wú)環(huán)(acyclic)核苷類似物在治療 或預(yù)防癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
前導(dǎo)和后隨DNA鏈合成中的不對(duì)稱造成了線性基因組復(fù)制的 "終止問(wèn)題"1。為了克服這個(gè)問(wèn)題，真核生物染色體具有特化的末端 結(jié)構(gòu)，即由TTAGGG重復(fù)序列組成的端粒2。端粒酶"是延長(zhǎng)端粒 并因此在細(xì)胞倍增期間保持大多數(shù)癌細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性的核糖核 蛋白酶5。細(xì)胞倍增期間DNA從端粒末端的逐漸損失涉及體細(xì)胞中 細(xì)胞增殖潛力的控制6。
培養(yǎng)的正常人類細(xì)胞在培養(yǎng)中具有有限的復(fù)制潛力。培養(yǎng)中的正 常細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，直到它們達(dá)到群體生長(zhǎng)停止時(shí)的離散點(diǎn)。這被稱 為死亡期l (Ml期)，是由于少數(shù)端?？s短到導(dǎo)致被稱為細(xì)胞老化 的生長(zhǎng)停滯的大小而引起的。能夠通過(guò)消除p53和pRB人肺瘤抑制 基因的功能而繞過(guò)這個(gè)階段。之后該細(xì)胞可繼續(xù)增殖而端粒長(zhǎng)度進(jìn) 一步變短，直到另一個(gè)被稱為死亡期2(M2期)或轉(zhuǎn)折期的限制點(diǎn)。 M2期的生長(zhǎng)停滯是由細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡速率之間的平衡引起的。 在這個(gè)階段，當(dāng)大多數(shù)端粒非常短的時(shí)候，末端與末端的融合和染 色體斷裂-融合引起顯著的染色體異常和細(xì)胞凋亡。在極少的情況下，細(xì)胞能夠脫離M2并通過(guò)穩(wěn)定其端粒的長(zhǎng)度而變?yōu)闊o(wú)限增殖的。 這是通過(guò)端粒酶活化或替代性端粒延長(zhǎng)機(jī)制(即替代的端粒延長(zhǎng)或
ALT)而發(fā)生的7'8。
人類種系9和多數(shù)癌細(xì)胞3表達(dá)端粒酶。端粒酶對(duì)已縮短的端粒 的延長(zhǎng)是人類癌細(xì)胞中端粒維持的主要機(jī)制。對(duì)端粒酶的抑制通過(guò) 縮短端粒的長(zhǎng)度而限制人類端粒酶陽(yáng)性癌細(xì)胞的生長(zhǎng)"。
已經(jīng)嘗試?yán)煤塑疹愃莆?例如AZT)干擾人端粒酶活性以達(dá) 到治療癌癥的目的。然而現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的施用核苷類似物改變端 粒酶活性的方法不能令人滿意，或者不適合臨床情況，因?yàn)樗鼈兊?臨床應(yīng)用受到低治療比(即毒性劑量與有效劑量之比)的限制。
此外，由于細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)的增殖能力是由于端粒酶介導(dǎo)的 端粒延長(zhǎng)機(jī)制和/或ALT機(jī)制的激活，用于控制細(xì)胞增殖的理想的核 苷類似物是對(duì)于這兩種機(jī)制都有效并且對(duì)正常細(xì)胞和組織毒性最小 或沒(méi)有毒性的那些核苷類似物。因此，需要鑒定可以抑制增殖的細(xì) 胞例如通過(guò)端粒酶和/或ALT機(jī)制維持其端粒的癌細(xì)胞的治療性核 苷類似物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供涉及使用抗病毒核苷類似物調(diào)節(jié)、抑制或阻止細(xì)胞中 端粒延長(zhǎng)的方法和組合物，而無(wú)論端粒延長(zhǎng)機(jī)制如何(端粒酶或AL丁 機(jī)制)。本發(fā)明還公開(kāi)了使用特定核苷類似物預(yù)防和/或治療增生性 疾病和所有類型的癌癥的方法。更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了在對(duì)相應(yīng) 的正常體細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性的水平上可以干擾增殖的細(xì)胞、包括癌 細(xì)胞(例如人類癌細(xì)胞)中的端粒酶活性和L-l ( LINE-1 )逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn) 座子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶(L1RT)活性的無(wú)環(huán)核苷類似物。本發(fā)明公開(kāi) 了如何^^用無(wú)環(huán)核苷類似物作為抗腫瘤劑或抗癌劑。在本發(fā)明的一 個(gè)方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用更昔洛韋、阿昔洛韋和/或噴昔洛韋處理端粒酶 陽(yáng)性或端粒酶陰性細(xì)胞(但是具有L1RT活性)誘導(dǎo)了進(jìn)行性的端粒 損失、G2期停滯、染色體異常和最終的細(xì)胞死亡。此外，這些抗腫
7瘤核苷類似物對(duì)端粒酶或L1RT具有驚人的效果，因?yàn)槠渑R床上可接
受的水平足以在增殖的細(xì)胞中控制端粒酶活性并且誘導(dǎo)細(xì)胞死亡， 由此允許治療或預(yù)防所有類型的癌癥。
當(dāng)前，在應(yīng)用中還沒(méi)有基于無(wú)環(huán)的、抗端粒酶、抗L1RT和抗腫 瘤核苷類似物的治療性組合物。申請(qǐng)人第 一次披露了使用無(wú)環(huán)核香 類似物(在本文中也被稱為端粒延長(zhǎng)的抑制劑或拮抗劑)在體內(nèi)抑 制端粒延長(zhǎng)在治療上是有益的。而且，在本發(fā)明之前，本領(lǐng)域技術(shù) 人員沒(méi)有認(rèn)識(shí)到可以預(yù)測(cè)這種處理具有治療用途。
由于端粒酶參與控制細(xì)胞周期、細(xì)胞復(fù)制和老化，因此本發(fā)明的 含有核普類似物的組合物可以阻止或控制不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)和肺 瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖性。本發(fā)明的組合物尤其可用于治療細(xì)胞增殖性 疾病，特別是以端粒酶或L1RT維持或延長(zhǎng)端粒為特征的人類腫瘤。
因此， 一方面，本發(fā)明提供了一種治療與端粒酶或L1RT維持或 延長(zhǎng)端粒有關(guān)的、特別是與細(xì)胞中端粒酶或L1RT活性水平升高有關(guān) 的疾病的方法。該方法包括給所述細(xì)胞或需要治療的哺乳動(dòng)物施用 一種組合物，該組合物含有治療有效量的至少一種為無(wú)環(huán)、抗端粒 酶、抗L1RT和抗腫瘤劑的核苷類似物。細(xì)胞中的端粒酶活性或L1RT 活性水平可以如以下文獻(xiàn)中所述測(cè)定，例如本申請(qǐng)人于2005年3 月25日 <提交的名稱為"Modulation Of Telomere Length In Telomerase Positive Cells For Cancer Therapy，，的美國(guó)專利申請(qǐng)60/655,105，以及 于2005年1月18日才是交的名稱為"Modulation Of Line-1 Reverse Transcriptase'^國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US05/001319,該專利申請(qǐng)引入本 文作為參考。細(xì)胞中的端粒酶活性或L1RT活性水平也可以通過(guò)任意 其他現(xiàn)有的方法或等同的方法測(cè)定。端粒酶活性或L1RT活性的"升 高的水平，，是指特定細(xì)胞中端粒酶活性或LIRT活性的絕對(duì)水平比受 試者或個(gè)體的正常細(xì)胞升高，或者比未患該疾病的其他受試者或個(gè) 體的正常細(xì)胞升高。這些疾病的例子包括癌性疾病，或與正常情況
有GCV或ACV或它們的前藥。這些組合物(直接抑制端粒酶活性或L1RT活性，或者間接整合到端粒中從而阻止端粒進(jìn)一 步延長(zhǎng))的 應(yīng)用將在端粒酶具有活性的腫瘤中導(dǎo)致進(jìn)行性的端?？s短。 一旦端
粒長(zhǎng)度縮短到臨界長(zhǎng)度，腫瘤就進(jìn)入轉(zhuǎn)折期并最終死亡。這些抑制 劑對(duì)正常體細(xì)胞沒(méi)有影響或者只有極小的影響，因?yàn)檎＜?xì)胞中的 端粒酶活性和/或L1RT活性通常較低或者檢測(cè)不到。
干擾端粒的延長(zhǎng)或維持可能直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡或者可能加強(qiáng)最 終通過(guò)凋亡殺死細(xì)胞的化療劑的作用。特別地，本發(fā)明提供一種通
