專利名稱：針對(duì)與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因的基因組篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及檢測(cè)癌癥細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)上(epigenetically)沉默的基因的方法，更具體的說(shuō)，是涉及用于鑒定結(jié)直腸癌和胃癌細(xì)胞的基因組篩選。
背景技術(shù)：
雖然癌癥一般被認(rèn)為是由于遺傳變化如一個(gè)基因的突變而導(dǎo)致的，但現(xiàn)在已經(jīng)比較明確地認(rèn)為不改變DNA序列的表觀遺傳學(xué)機(jī)制也可以導(dǎo)致癌癥。最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)上的變化就是由于基因序列甲基化而導(dǎo)致該基因的表達(dá)沉默，特別是在5′端上游的基因調(diào)控序列。在CpG二核苷酸中，特別是在CpG富含區(qū)(CpG島)中，與鳥嘌呤相鄰的胞嘧啶的甲基化常常參與高等真核生物的正?；虮磉_(dá)調(diào)控。舉個(gè)例子，CpG島的過(guò)度甲基化與某些印記基因的轉(zhuǎn)錄失活相關(guān)，這些基因就像女性X染色體上基因的一樣失活。正常情況下不甲基化的CpG島的異常甲基化也在一些株化(immortalized)細(xì)胞和癌化細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而且這種甲基化還與人類癌癥的某些特定的腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)。
與癌癥相關(guān)的基因變化，包括使基因表達(dá)喪失或者表達(dá)出缺陷型基因產(chǎn)物的基因變化，以及表觀遺傳學(xué)機(jī)理，比如甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的沉默，為確定一個(gè)細(xì)胞是否易于失去生長(zhǎng)控制，也就是說(shuō)是否容易形成癌細(xì)胞提供了標(biāo)記。比如，BRCA1基因的一個(gè)突變與乳腺癌相關(guān)。這樣就可以對(duì)一個(gè)有家族乳腺癌歷史的女性身上的細(xì)胞作診斷性測(cè)試，看看這位女性是否也有作為乳腺癌標(biāo)記分子的BRCA1基因突變。前列腺特異性抗原(PSA)是標(biāo)記分子的另外一個(gè)例子，它是前列腺癌的標(biāo)記分子。雖然對(duì)于導(dǎo)致PSA表達(dá)的缺陷以及PSA在體內(nèi)的正常功能都一無(wú)所知，但是不可否認(rèn)PSA提供了一個(gè)極有價(jià)值的癌癥標(biāo)記分子，因?yàn)橥ㄟ^(guò)它就可以確定那些易于患前列腺癌或者是處在癌癥早期的男性，這樣就有可能引進(jìn)有效的治療。最近，一個(gè)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/受細(xì)胞因子誘導(dǎo)的SH2蛋白質(zhì)家族成員的抑制子——SOCS-1基因的甲基化轉(zhuǎn)錄沉默在各種各樣的癌細(xì)胞中都有發(fā)現(xiàn)，包括肝癌、多骨髓瘤和急性白血病。因此，用來(lái)檢測(cè)SOCS-1基因甲基化狀態(tài)的篩選分析就能夠提供一些與這些癌癥相關(guān)的診斷信息。
因?yàn)榘┌Y是潛伏性較強(qiáng)的疾病，在病情惡化之前沒(méi)有明顯的臨床特征和癥狀，標(biāo)記分子的存在及其使用使得我們能夠確定一個(gè)人是否易于患某種癌癥，甚至作出癌癥早期的檢測(cè)，這是具有相當(dāng)大醫(yī)學(xué)價(jià)值的?？上У氖?，對(duì)于大多數(shù)癌癥，還沒(méi)有這樣的標(biāo)記分子可以被利用。這樣，許多癌癥患者都只有在病情惡化到需要做化療或者已經(jīng)是無(wú)藥可治的情況下才會(huì)尋求醫(yī)學(xué)的幫助。因此，就有必要尋找到可以用來(lái)檢測(cè)癌癥細(xì)胞的標(biāo)記分子。本發(fā)明就滿足了這樣一個(gè)需要，并且提供了額外的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及鑒定與癌癥有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因例如甲基化沉默基因的方法。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定與至少一種癌癥有關(guān)的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因的方法。