專利名稱：一種使用gapdh基因分析arhgdib基因表達量的rt-pcr技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用GAPDH基因mRNA為內(nèi)參，對ARHGDIB基因進行相對定量的實 時熒光RT-PCR擴增檢測技術(shù)，并形成相應(yīng)試劑盒，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組圖譜的完成，人們開始進入后基因組時代，重點也轉(zhuǎn)向了研究各 基因在生命中的作用，包括基因在生長發(fā)育、遺傳、疾病、外型體征等方面的作用。其中，對 于RhoGDP dissociation inhibitor (GDI) beta基因(ARHGDIB基因)表達的研究也越來越 多。 基因表達的檢測有幾種方法。經(jīng)典的方法是根據(jù)在細胞或生物體中所觀察到的生 物化學或表型的變化來決定某一特定基因是否表達。隨著大分子分離技術(shù)的進步使得特異 的基因產(chǎn)物或蛋白分子的識別和分離成為可能。隨著重組DNA技術(shù)的運用，現(xiàn)在有可能檢 測、分析任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前有好幾種方法廣泛應(yīng)用于研究特定RNA分子。這些方 法包括RT-PCR、原位雜交、NORTHERN凝膠分析、打點或印跡打點、S-1核酸酶分析、RNA酶保 護研究以及基因芯片等。 熒光探針PCR技術(shù)是今年興起并得到快速發(fā)展的技術(shù)，是將同時帶有關(guān)聯(lián)的熒光 發(fā)光基團(能量供體)和淬滅基團(能量受體)的熒光探針結(jié)合PCR技術(shù)而產(chǎn)生的一種 新的檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強，且不易發(fā)生產(chǎn)物污染等特點，包括Taqman探針技 術(shù)、分子信標(Beacan探針)等，由于該技術(shù)操作簡便，檢測速度快，且各方面性能都有優(yōu) 勢，目前在臨床、研究等核酸檢測領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 GAPDH (Human glyceraldehyde_3-phosphate dehydrogenase)基因為常用的看家 基因，在人體細胞內(nèi)表達情況較為穩(wěn)定，已被廣泛用于基因表達的研究，利用A ACt值的 方法能對其他基因的表達情況進行相對定量分析。公式為F = 2—AAet。
本發(fā)明將RT-PCR與熒光探針技術(shù)結(jié)合，通過廣泛篩選和優(yōu)化檢測引物和探針，同 時對細胞內(nèi)的GAPDH基因和ARHGDIB基因mRNA進行相對定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量 的RT-PCR技術(shù)。 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種一步法RT-PCR同時檢測GAPDH基因mRNA和 ARHGDIB基因mRNA的技術(shù)。 根據(jù)GeneBank序列號為NC_000012的基因序列為模板，設(shè)計了一對引物及特異性 探針，檢測長度為139bp的目標mRNA，其引物探針序列分別為
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1)
引物2 :5— -GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2)
4
探針1 :5—-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3— (Seq No. 3)
或探針2 :5—-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3— (Seq No. 4) 設(shè)計的探針跨越了 NCJ)00012基因序列中第111098-111743位核苷酸的內(nèi)含子，
分別與其兩端的外顯子特異性匹配，這樣可非常有效的避免基因組DNA對實驗結(jié)果的影
響，同時也省去了使用DNA酶對樣本進行消化用以去除DNA干擾的步驟。 根據(jù)GeneBank序列號為NW_925295的基因序列為模板，設(shè)計了一對引物及特異性
探針，檢測長度為131bp的內(nèi)參(GAPDH基因)mRNA，其引物探針序列分別為 引物3 :5—-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3— (Seq No. 6)探針3 :5—-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3— (Seq No. 7) 或者上述弓I物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75 %的序列。 計的探針跨越了 NW_925295基因序列中第2104-2193位核苷酸的內(nèi)含子，分別與
其兩端的外顯子特異性匹配，這樣可非常有效的避免基因組DNA對實驗結(jié)果的影B向，同時
也省去了使用DNA酶對樣本進行消化用以去除DNA干擾的步驟。 上述試劑盒的探針(探針1、探針2和探針3)，其5—端的熒光發(fā)光基團可為FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange或ROX中任意一種；3—端熒光淬滅基團可為 DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、 TAMRA、 BHQ-l、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基團中的任意一種。
本發(fā)明提供的使用GAPDH基因mRNA分析ARHGDIB基因相對表達量的RT-PCR試劑 盒是使用一步法RT-PCR的技術(shù)，使操作更為簡便、快速。使用表達量相對穩(wěn)定的GAPDH基 因與目標基因同時檢測，能對標本中的ARHGDIB基因mRNA進行相對表達量進行定量分析。
本發(fā)明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)形成的試 劑盒，使用2個人工合成的RNA序列作為RNA陽性對照品，序列為
模板1 :7
(139bp)(Seq No. 8)
模板2
(Seq No.9) 其中，ARHGDIB基因mRNA檢測體系使用模板1作為陽性對照品，GAPDH基因mRNA 檢測體系使用模板2作為陽性對照品。 本發(fā)明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)形成的試 劑盒組成為 組成成分(20人份/盒)體積
反應(yīng)緩沖液A 380 ill 反應(yīng)緩沖液B 380 ill 混合酶 60 ill RNA陽性對照品A 30
RNA陽性對照品B 30
DEPC水 1ml 其中，反應(yīng)緩沖液的組分(終濃度)包括50mM Tris-HCl(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA檢測體系(反應(yīng)緩沖液A)含200nM引物1、 200nM引物2和200nM探針l，GAPDH基因mRNA檢測體系(反應(yīng)緩沖液B)含200nM引物3、 200nM引物4和200nM探針3，其中，兩條探針的5—端標記的發(fā)光基團均為FAM，在3—端標 記的淬滅基團均為Eclipse。混合酶的組成成份(終濃度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