續(xù)增長(zhǎng)潛力的端粒酶/LlRT表達(dá)細(xì)胞增殖的方法。核苷類似物的施 用可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何期望的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種預(yù)防以需要該預(yù)防的哺乳 動(dòng)物或受試者(例如人)的細(xì)胞表達(dá)端粒酶或L1RT為特征的癌癥的 方法。該預(yù)防方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的組合物。 該組合物含有本發(fā)明的端粒酶抑制劑或拮抗劑。該抑制劑或拮抗劑 阻斷端粒酶陽(yáng)性/端粒酶陰性細(xì)胞中端粒的延長(zhǎng)，由此抑制端粒酶表
達(dá)細(xì)胞的增殖。該抑制劑是無(wú)環(huán)核苷類似物或這種類似物的藥學(xué)上 可接受的鹽或富含該抑制劑或拮抗劑的液體或固體食品材料。該食 品可以是，例如，黃油、人造黃油、餅干、面包、蛋糕、蜜餞、糖 果、酸奶酪或其他發(fā)酵乳制品、或適于人類消費(fèi)的谷類食品形式的 功能性食物?；蛘呖梢允菭I(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、營(yíng)養(yǎng)物、藥品、食品、營(yíng)養(yǎng) 品、健康食品和/或特制食品。定時(shí)檢測(cè)人體中端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞的存 在。 一旦在哺乳動(dòng)物中不再檢測(cè)到端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞，即可停止使用 抑制劑或拮抗劑。
除了治療方面以外，本發(fā)明還提供用于檢測(cè)病理性增殖的表達(dá)端 粒酶或L1RT的細(xì)胞的診斷方法和試劑盒。本發(fā)明的這些和其他實(shí)施 方案將會(huì)在下文更詳細(xì)地描述。


圖1表示流動(dòng)-FISH數(shù)據(jù)，顯示HeLa細(xì)胞在處理IO天后的端粒
9長(zhǎng)度縮短、大規(guī)模凋亡和細(xì)胞周期變化(點(diǎn)圖一左圖，直方圖一右
圖)。數(shù)據(jù)007 -未處理；數(shù)據(jù)008 -用3 juM ACV處理；數(shù)據(jù)009 —用1.5 pM GCV處理；數(shù)據(jù)OIO —用1.5 PCV處理。FL1 — PNA-FITC， FL3 - PI。
圖2表示流動(dòng)-FISH數(shù)據(jù)，顯示U-2 OS細(xì)胞在處理IO天后的端 粒長(zhǎng)度縮短、大規(guī)模凋亡和細(xì)胞周期變化(點(diǎn)圖一左圖，直方圖一 右圖)。數(shù)據(jù)001 -未處理；數(shù)據(jù)002 -用3 ACV處理；數(shù)據(jù) 003 —用1.5 pMGCV處理；數(shù)據(jù)004—用1.5 ^MPCV處理。FL1 -PNA-FITC，F(xiàn)L3-PI。
圖3表示流動(dòng)-FISH數(shù)據(jù)，顯示U-2 OS細(xì)胞在處理14天后的端 粒長(zhǎng)度縮短、大規(guī)模凋亡和細(xì)胞周期變化(點(diǎn)圖一左圖，直方圖一 右圖)。數(shù)據(jù)001 -未處理；數(shù)據(jù)002 -用3 pM ACV處理；數(shù)據(jù) 003 —用1.5fiMGCV處理；數(shù)據(jù)004 -用1.5 PCV處理。FL1— PNA-FITC, FL3-PI。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供涉及使用能夠千擾細(xì)胞中端粒延長(zhǎng)的核苷類似物的 組合物和方法。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些核苷類似物在臨床上可接受 的水平時(shí)可以影響細(xì)胞中的端粒、端粒酶和L1RT功能。特別地，在
本發(fā)明的上下文中，"核苷類似物，，是與天然存在的核苷在結(jié)構(gòu)上 相似的化合物，但是僅限于無(wú)環(huán)的那些類似物。本發(fā)明中涉及的無(wú) 環(huán)核苷類似物具有嘌呤(或嘧啶)骨架，該骨架具有一個(gè)尾部分(例 如鳥(niǎo)噪呤中存在的9-(l,3-二羥基-2-丙氧曱基))，但是缺乏羥環(huán)(戊
更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥，即，分別為伐昔洛韋、纈更昔 洛韋、泛昔洛韋。阿昔洛韋12通過(guò)模擬細(xì)胞DNA組分鳥(niǎo)嘌呤起作用。 鳥(niǎo)。票呤即DNA的AT-GC中的"G"。阿昔洛韋(9-[2(羥甲氧基)-曱基]烏嘌呤)盡管在結(jié)構(gòu)上類似于"G，，，但是它的尾部一羥"環(huán)" (戊糖)缺失，因此為"無(wú)環(huán)的，，。更昔洛韋13'14'15和噴昔洛韋16'17也是"無(wú)環(huán)的"，因?yàn)樗鼈円踩鄙倭u環(huán)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明的無(wú)環(huán)核苷類似物的尾部具有至少一個(gè)羥基，該羥基模 擬核苷的2，-脫氧核糖部分的3，-和5，-羥基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的無(wú)環(huán) 核苷類似物表現(xiàn)出抗端粒酶和抗腫瘤性質(zhì)，其毒性程度在臨床上可 以接受。無(wú)環(huán)核苷類似物阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的 前藥，即伐昔洛韋、纈更昔洛韋、泛昔洛韋，均被批準(zhǔn)作為抗病毒 藥臨床應(yīng)用。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和對(duì)抗病毒感染的劑量方案是本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的。
盡管阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥是公知的治療
或緩解皰滲病毒或/和CMV感染的藥物，但是它們?cè)谥委熌[瘤疾病 中的應(yīng)用還是未知的。例如，噴昔洛韋用于人的唇部和面部以治療 單純皰滲病毒引起的唇皰滲。本領(lǐng)域中還知道這些核苷類似物的目 標(biāo)酶是DNA聚合酶。
本發(fā)明表明無(wú)環(huán)抗病毒劑也可以針對(duì)端粒酶或L1RT并影響哺 乳動(dòng)物細(xì)胞中的端粒延長(zhǎng)(或損害端粒)。 一般認(rèn)為這些藥物一旦 進(jìn)入增殖的細(xì)胞內(nèi)即被磷酸化(例如二磷酸鹽和三磷酸鹽形式)， 并且與端粒酶反應(yīng)的天然底物(例如dGTP)竟?fàn)?。磷酸化類似物?br> 以摻入到DNA中，由此干擾端粒酶或L1RT介導(dǎo)的聚合活性，最終 導(dǎo)致鏈延長(zhǎng)的終止。實(shí)質(zhì)上，這些核苷類似物通過(guò)鏈延長(zhǎng)的終止損 害端粒DNA、縮短端粒并且導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。對(duì)端粒的損害對(duì)于快速 生長(zhǎng)的(例如腫瘤)細(xì)胞比對(duì)于正常細(xì)胞更加有害。
已經(jīng)報(bào)道了抗HIV和抗皰瘆核苷類似物只有在從核苷磷酸化為 核苷酸的階段之后才具有活性。因此，磷酸化看來(lái)是核苷類似物針 對(duì)其耙標(biāo)的活性的關(guān)鍵因素。在這點(diǎn)上，曾經(jīng)報(bào)道了AZT需要三次 連續(xù)的磷酸化才具有針對(duì)端粒酶的活性。
本發(fā)明的無(wú)環(huán)核苷類似物是比現(xiàn)有技術(shù)中已知的抗端粒酶核苷 類似物如AZT更強(qiáng)并且選擇性更高的端粒延長(zhǎng)抑制劑；與諸如AZT 的核苷類似物相比，其臨床上可接受的劑量18'19，2()，21'22足以實(shí)現(xiàn)端粒
ii長(zhǎng)度的縮短和細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。
盡管沒(méi)有提到通過(guò)本發(fā)明可能實(shí)現(xiàn)有利的應(yīng)用，但是以前為了治
療CMV(巨細(xì)胞病毒)感染而給AIDS或其他免疫缺陷患者施用(例 如)GCV意味著GCV可以容易地給癌癥患者施用。
進(jìn)一步地，目前大量無(wú)環(huán)核苷類似物對(duì)于HSV和CMV患者的 應(yīng)用，以及這些類似物以明顯較低劑量使用的能力，應(yīng)當(dāng)加快管理 部門(mén)批準(zhǔn)阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥(即伐昔洛 韋、纈更昔洛韋和泛昔洛韋)用于治療端粒酶和/或L1RT誘導(dǎo)的和/ 或介導(dǎo)的癌癥。