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施，例如將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除(substraction)產(chǎn)物在適合于核酸扣除產(chǎn)物與陣列上互補(bǔ)的核苷酸序列選擇性雜交的條件下接觸，所述核酸扣除產(chǎn)物含有對(duì)應(yīng)于在用至少一種可以恢復(fù)表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)的試劑接觸過(guò)的癌細(xì)胞中表達(dá)的，但不在所述癌細(xì)胞的對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子；然后檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物與該陣列的一部分核苷酸序列的選擇性雜交，其中對(duì)應(yīng)于在與所述癌細(xì)胞對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子在適合于選擇性雜交的條件下不與所述的這部分核苷酸序列雜交，因而與所述陣列的這部分核苷酸序列選擇性雜交的核酸扣除產(chǎn)物代表了所述癌細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)沉默基因，由此鑒定出與至少一種癌癥相關(guān)的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因。
重新激活表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)的試劑可以是如下的任何一種試劑，例如，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(如，5-氮雜-2′-脫氧胞苷；DAC)，組蛋白脫乙酰酶抑制劑(如，曲古抑菌素A；TSA)，或這些試劑的組合如DAC和TSA的組合。因此，在本實(shí)施方案的一個(gè)方面，所述的核酸扣除產(chǎn)物包括與癌細(xì)胞中表達(dá)的RNA對(duì)應(yīng)的核酸分子，所述癌細(xì)胞與DAC或TSA接觸過(guò)。在另一個(gè)方面，核酸扣除產(chǎn)物包括與癌細(xì)胞中表達(dá)的RNA對(duì)應(yīng)的核酸分子，所述癌細(xì)胞與DAC和TSA接觸過(guò)。
與癌癥有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因在此通過(guò)表1中所列的基因來(lái)例示。例如，可以通過(guò)癌細(xì)胞與DAC接觸而被重新激活的表觀遺傳學(xué)沉默基因，即甲基化沉默基因的實(shí)例是PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7。同樣，可以通過(guò)癌細(xì)胞與DAC和TSA接觸而被重新激活的表觀遺傳學(xué)沉默基因的實(shí)例是POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT，TRIM32，或其組合。
發(fā)明的方法可鑒定與一種或多種癌癥有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因，所述癌癥包括，例如一種或多種癌和/或肉瘤。這種方法在此的實(shí)例是鑒定與結(jié)直腸癌有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因，與胃癌有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因，以及與結(jié)直腸癌和胃癌有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定與至少一種癌癥有關(guān)的至少一種甲基化沉默基因的方法。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施，例如將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除產(chǎn)物在適合于核酸扣除產(chǎn)物與陣列上互補(bǔ)的核苷酸序列選擇性雜交的條件下接觸，所述核酸扣除產(chǎn)物含有對(duì)應(yīng)于在用去甲基化試劑接觸過(guò)的癌細(xì)胞中表達(dá)的，但不在所述癌細(xì)胞的對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子；然后檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物與該陣列的一部分核苷酸序列的選擇性雜交，其中對(duì)應(yīng)于在與所述癌細(xì)胞對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子在適合于選擇性雜交的條件下不與所述的這部分核苷酸序列雜交，因而與所述陣列的這部分核苷酸序列選擇性雜交的核酸扣除產(chǎn)物代表了所述癌細(xì)胞的甲基化沉默基因，由此鑒定出與至少一種癌癥相關(guān)的至少一種甲基化沉默基因。
與癌癥細(xì)胞的RNA對(duì)應(yīng)的核酸分子可以是DNA(如cDNA)或RNA(如cRNA)。一般地，與細(xì)胞RNA對(duì)應(yīng)的核酸分子被標(biāo)記以進(jìn)行檢測(cè)，例如用放射性同位素，順磁性同位素，發(fā)光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物，熒光化合物，金屬螯合物，酶，酶的底物，受體，或受體的配體標(biāo)記，或例如采用可檢測(cè)的標(biāo)記探針來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，這樣核酸分子與陣列的核苷酸序列的雜交能夠被檢測(cè)到。