本發(fā)明提供的試劑盒操作步驟如下
PCR反應(yīng)液的配制 A管按每人份反應(yīng)緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; B管按每人份反應(yīng)緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; RNA陽性對照品直接取8ul ， A管使用RNA陽性對照品A， B管使用RNA陽性對照品 B，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95t:保溫5分 鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光)。
采用比較Ct值的相對定量法，即通過標本的兩管檢測Ct值與正常對照品的兩管 檢測Ct值的A A Ct值，根據(jù)F = 2—A Aet公式計算ARHGDIB基因相對GAPDH基因的表達量。
傳統(tǒng)的RT-PCR使用兩步法擴增，時間長，操作相對復雜，且因多了一個步驟而易 發(fā)生污染，所以本發(fā)明提供的試劑盒采用一步法RT-PCR技術(shù)，將RT步驟與PCR步驟一步完 成，無須開管進行二次加樣，將少了污染的機會。由于反應(yīng)體系中RT步驟是使用特異性引 物進行延伸，與傳統(tǒng)的隨機引物法相比，逆轉(zhuǎn)錄需要的時間更短，通常可在1. 5小時內(nèi)完成 全部RT-PCR反應(yīng)，并且由于試劑盒使用熱穩(wěn)定性較強的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，可在5(TC進行RT反 應(yīng)，產(chǎn)品的特異性非常高。
具體實施例方式
根據(jù)GeneBank中的人類基因組12號染色體ARHGDIB基因相關(guān)序列進行比對和分 析，設(shè)計和制備引物與探針(設(shè)計模板GeneBank序列號為NCJ)00012):
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2) 探針1 :5—-FAM-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-Eclipse-3— (Seq No. 3)
設(shè)計并制備人工合成RNA序列
(Seq No. 8) 根據(jù)GeneBank中的人類基因組12號染色體GAPDH基因相關(guān)序列進行比對和分
6析，設(shè)計和制備引物與探針(設(shè)計模板GeneBank序列號為NW—925295):
引物3 :5—-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3— (Seq No. 6) 探針3 :5—-FAMACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAEclipse-3— (Seq No. 7)
設(shè)計并制備人工合成RNA序列
No. 9) 將人工合成的兩條RNA序列用DEPC處理過的水溶解并稀釋至適當濃度，分別作為 ARHGDIB和GAPDH基因mRNA的陽性對照品。 按如下配方配制反應(yīng)緩沖液A(終濃度)50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探針1。 按如下配方配制反應(yīng)緩沖液B(終濃度):50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物3、200nM弓|物4禾P 200nM探針3。 按如下配方配制混合酶(終濃度):0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
試劑盒組成為
組成成分(20人份





反應(yīng)緩沖液A 反應(yīng)緩沖液B 混合酶
RNA陽性對照品A RNA陽性對照品B DEPC水
盒) 380 ii 1 380 ii 1 60 ii 1 30 ii 1 30 ii 1 lml
體積
本發(fā)明提供的試劑盒未提供mRNA提取試劑，用戶可根據(jù)自身要求使用傳統(tǒng)的 酚_氯仿提取方法或購買商業(yè)化的RNA提取試劑盒。
檢測步驟
PCR反應(yīng)液的配制 A管按每人份反應(yīng)緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22ul/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; B管按每人份反應(yīng)緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; RNA陽性對照品直接取8ul ， A管使用RNA陽性對照品A， B管使用RNA陽性對照品 B，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95t:保溫5分 鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光)。
結(jié)果分析與監(jiān)控 根據(jù)儀器分析的結(jié)果，在如下情況視實驗有效對照品A和對照品B的Ct值均< 32且大于26。
根據(jù)公式F = 2—"n計算相對表達量。也有部分全自動熒光PCR擴增儀可直接讀取△ ACt值。SEQUENCE LISTING〈110〉上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司劍軍，何懿，夏〈120> —種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)<160>9〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13ccac3g朋g tccctga肪g agct<210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ggtgagccgg gtgacaacga c〈210〉3〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tcggatctgtcaccacagga cca〈210>4〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tggtcctgtg gtgacagatc cga〈210>5〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列
〈400>5tcaagatcat cagcaatgcc t21〈210>6<211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6agtcttctgg gtggcagtga t21〈210>7〈211>25〈212>廳〈213〉人工序列〈400>7actgtggtca tgagtccttc cacga25<210〉8〈211>139〈212>RNA〈213〉人工序列<400〉83ccac3gaag ucccug朋3g 3gcugcaggagaugaugagagucimauima60gimc朋g朋3 acgcugcugg gag肌gguccUgUggUg3C3g肌CCg朋3gccccc朋ugu120Cg皿gUC3CC CggCUC3CC139〈210>9〈211>131〈212>RNA〈213>人工序列〈400>9uc朋g肌c;au cagc朋ugcc uccugcaccscc朋cugc皿agcaccccuggcc朋gguca60ucc肌g3csm c皿uggimuc gugg朋gg3cUC3Ug3CC3Cagucc肌gccSlUC3CUgCC3120cccag朋gac u131