本發(fā)明還包括各種動(dòng)物模型的使用。通過(guò)開(kāi)發(fā)或分離表達(dá)端粒酶 的細(xì)胞系，可以在各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中產(chǎn)生疾病模型。這些模型可以采 用皮下、原位(orthotopic)或全身施用細(xì)胞，以模擬各種疾病狀態(tài)。例 如，可以將HeLa細(xì)胞系皮下注射進(jìn)棵鼠體內(nèi)以獲得端粒酶陽(yáng)性腫 瘤。產(chǎn)生的腫瘤在端粒重復(fù)擴(kuò)增法(TRAP)試驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)顯示端粒酶 活性。這樣的動(dòng)物模型也提供了分別以及組合檢測(cè)核苷類似物的有 用工具。
在體內(nèi)確定一種化合物的有效性涉及多種標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于存 活率、腫瘤消退、腫瘤進(jìn)展的停滯或減緩、腫瘤消失以及轉(zhuǎn)移的抑 制或阻止。
用試驗(yàn)化合物處理動(dòng)物包括給動(dòng)物施用適當(dāng)形式的化合物或組 合物。本發(fā)明的藥物組合物、抑制劑或拮抗劑可以通過(guò)多種途徑施 用，包括但不限于口服、非腸胃、經(jīng)鼻、口腔、直腸、陰道或局部 途徑。此外，也可通過(guò)氣管內(nèi)滴注、支氣管滴注、皮內(nèi)、皮下、肌 肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行施用。特別預(yù)期的是全身性靜脈內(nèi) 注射、通過(guò)血液或淋巴供應(yīng)的局部給藥和腫瘤內(nèi)注射。
本發(fā)明的組合物在許多方面是重要的。它們?cè)诙肆Ｃ?L1RT相關(guān)
癌癥的治療方案中至關(guān)重要，無(wú)論在癌癥治療中是單獨(dú)給藥還是與 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化療和/或放療方案聯(lián)合。另外，這些組合物 僅僅通過(guò)降低端粒酶或L1RT活性就將有助于選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞的大規(guī)模凋亡。
核苷類似物可以在生理學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體中施用于宿主 以治療增生性疾病等。藥學(xué)上可接受的載體部分取決于所施用的特 定組合物以及用于施用該組合物的特定方法。
在本發(fā)明的 一 個(gè)方面，提供了預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中由于存在不 適當(dāng)?shù)鼗虿±硇栽鲋车募?xì)胞或無(wú)限增殖細(xì)胞而引起的疾病的方法。 這些不適當(dāng)?shù)鼗虿±硇栽鲋车募?xì)胞或無(wú)限增殖細(xì)胞獨(dú)立于細(xì)胞的正 常調(diào)控機(jī)制而存在并且復(fù)制。這些細(xì)胞是病理性的，因?yàn)樗鼈冇捎?細(xì)胞元件即端粒酶的活性而不同于正常細(xì)胞。當(dāng)然，本文所使用的 不適當(dāng)?shù)卦鲋车募?xì)胞可能是良性的高度增殖細(xì)胞，但是除非另外說(shuō) 明，否則這些細(xì)胞是指所有類型的惡性高度增殖細(xì)胞如癌細(xì)胞，包 括，例如，骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌和黑素 瘤。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本文涉及的癌癥范圍內(nèi)不包括移 植后淋巴增生性疾病(PTLD)，它是一種血液癌癥。
特別地，提供了預(yù)防或治療以表達(dá)端粒酶或L1RT為特征的人類 腫瘤的方法。根據(jù)本發(fā)明，疾病的預(yù)防和治療是通過(guò)使用本發(fā)明的 無(wú)環(huán)核苷類似物(端粒酶或L1RT的抑制劑或拮抗劑)而獲得的。本
互作用從而抑制其活性的那些無(wú)環(huán)核苷類似物，和/或摻入到端粒中 并由此阻止端粒進(jìn)一步延長(zhǎng)(盡管存在功能性端粒酶或L1RT)、由 此抑制表達(dá)端粒酶或L1RT的細(xì)胞生長(zhǎng)的那些無(wú)環(huán)核苷類似物。因 此，端粒酶或L1RT的抑制劑或拮抗劑可用于抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。例如， 當(dāng)給患者施用端粒酶或L1RT的抑制劑或拮抗劑時(shí)，引起細(xì)胞中的進(jìn) 行性端粒縮短、細(xì)胞周期停滯、和/或表達(dá)端粒酶的細(xì)胞的大規(guī)模凋 亡。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"抑制生長(zhǎng)，，或"生長(zhǎng)的抑制"也可以指減少或阻 止細(xì)胞分裂。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)端粒酶和/或L1RT的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑 制可以是大約100%或小于100% ，但不是0%。例如，與對(duì)照細(xì)胞 (對(duì)照細(xì)胞表達(dá)端粒酶但是不用抑制劑或拮抗劑處理)相比，抑制 可以是大約10%至大約100%,優(yōu)選地至少約25%,更優(yōu)選地至少
13約50%，更優(yōu)選地至少大約90%、 95%或正好100%。生長(zhǎng)的抑制 可以用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)才企測(cè)。例如，可以將^皮處理樣品中
的活細(xì)胞數(shù)與對(duì)照樣品中的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，與活體染料一起孵 育后進(jìn)行測(cè)定。另外，生長(zhǎng)抑制也可以通過(guò)能夠在體外或體內(nèi)檢測(cè) 細(xì)胞增殖減少的測(cè)定方法來(lái)檢測(cè)，例如氚化氫摻入試驗(yàn)、BdU摻入 試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)、形成病灶的能力的改變、貼壁依賴性或喪失無(wú)限 增殖能力、喪失肺瘤特異性標(biāo)記、和/或當(dāng)被注射進(jìn)動(dòng)物宿主體內(nèi)時(shí) 不能形成或抑制肺瘤(Dorafshar等人，2003， JSurg Res.， 114 : 179-186; Yang等人，2004， Acta Pharmacol Sin.， 25: 68-75》
瘤可能需要幾個(gè)月至幾年。但是通過(guò)實(shí)施本發(fā)明，可以預(yù)防癌癥， 因?yàn)橛煤幸环N或多種無(wú)環(huán)核苷類似物的組合物處理的致腫瘤細(xì)胞 在有機(jī)會(huì)生長(zhǎng)為腫瘤之前就喪失了增殖潛力。而且，在出現(xiàn)癌癥的 臨床表現(xiàn)之前，給危險(xiǎn)人群定期預(yù)防性施用抑制劑或拮抗劑以終止 腫瘤進(jìn)展可以有效地顯著降低新發(fā)癌癥病例的速度。
核苦化合物可以通過(guò)任何給藥途徑(包括口服)單獨(dú)給藥或者與 不同類似物聯(lián)合給藥。核苷類似物ACV、 GCV或其L-valil酯纈更 昔洛韋(V-GCV)和伐昔洛韋(V-ACV)是優(yōu)選的核苷類似物。它 們都可以購(gòu)買得到，其制劑在大量專利和出版物中已有描述。
具有端粒酶和/或L1RT活性的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)被選擇性地靶向，因?yàn)?這些細(xì)胞依賴于端粒酶和/或L1RT來(lái)延長(zhǎng)或維持端粒，并且端粒的 延長(zhǎng)或維持需要核苦和/或其類似物與端粒酶或L1RT相互作用。為 了發(fā)揮抗癌效果，需要任何特異性靶向劑來(lái)遞送類似物，本文預(yù)期 使用靶向的PCV或ACV或GCV和/或其他類似物。因此，在一些實(shí) 施方案中，藥物組合物可能具有已經(jīng)連接到靶向劑(例如肽)上的 活性化合物，在該情況下為PCV、 ACV和GCV或另一種核苷類似 物，用于特異性地遞送給特定的靶細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)的核部分。
端粒酶和L1RT的特定抑制劑或拮抗劑的劑量可以由本領(lǐng)域才支 術(shù)人員在進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)后確定。在給患者施用之前，其效力可以在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中顯示。在這點(diǎn)上，可以使用本領(lǐng)域公知的任何
端粒酶誘導(dǎo)的癌癥的動(dòng)物模型(Hahn等人，1999, Nature Medicine, 5(10): 1164 - 1170; Yeager等人，1999, Cancer Research, 59(17): 4175-4179)。利
用本發(fā)明方法治療的受試者或患者優(yōu)選地是人，且可以是胎兒、兒 童或成人。可接受治療的其他哺乳動(dòng)物可以是小鼠、大鼠、兔子、 猴子和豬。
抑制劑或拮抗劑可以單獨(dú)施用，或與其他化學(xué)療法聯(lián)合使用。例 如，端粒酶誘導(dǎo)的癌癥的治療可以與化學(xué)和/或放射性療法相結(jié)合， 以治療由端粒酶或其他一些因素誘導(dǎo)的癌癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的化療劑的實(shí)例包括但不限于抗癌藥物，例如博來(lái)霉素、絲裂霉素、 氮芥、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脫氧核苷(5-FUdR)、 氨曱喋呤(MTX)、秋水仙堿和己烯雌酚(DES)。為了進(jìn)行聯(lián)合 治療，以在動(dòng)物或患者體內(nèi)有效導(dǎo)致其組合抗癌作用的方式給動(dòng)物 施用與另一種抗癌劑(化學(xué)或放射)組合的本發(fā)明的抑制劑成分。 因此，應(yīng)以有效導(dǎo)致其在靶細(xì)胞區(qū)域中組合存在的量和時(shí)間提供該 藥劑。為了達(dá)到這個(gè)目的，這些藥劑可以同時(shí)施用，在化療劑的情 況下，以單一組合物施用或作為使用不同給藥途徑的兩種不同的組 合物施用?；蛘?，兩種治療可以先后進(jìn)行，例如間隔幾分鐘到幾小 時(shí)或幾天。例如但不限于，全身使用的GCV的平均每日劑量對(duì)于成 年人可以是每天100mg/kg，對(duì)于小鼠和嬰兒可以是每天50mg/kg。
根據(jù)被治療對(duì)象的狀況可能發(fā)生 一 定的劑量變化。負(fù)責(zé)給藥的內(nèi) 科醫(yī)生將能確定用于患者個(gè)體的合適劑量，并且可能取決于多種因 素，例如，所述患者的年齡、狀況、病史等。
因此，本發(fā)明的方法可以用于與端粒酶誘導(dǎo)的病理性細(xì)胞增殖有 關(guān)的狀況和疾病的治療應(yīng)用?？墒芤嬗诒景l(fā)明的治療應(yīng)用的疾病包 括，以細(xì)胞高度增殖為特征的所有疾病，包括(例如)實(shí)體瘤和白 血病，以及非癌癥狀況。進(jìn)一步預(yù)期本發(fā)明的方法不僅在體內(nèi)環(huán)境 中，而且在離體(ex vivo)條件下，能夠用于抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。括但不限于人類癌細(xì)胞-骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺 皮質(zhì)癌或黑素瘤。
本發(fā)明提供用于鑒定由于細(xì)胞中端粒酶或L1RT表達(dá)而不適當(dāng) 地、病理性或異常增殖的細(xì)胞的方法和試劑盒。該方法可以用作篩
選方法，通過(guò)確定患者組織中端粒酶或L1RT表達(dá)的存在(和/或水
平)幫助診斷患者中癌細(xì)胞或腫瘤的存在，水平升高的端粒酶或
L1RT表達(dá)的存在指示患者中存在癌細(xì)胞或病理性細(xì)胞增殖。
例如，癌性腫瘤樣品可以根據(jù)它們不能在本發(fā)明的無(wú)環(huán)核普類似 物存在下增殖而得到診斷。該診斷可進(jìn)一步包括通過(guò)多種方法^r測(cè) 端粒酶特異性mRNA表達(dá)，這些方法包括但不限于應(yīng)用核酸的雜 交、Northern印跡法、原位雜交、RNA微陣列、RNA保護(hù)分析、 RT-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR,或通過(guò)多種方法測(cè)定端粒酶催化亞單位編 碼的蛋白質(zhì)的存在，該方法包括但不限于Western印跡法、免疫沉 淀或免疫組化、或端粒酶的酶活性(TRAP試驗(yàn)及其改進(jìn)4，26，27)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以利用針對(duì)端粒酶催化亞單位RNA 的核酸探針檢測(cè)經(jīng)歷快速增殖的組織中端粒酶催化亞單位RN A mRNA水平的存在和/或增加，所述組織例如是原發(fā)癌細(xì)胞，包括人 類骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌或黑素瘤。因此， 本發(fā)明提供使用與端粒酶亞序列互補(bǔ)的核酸探針檢測(cè)和確定病理性 增殖的細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)的方法。例如，確定病理性增殖的細(xì)胞 的方法可包括使用針對(duì)hTERT mRNA或L1RT mRNA的核酸探針將 受檢細(xì)胞中hTERTmRNA或LlRTmRNA的表達(dá)水平與對(duì)照細(xì)胞中 hTERT mRNA或L1RT mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較。當(dāng)觀察到如同 對(duì)照細(xì)胞中的hTERT或L1RT表達(dá)水平時(shí)，受檢細(xì)胞就被確定為病 理性增殖細(xì)胞。然而，本發(fā)明的方法中使用的核酸探針也可以基本 上互補(bǔ)于人、小鼠或其他哺乳動(dòng)物的hTERT mRNA或L1RT mRNA 序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在核酸探針中進(jìn)行不影響該探針 有效檢測(cè)病理性增殖細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)中hTERT mRNA或LlRT
16mRNA的能力的取代，因此這樣的取代在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本 發(fā)明方法中使用的核酸探針可以是DNA探針或修飾的探針，例如肽 核酸探針、硫代磷酸探針、或2'-0曱基探針。核酸探針的長(zhǎng)度可以 是大約8個(gè)或10到50個(gè)核苷酸，優(yōu)選地大約15到25個(gè)核苷酸。 本發(fā)明的方法可以很容易地在來(lái)自人、哺乳動(dòng)物或其他脊推動(dòng)物的 細(xì)胞提取物、培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品中進(jìn)行。
本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)由于體外細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物以及人類細(xì) 胞和組織例如實(shí)體瘤和癌(例如人類骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺 癌、腎上腺皮質(zhì)癌、或黑素瘤)中端粒酶表達(dá)而引起的不適當(dāng)?shù)亍?病理性或異常增殖的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供檢測(cè)和/或抑制高度增殖細(xì)胞或癌細(xì)胞的試劑盒。 該試劑盒可含有PCV、 ACV、 GCV、纈更昔洛韋、伐昔洛韋、或其 他無(wú)環(huán)核苷類似物，和/或含有與hTERTmRNA或L1RT mRNA的亞 序列完全互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的核酸探針。
本發(fā)明的藥物組合物、抑制劑或拮抗劑可以通過(guò)多種方式給藥， 包括口服、局部、非腸胃給藥，例如皮下、腹膜內(nèi)、通過(guò)病毒感染、 血管內(nèi)給藥等。根據(jù)導(dǎo)入的方式，化合物可以用多種方式配制。適 用于口服給藥的制劑可以是液體溶液。適用于非腸胃給藥(例如通 過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)、心室內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下 途徑)的制劑包括等滲無(wú)菌注射水溶液和非水溶液。在本發(fā)明的實(shí) 施中，組合物可以(例如)通過(guò)靜脈輸注、口服、局部、非腸胃或 腹膜內(nèi)途徑給藥?？诜头悄c胃給藥是優(yōu)選的給藥方法。配制和給 藥技術(shù)在本領(lǐng)域中是常^L的，進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可見(jiàn)例如Remington's Pharmaceutical Sciences (2000), Gen爾o AR (ed), 20th edition, Maack Publishing Company, Easton， PA。