9
權(quán)利要求
一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于包含用于檢測ARHGDIB基因mRNA的一對特異性引物和一條特異性探針以及用于檢測GAPDH基因mRNA的一對特異性引物和一條特異性探針，擴增目標片段長度分別為139bp和131bp，引物和探針序列分別為檢測ARHGDIB基因mRNA的引物和探針引物15`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)引物25`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)探針15`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)或探針25`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)檢測GAPDH基因mRNA的引物和探針引物35`-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3`(Seq No.5)引物45`-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3`(Seq No.6)探針35`-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3`(Seq No.7)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于標記探針5—端的熒光發(fā)光基團可為FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 OregonGreen488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或R0X中任意一種；3—端熒光淬滅基團可為DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基團中的任意一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于使用一步法RT-PCR熒光檢測技術(shù)，對待測標本和正常對照品中的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA同時進行檢測，對ARHGDIB基因的表達量進行相對定量分析。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于，可形成試劑盒，使用2個人工合成的RNA序列作為RNA陽性對照品，序列為模板1bp)(Seq No. 8)模板2 :No. 9)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)形成的試劑盒，其特征在于，ARHGDIB基因mRNA檢測體系使用模板1作為陽性對照品，GAPDH基因mRNA檢測體系使用模板2作為陽性對照品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)形成的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組成為組成成分(20人份/盒) 體積反應(yīng)緩沖液A 380 ill反應(yīng)緩沖液B 380 ill混合酶 60 ii 1RNA陽性對照品A 30 illRNA陽性對照品B 30 illDEPC水 1ml其中，反應(yīng)緩沖液的組分(終濃度)包括50mM Tris-HCl (Ph 8. 3) 、50mM KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA檢測體系(反應(yīng)緩沖液A)含200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探針1， GAPDH基因mRNA檢測體系(反應(yīng)緩沖液B)含200nM引物3、200nM引物4和200nM探針3，其中，兩條探針的5—端標記的發(fā)光基團均為FAM，在3—端標記的淬滅基團均為Eclipse。混合酶的組成成份(終濃度)包括0. 5U AMV酶、0. 5URNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0. 05U UNG酶。RNA陽性對照品A和RNA陽性對照品B分別為適當濃度的模板1和模板2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)形成的試劑盒，其特征在于，操作步驟如下PCR反應(yīng)液的配制A管按每人份反應(yīng)緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22ul/管分裝到O. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應(yīng)總體積為30ul ;B管按每人份反應(yīng)緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22ul/管分裝到O. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應(yīng)總體積為30ul ;RNA陽性對照品直接取8ul，A管使用RNA陽性對照品A，B管使用RNA陽性對照品B，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95"C保溫5分鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集FAM通道熒光)。結(jié)果分析，根據(jù)標本的兩管檢測Ct值與正常對照品的兩管檢測Ct值的A ACt值，對ARHGDIB進行相對定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術(shù)。本發(fā)明分別根據(jù)人的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA設(shè)計并篩選到最佳PCR檢測方案，能同時對標本中的兩個基因的mRNA進行檢測，根據(jù)兩個基因的mRNA檢測Ct值與正常對照兩個基因的mRNA檢測Ct值的ΔΔCt值，可分析ARHGDIB基因與看家基因-GAPDH基因之間的相對表達量。同時本發(fā)明提供相應(yīng)的一步RT-PCR檢測試劑盒。本發(fā)明還提供人工合成的兩種RNA，減少假陰性的發(fā)生率；本發(fā)明檢測速度快，能排除基因組DNA的干擾，特異性強，且靈敏度高，可用于ARHGDIB基因表達方面的研究和臨床。
文檔編號G01N21/64GK101760522SQ20081020164
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者何劍軍, 夏懿 申請人:上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司