治療有效量或藥理學(xué)有效量是本領(lǐng)域公認(rèn)的短語(yǔ)，是指產(chǎn)生預(yù)期 藥理學(xué)結(jié)果的有效藥物劑量。例如，治療有效量是足以隨時(shí)間在患 者中產(chǎn)生有益治療反應(yīng)(即，治療疾病或病癥，或緩解患者的所治 療疾病的癥狀)的量。實(shí)際施用的量取決于應(yīng)用治療的個(gè)體，優(yōu)選
17地是獲得所需效果且沒(méi)有明顯副作用的優(yōu)化的量。如下文進(jìn)一 步詳 細(xì)描述的，也可根據(jù)所施用的特定抑制劑或拮抗劑的效力和患者的 狀況以及被治療的患者的體重或表面積來(lái)確定劑量。劑量的大小也 可以根據(jù)對(duì)特定患者施用(例如)特定試劑、載體或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞型所 伴隨的任何不良副作用的存在、特性和程度來(lái)確定。
利用來(lái)自本文公開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和/或來(lái)自利用動(dòng)物模型的體 內(nèi)試驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)，很容易確定能夠防止、抑制或減少端粒酶
/L1RT介導(dǎo)的癌癥發(fā)病率的藥物的治療有效量。也可以利用動(dòng)物模 型來(lái)估計(jì)對(duì)于人體的適當(dāng)劑量范圍和給藥途徑。在換算為臨床環(huán)境 之前，經(jīng)常利用荷有人源實(shí)體瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(或本領(lǐng)域公認(rèn)的動(dòng)物 模型)優(yōu)化適當(dāng)?shù)闹委焺┝俊Ｒ阎@些模型在預(yù)測(cè)有效的抗癌策略 方面是非?？煽康?。例如，荷有實(shí)體瘤的小鼠或本領(lǐng)域公認(rèn)的小鼠 模型被廣泛用于臨床前試驗(yàn)，用于確定產(chǎn)生有益抗腫瘤效果而毒性 最小的治療劑的工作范圍。由于安全性已經(jīng)在本領(lǐng)域公認(rèn)的模型中 得到證實(shí)，至少對(duì)于本文舉例說(shuō)明的核苷類似物來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的臨 床前檢測(cè)主要是常規(guī)實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)有效性可利用測(cè)量腫瘤形成(進(jìn)展) 的抑制、腫瘤消退或轉(zhuǎn)移等的試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)。
以下描述了利用由人HeLa癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的棵鼠皮下(s.c.)腫瘤 (即，攜帶異種移植物的小鼠)作為癌癥模型測(cè)定ACV、 PCV和/ 或GCV的抗腫瘤效力的示例性體內(nèi)試驗(yàn)。
體內(nèi)試驗(yàn)需要的人類癌細(xì)胞例如可如下制備從公共來(lái)源獲得端 粒酶陽(yáng)性HeLa人細(xì)胞系和端粒酶陰性U-2 OS人細(xì)胞系。將細(xì)胞于 37。C和5%(:02的潮濕空氣中保存在補(bǔ)充有10%胎牛血清的D-MEM 培養(yǎng)基中。
對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)，獲得合適的宿主，例如大約5-7周齡的棵鼠 (m//"w)，并且置于不含病原體的環(huán)境中。將包含在200pl無(wú)血清 培養(yǎng)基中的大約lxl(^個(gè)HeLa細(xì)胞(和/或U-2 OS細(xì)胞)通過(guò)脅腹 皮下注射(s.c.)輸送給所有用甲氧氟烷(Metofane)暫時(shí)麻醉的動(dòng) 物。之后將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。使用適當(dāng)濃度的ACV、 PCV和/或GCV進(jìn)行腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展或消退試驗(yàn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)估皮下腫瘤生長(zhǎng)或進(jìn)展時(shí)間的減少，而不 是已建立的腫瘤大小的縮小(消退)。在這個(gè)實(shí)施方案中，從第0
天開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組中的小鼠在飲用水中任意獲得GCV。水中GCV的 濃度可以是2mg/ml。每3天提供一次新鮮的GCV溶液。對(duì)照組中 的小鼠只接受飲用水。每2-3天測(cè)量一次肺瘤。當(dāng)胂瘤超過(guò)l cm3 時(shí)，處死小鼠。腫瘤體積用公式4/3兀,計(jì)算，其中r是胂瘤的半徑。 對(duì)照組中的所有小鼠均長(zhǎng)出腫瘤，而實(shí)驗(yàn)組中的所有小鼠保持沒(méi)有 腫瘤。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑和方法可用于促進(jìn)攜帶預(yù)先 已建立的腫瘤的免疫活性動(dòng)物體內(nèi)胂瘤的消退；即，本發(fā)明的試劑 可用來(lái)治療預(yù)先存在腫瘤的動(dòng)物。在這種情況下，將106個(gè)小鼠肝癌 MH-22細(xì)胞或類似細(xì)胞皮下注射到C3HA小鼠的側(cè)腹來(lái)建立腫瘤。 一旦在腫瘤細(xì)胞植入后形成腫瘤，即在隨意提供的飲用水中給實(shí)驗(yàn) 組小鼠施用含有Famvir胃內(nèi)(i.g.)溶液的組合物，而對(duì)照組小鼠接 受不含該藥物的相同組合物(例如蒸餾水)。每2-3天監(jiān)測(cè)一次腫 瘤生長(zhǎng)。Famvir含有泛昔洛韋，即口服給藥的噴昔洛韋的前藥。在 化學(xué)上，泛昔洛韋被稱為二乙酸2-[2-(2-氨基-9H-噤呤力-基)乙 基]-l，3-丙二醇。當(dāng)給這些荷瘤動(dòng)物施用Famvir 21-28天時(shí)，觀察 到肺瘤生長(zhǎng)遲緩。這種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制在對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)。治 療開(kāi)始幾周后，只有用Famvir處理的動(dòng)物顯示100%的存活率。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，也可采用確定細(xì)胞凋亡促進(jìn)的體內(nèi)試驗(yàn)。 在這個(gè)實(shí)施方案中，可以檢測(cè)用治療性組合物治療的帶有異種移植 物的動(dòng)物中凋亡灶的存在，并與未治療的帶有異種移植物的對(duì)照動(dòng) 物相比較。在治療組動(dòng)物的腫瘤中發(fā)現(xiàn)凋亡灶的程度提供了關(guān)于該 組合物的治療效果的指示。
在設(shè)計(jì)用于治療端粒酶介導(dǎo)的人類癌癥(早期腫瘤和血管化的腫 瘤)的藥物的適當(dāng)劑量時(shí)，可由本文描述的動(dòng)物研究外推而容易地 獲得用于臨床給藥的合適劑量。為了實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)換，需考慮每單位質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所施用的藥物質(zhì)量，優(yōu)選地考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類患 者之間體表面積的差異。所有這些計(jì)算對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō) 是已知的和常規(guī)的。因此，治療有效劑量的確定屬于本領(lǐng)域技術(shù)人 員的能力范圍之內(nèi)。
例如，采用在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和小鼠研究中成功的GCV或ACV (V-GCV或V-ACV )劑量，并且應(yīng)用基于質(zhì)量和表面積的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算， 得出用于成人患者的有效劑量是每名患者每天大約1000 mg到大約 6000mg的GCV或ACV，優(yōu)選地是每名患者每天大約500 mg到大 約1000 mg的V-GCV或V-ACV。因此，應(yīng)用這些信息，本文預(yù)期 用于人類給藥的治療劑(例如阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相 應(yīng)的前藥，即，伐昔洛韋、纈更昔洛韋、泛昔洛韋)的低劑量可以 是每名患者每天大約1、 5、 10、 20、 25或大約30mg;用于人類給 藥的治療劑的有用高劑量可以是每名患者每天大約250、 300、 400、 450、 500或大約600 mg。有用的中等劑量可以是每名患者大約40 mg 到大約200mg。
盡管提到這些范圍，但是應(yīng)當(dāng)理解，考慮到本文所述的參數(shù)和詳 細(xì)指導(dǎo)，在本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括活性或最佳范圍的進(jìn)一步變化。 本發(fā)明的治療方案的目的總的是產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果，同時(shí)仍然 使劑量保持在與不可接受的毒性有關(guān)的水平以下。除了改變劑量本 身外，也可以改變給藥方案以優(yōu)化治療策略。目前優(yōu)選的一種治療 策略是在大約60天的期限內(nèi)施用大約1 - 500mg、優(yōu)選地大約 10-100mg的端粒酶抑制劑或拮抗劑或包含它們的治療性混合物，大 約4次。例如，可以在大約第1、第3或第4天和第6或第7天給予 劑量?？赏ㄟ^(guò)口服單個(gè)或分開(kāi)的劑量進(jìn)行給藥，或者例如直接向?qū)?體瘤部位給藥，或者以緩釋制劑形式給藥。負(fù)責(zé)給藥的醫(yī)生根據(jù)本 發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，將能夠確定適合受試個(gè)體的劑量、給藥的形式和 途徑。這種優(yōu)化和調(diào)整在本領(lǐng)域中常規(guī)進(jìn)行，不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。 在施用特定劑量本身時(shí)，根據(jù)關(guān)于無(wú)菌性、致熱原性、純度和對(duì)人 類患者全身的總體安全性的管理標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選地提供藥物學(xué)上可接受的組合物。當(dāng)然，身體檢查、腫瘤測(cè)量和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在治療前 進(jìn)行，并且在治療后以最多1到幾個(gè)月的間隔進(jìn)行，本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)知道如何進(jìn)行這種常^見(jiàn)程序。臨床反應(yīng)可用任何可接受的指 標(biāo)來(lái)定義。例如，完全有效可以定義為在治療后特定期限內(nèi)所有可 測(cè)到的肺瘤均消失。
工作實(shí)施例
應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。除了另外詳細(xì)說(shuō)明外，下述實(shí)施例采用 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng) 當(dāng)理解，該實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實(shí)施本發(fā) 明中工作良好的技術(shù)，因此可以被視為構(gòu)成了優(yōu)選實(shí)施模式。然而， 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明 的精神和范圍的情況下，可以對(duì)公開(kāi)的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變， 而仍然獲得同樣的或類似的結(jié)果。
端粒酶陽(yáng)性癌細(xì)胞中端粒酶縮短、G2停滯和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)已 經(jīng)如下所述進(jìn)行。
使用端粒酶陽(yáng)性(HeLa)和端粒酶陰性(U-2 OS)細(xì)胞系。進(jìn) 行適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)以檢測(cè)和證實(shí)這些細(xì)胞中的端粒酶/L 1RT比活性。
這些細(xì)胞系用治療濃度的ACV (3.0 pM)、 GCV (1.5 juM)或PCV (1.5 iuM)處理，以證明這些細(xì)胞內(nèi)的端粒DNA合成可被抑制，由此 誘導(dǎo)端粒縮短。ACV、 GCV和PCV處理的和未處理的細(xì)胞系中的端 粒長(zhǎng)度采用端粒特異性肽核酸(PNA)探針通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)量 23'24。為了確定細(xì)胞周期分布，用二碘化丙錠(PI)將細(xì)胞染色23。在 處理后10天和14天，證明兩種細(xì)胞系發(fā)生端?？s短、大規(guī)4莫細(xì)胞 凋亡和G2停滯(圖1、 2、 3 )。
為了證明細(xì)胞周期分布的變化，用ACV、 GCV或PCV處理HeLa 和U-2 OS細(xì)胞14天，用PI染色，并同時(shí)通過(guò)流式細(xì)月包術(shù)進(jìn)行分析。 結(jié)果顯示細(xì)胞周期G2停滯。重要的是注意到這種變化是快速的，并且在ACV處理僅僅幾天后就可檢測(cè)到。
該研究中使用的U-2 OS (骨肉瘤)和HeLa (子宮頸)細(xì)胞系從 美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection ) (Rockville, MD)獲得。細(xì)胞在37°C和5% C02的潮濕氣氛下在補(bǔ) 充10%胎牛血清的D-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了用ACV處理細(xì)胞， 向培養(yǎng)基中補(bǔ)加3 阿昔洛韋(阿昔洛韋，TEVA Pharm. Ind. Ltd, 以色列)。為了用GCV處理細(xì)胞，向培養(yǎng)基中補(bǔ)加1.5 |iM GCV (Cymevene, Hoffman-La Roche)。為了用PCV處理細(xì)胞，向培養(yǎng) 基中補(bǔ)力口 1.5 pMPCV (噴昔洛韋，Merck & Co.)。
實(shí)時(shí)TRAP試-瞼如前所述進(jìn)行(Wege等人，SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity. 7Vwc/e/c爿c油2003;31(2):E3-3 )。
對(duì)于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的端粒長(zhǎng)度測(cè)量，如Rufer等人，1998, Telomereength dynamics in human lymphocyte subpopulations v/ere measured by flow cytometry, 7Vat &'c^ec/mo/. 16， 743-747所述，將纟田 胞用端粒特異性FITC偶聯(lián)的((:3丁入2)3 PNA (Applied Biosystems)探針 染色，并且用0.06 pg/mlPI復(fù)染。
因此，本文已經(jīng)證實(shí)了核苷類似物ACV、 GCV和PCV顯然導(dǎo)致 端粒長(zhǎng)度縮短。絕不應(yīng)認(rèn)為有用的抑制性化合物僅限于以上具體舉 例說(shuō)明的特定化合物或核苷類似物和衍生物。實(shí)際上，可以證明根 據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容設(shè)計(jì)和合成的大多數(shù)有用的藥理學(xué)化合物是第二 代衍生物或進(jìn) 一 步化學(xué)修飾的無(wú)環(huán)核苷類似物。
引用的參考文獻(xiàn)
下列編號(hào)為1-26的參考文獻(xiàn)在上述說(shuō)明書(shū)中被引用(帶有相應(yīng)
當(dāng)?shù)纳蠘?biāo)號(hào)相對(duì)應(yīng)。
1, Olovnikov， A.M. Principle of marginotomy in template synthesis of polynucleotides.濕/U.iVawA:m7 201, 1496-1499 (1971).2. Alshire， R.C.， Dempster, M.， Hastie， N.D. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeat distributed non-randomly. A/^c/e/c
17,4611-4627(1989).
3. Greider， C.W., Blackburn, E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Ce〃 43， 405-413 (1985).
4. Morin GB. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 1989 Nov 3;59(3):521-9.
5. Kim， N.W.， Piatyszek, M.A.， Prowse， K.R.， Harley， C.B.， West, M.D. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Sc/e"ce 266， 2011-2015 (1994).
6. Harley, C.B., Futcher, A.B.， Greider, C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts, to麼34， 458-460 (1990).
7. Bryan, T.M.， Englezou， A., Dalla-Pozza, L,， Dunham, M.A., Reddel， R,R. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines. TV"/.臉d. 3， 1271-1274 (1997).
8. Reddel, R.R.， Bryan, T,M.， Colgin, L.M.， Perrem， K.T., Yeager, T.R. Alternative lengthening of telomeres in human cells, /^to. Aes. 155， 194-200 (2001).
9 .Wright, W.E.， Piatyszek, M.A" Rainey， W.E., Byrd, W.， Shay， J.W. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Z)ev. Ge"". 18,173-179(1996).
10. Greider CW Mammalian telomere dynamics: healing, fragmentation shortening and stabilization. Cwr Qpz'w Ge""Dev. 1994;4(2):203曙11.
11. Hahn, W. C.等人.Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells. iV"A5， U64-1170 (1999).
12. Elion, G. B.; Furman, P. A.; Fyfe， J, A.; de Miranda, P.; Beauchamp,L.; Schaeffer, H. J. Selectivity of Action of an Antiherpetic Agent, 9-(2-Hydroxyethoxymethyl)guanine. TVoc. 7V<^/.」c"<i. 5W. [/.S.yl 1977， 74， 5716-5720.
13. Martin, J. C.; Dvorak, C. A.; Smee， D. F.; Matthews, T. R.; Julien， P. H.; Verheyden, J. P. H. 9-[(l,3-Dihydroxy畫(huà)2-propyloxy)methyl]guanine: A New Potent and Selective Antiherpes Agent. 乂她c/. CTz簡(jiǎn).1983， 2(5, 759-761.
14. Smee， D. F.; Martin, J. C.; Verheyden, J. P. H.; Matthews, T. R. Antiherpesvirus Activity of the Acyclic Nucleosides 9-(l,3-Dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine. y4w"Vm'cra6.々e她CT^wo/^e/-. 1983， 23, 676-682.
15. Field, E. K.; Davies， M. E.; DeWitt, C.; Perry, H. C.; Liou, R.; Germershausen, J.; Karkas, J. D.; Ashton， W. T.; Johnston, D. B.; Tolman, R. L. 9-([2-Hydroxy-l-(hydroxymethyl)ethoxy]methyl)guanine: A Selective Inhibitor of Herpes Group Vims Replication.尸rac. JVa//.」ca^ 5W. t/.51./1 1983， SO, 4139-4143.
16. Harnden, M. R.; Jarvest, R. L.; Bacon, T. H.; Boyd, M. R. Synthesis and Antiviral Activity of 9-[4-Hydroxy-3-(hydroxymethyl)but-l-yl]purines. 乂 Mec/. C/zern. 1987， 30, 1636-1643.
17. Vere Hodge, R. A.; Perkins, R. M. Mode of Action of 9-(4-Hydroxy-3-hydroxymethylbut-l-yl)guanine (BRL 39123) against Herpes Simplex Virus in MRC-5 Cells.爿油'mz'cra6. C/^膨Aer. 1989, 33, 223-229.
18. de Miranda P， Whitley RJ, Blum MR, Keeney RE， Barton N， Cocchetto DM， Good S， Hemstreet GP 3rd, Kirk LE, Page DA， EHon GB .Acyclovir kinetics after intravenous infusion. C7/"尸/wrw"co/ T7zer 1979;26(6):718畫(huà)28.
19. Van Dyke RB， Connor JD, Wyborny C, Hintz M， Keeney RE. Pharmacokinetics of orally administered acyclovir in patients with herpesprogenitalis, ^w/她d 1982;73(1A): 172-5.
20. Lycke J, Malmestrom C， Stahle L.Acyclovir levels in serum and cerebrospinal fluid after oral administration of valacyclovir. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47(8):2438-41,
21. Piketty C, Bardin C, Gilquin J, Gairard A, Kazatchkine MD, Chast F.Monitoring plasma levels of ganciclovir in AIDS patients receiving oral ganciclovir as maintenance therapy for CMV retinitis. C7/w Mcro^z'o/ 2000;6(3): 117-20.
22. Brown F， Banken L， Saywell K， Arum I. Pharmacokinetics of valganciclovir and ganciclovir following multiple oral dosages of valganciclovir in HIV- and CMV-seropositive volunteers. 尸/za/777acoA:/"e/. 1999;3 7(2): 167-76.
23. Rufer， N., Dragowska， W.， Thombury G., Roosnek， E,， Lansdorp P.M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. 腸欣/wo/. 16， 743-747 (1998).
24. Hultdin, M.等人.Telomere analysis by fluorescence /" wYw hybridization and flow cytometry. 7V"c/e/d油Wey. 26， 3651-3656 (1998).
25. TRAP-ELISA A.K. Velin， A, Herder, K丄Johansson等人， Telomerase is not activated in human hyperplastic and adenomatous parathyroid tissue,五wr /feiomW 145 (2001)， pp. 161—164.
26. 實(shí)時(shí)TRAP (Wege等人，SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity. M/c/e"c油to. 2003;31(2):E3國(guó)3).
說(shuō)明書(shū)中提到的全部出版物、專利和專利申請(qǐng)?bào)w現(xiàn)本發(fā)明所屬領(lǐng) 域的技術(shù)人員的水平。全部出版物、專利和專利申請(qǐng)引入本文作為
:作為參考::^為了清楚理解的目的l經(jīng)通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)施例 詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但是顯然可在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)實(shí)施 某些變化和^(奮改。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物或人體中由于存在不適當(dāng)?shù)鼗虿±硇栽鲋车募?xì)胞或無(wú)限增殖細(xì)胞而引起的疾病或治療癌癥的方法，該方法包括向患有癌癥的人施用治療有效量的包含一種或多種無(wú)環(huán)核苷類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述核苷類似物選自阿昔洛韋、 更昔洛韋、噴昔洛韋或其前藥。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢 癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌或黑素瘤。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物通過(guò)口服、非腸胃、皮 下、肌肉內(nèi)或血管內(nèi)施用。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中施用包含兩種或多種所述核苷類似 物的組合物。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷類似物之一的施用量為每 天大約10mg/kg體重到大約150mg/kg體重。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中所述核苷類似物與放射治療和/或非 核苷化療劑聯(lián)合施用。
8. —種千擾腫瘤細(xì)胞中端粒延長(zhǎng)的方法，該方法包括給所述細(xì) 胞施用有效量的無(wú)環(huán)核苷類似物。
9，權(quán)利要求8的方法，其中所述核苷類似物選自阿昔洛韋、 更昔洛韋、噴昔洛韋或其前藥。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述核苷類似物與選自下組的不同 類型的類似物聯(lián)合施用3，-疊氮-2，，3，-雙脫氧胸苷(AZT) 、 2'， 3'-雙脫氧肌苷(ddl) 、 2'，3'-雙脫氫-3'-脫氧胸苷(d4T)，其中所述不 同類型的類似物以低劑量存在，其單獨(dú)時(shí)不足以終止端粒的延長(zhǎng)。
11. 權(quán)利要求8的方法，其中所述癌癥是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢 癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌或黑素瘤。
12. —種防止或抑制端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括^f吏細(xì)胞接觸足量的無(wú)環(huán)核苷類似物。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)胞與濃度為大約1.5pM至 3.0|aM的核苷類似物接觸。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述核苷類似物是阿昔洛韋、更 昔洛韋或噴昔洛韋或其前藥。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所述端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞是癌細(xì)胞， 其中所述癌細(xì)胞選自骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮 質(zhì)癌和黑素瘤。
16. —種在需要的人中預(yù)防癌癥的方法，其中所述癌癥是由于該 人細(xì)胞中的端粒酶活性引起的，該方法包括給所述人施用治療有效 量的含有一種或多種無(wú)環(huán)核苷類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥選自骨肉瘤、乳腺癌、 卯巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌和黑素瘤。
18. —種治療患有癌癥的個(gè)體的方法，包括給所述個(gè)體施用治療 有效量的含有逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑或拮抗劑的組合物，該逆轉(zhuǎn)錄酶由 L-l (LINE-1)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼或是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT), 并且與所述個(gè)體細(xì)胞中端粒的延長(zhǎng)有關(guān)，其中該抑制劑或拮抗劑阻 斷所述端粒的延長(zhǎng)，其中該抑制劑或拮抗劑是選自阿昔洛韋、更昔 洛韋、噴昔洛韋或其前藥的無(wú)環(huán)核苷類似物。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述癌癥不包括移植后淋巴增生 性疾病。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述癌癥是骨肉瘤、乳腺癌、卵 巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌或黑素瘤。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述組合物通過(guò)口服、非腸胃、 皮下、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)或局部施用。
22. —種治療人的癌癥的方法，其中所述癌癥是由于該人細(xì)胞中 顯示端粒酶介導(dǎo)的端粒延長(zhǎng)或L-l (LINE-1 )逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的逆 轉(zhuǎn)錄酶誘導(dǎo)的替代性端粒延長(zhǎng)的細(xì)胞引起的，該方法包括給所述患有癌癥的人施用治療有效量的含有一種或多種無(wú)環(huán)核苷類似物或其 藥學(xué)上可接受的鹽的組合物，其中所述核苷類似物阻斷所述端粒延 長(zhǎng)，其中所述核苷類似物選自阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋或其前藥。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中施用包含兩種或多種所述核苷類 似物的組合物。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述核苷類似物之一的施用量為 每天大約100mg/kg體重到大約500mg/kg體重。
25. —種終止端粒酶陽(yáng)性和端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞中的端粒延長(zhǎng)的 方法，該方法包括給所述細(xì)胞施用有效量的端粒酶的抑制劑或拮抗 劑或由L-l (LINE-1 )逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑或拮抗 劑，其中所述抑制劑或拮抗劑阻斷所述端粒延長(zhǎng)，其中所述核苷類 似物選自阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋或其前藥。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述核苷類似物與選自下組的不 同類型的類似物聯(lián)合施用3，-疊氮-2，，3，-雙脫氧胸苷(AZT) 、 2', 3'-雙脫氧肌苷(ddl) 、 2'，3'-雙脫氫-3'-脫氧胸苷(d4T),其中所述不 同類型的類似物以低劑量存在，其單獨(dú)時(shí)不足以終止端粒的延長(zhǎng)。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是骨肉瘤、乳腺癌、 卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌或黑素瘤。
28. —種防止或抑制顯示端粒延長(zhǎng)的端粒酶陽(yáng)性或陰性細(xì)胞生長(zhǎng) 的方法，該方法包4舌使所述細(xì)胞接觸一種核苷類似物，其中所述核苷類似物阻斷所述 端粒延長(zhǎng)，其中所述核苷類似物是阿昔洛韋、更昔洛韋、或噴昔洛 韋或其前藥。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述細(xì)胞與濃度為0.2pM的核苷 類似物4妄觸。
30. 權(quán)利要求28的方法，其中所述端粒酶陰性細(xì)胞是癌細(xì)胞， 其中所述癌細(xì)胞選自骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì) 癌或黑素瘤。
31. —種干擾系統(tǒng)中端粒酶或L1RT活性的方法，包括給顯示由 端粒酶或L1RT活性介導(dǎo)的端粒延長(zhǎng)的系統(tǒng)提供一定量的核普類似 物，其中所述核普類似物阻斷所述端粒延長(zhǎng)，其中所述核普類似物 是阿昔洛韋、更昔洛韋、或噴昔洛韋或其前藥，其中所述系統(tǒng)是在 體外或體內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞。
32. —種在需要的人中預(yù)防癌癥的方法，其中所述癌癥是由于該 人細(xì)胞中顯示由端粒酶或L-l (LINE-1 )逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的逆轉(zhuǎn)錄 酶誘導(dǎo)或介導(dǎo)的替代性端粒延長(zhǎng)的細(xì)胞引起的，該方法包括給該人 施用治療有效量的含有一種或多種核苷類似物或其藥學(xué)上可接受的 鹽的組合物，其中所述核苷類似物阻斷所述端粒延長(zhǎng)，其中所述核 苷類似物選自阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋或其前藥。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述癌癥選自骨肉瘤、乳腺癌、 卯巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌和黑素瘤。
全文摘要
無(wú)環(huán)核苷類似物，如阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥，即，分別為伐昔洛韋、纈更昔洛韋、泛昔洛韋，已經(jīng)被鑒定為端粒酶(由TERT編碼)和由L-1(LINE-1)RT編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑或拮抗劑，并且可用于治療或預(yù)防由這兩種酶誘導(dǎo)的或介導(dǎo)的癌癥。治療或預(yù)防患者中的這些癌癥的方法包括在患者細(xì)胞中施用治療有效量的含有逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑或拮抗劑的組合物。所述抑制劑或拮抗劑阻斷端粒酶陽(yáng)性和端粒酶陰性細(xì)胞中的端粒延長(zhǎng)。還公開(kāi)了用于檢測(cè)表達(dá)TERT和L1RT的病理學(xué)增殖細(xì)胞的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)A61K31/54GK101588805SQ200680024082
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2006年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者I·E·邦達(dá)雷夫 申請(qǐng)人:Alt解決方案公司