根據(jù)本發(fā)明的一種方法，至少一種(如，1，2，3，4，5或更多種)甲基化沉默基因與至少一種(如，1，2，3或更多種)癌癥有關(guān)。癌癥可以是，例如癌(carcinoma)或肉瘤(sarcoma)，包括一種或更多種特定類型的癌癥，例如消化道/胃腸道癌，肝癌，皮膚癌，乳癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，腎癌，肺癌，肌肉癌，骨癌或腦癌。在一個(gè)實(shí)例中，單獨(dú)的甲基化沉默PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3和DLX7基因，或其組合被確定與結(jié)直腸癌，胃癌有關(guān)，或同時(shí)與結(jié)直腸癌和胃癌有關(guān)。在另一個(gè)實(shí)例中，一個(gè)基因家族的成員，包括單獨(dú)的SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5或其組合被鑒定為與結(jié)直腸癌和/或胃癌有關(guān)的甲基化沉默基因。
本發(fā)明也涉及鑒定表現(xiàn)出不受調(diào)控的生長(zhǎng)或有這種傾向的細(xì)胞的方法。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施實(shí)施，例如在受測(cè)細(xì)胞中檢測(cè)表1所示的至少一種基因或其組合的表觀遺傳學(xué)沉默，由此確定該受測(cè)細(xì)胞為表現(xiàn)出不受調(diào)控的生長(zhǎng)或有這種傾向的細(xì)胞。例如，表觀遺傳學(xué)沉默基因可以是PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPPIR21A，F(xiàn)PGT，或TRIM32基因，或這些基因的組合。表現(xiàn)出不受調(diào)控的生長(zhǎng)或有這種傾向的細(xì)胞可以是贅生性細(xì)胞，例如一種惡化前的細(xì)胞如胃腸息肉的細(xì)胞，或可以是癌癥細(xì)胞，例如一種癌細(xì)胞如結(jié)直腸癌細(xì)胞或胃癌細(xì)胞，或肉瘤細(xì)胞。
在一種具體實(shí)施方案中，表觀遺傳學(xué)沉默是甲基化沉默，用于鑒定表現(xiàn)出不受調(diào)控的生長(zhǎng)或有這種傾向的細(xì)胞的方法可以通過(guò)檢測(cè)甲基化沉默來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，甲基化沉默的檢測(cè)是通過(guò)將包含著含有基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這種對(duì)甲基化敏感的內(nèi)切酶在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)上剪切，這樣，核酸分子的切割就可以作為指示受測(cè)細(xì)胞中這個(gè)基因甲基化沉默的標(biāo)志。例如，這種甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶是Acc III，Ban I，BstN I，Msp I或者Xma I。作為選擇，或者作為補(bǔ)充，甲基化沉默的檢測(cè)是通過(guò)將包含著含有基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這種內(nèi)切酶在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)處剪切，假如所述CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基被去甲基化的話，這樣沒(méi)有核酸分子的剪切發(fā)生提供了受測(cè)細(xì)胞中基因甲基化沉默的指示。例如，這種甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶是Acc II，Ava I，BssH II，BstU I，Hpa II或者Not I。
基因的甲基化沉默也可以這樣來(lái)檢測(cè)，將含有受測(cè)細(xì)胞中基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域與化學(xué)試劑接觸，所述化學(xué)試劑會(huì)選擇性地修飾未甲基化的或者甲基化的胞嘧啶殘基，并檢測(cè)由于所述接觸而產(chǎn)生的產(chǎn)物，其中該產(chǎn)物是作為基因上CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基甲基化的指示，由此檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞中基因的甲基化沉默。例如，這樣的產(chǎn)物可以通過(guò)電泳方法，色譜方法，質(zhì)譜方法，或者這些方法的組合來(lái)檢測(cè)。
在本方法的一個(gè)方面，所述化學(xué)試劑是肼，由此就會(huì)生成肼處理的基因5′端調(diào)控區(qū)域。這樣的方法可以進(jìn)一步包括將被肼處理的5′端調(diào)控區(qū)域與能夠剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑接觸，得到包含著含有基因的核酸分子的片斷的產(chǎn)物；按照分子量大小分離這些片斷；然后檢測(cè)在這個(gè)基因的5′端調(diào)控區(qū)域中已知含有胞嘧啶殘基的位置處的缺口，其中該缺口就是基因中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化的指示，由此便可檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中這個(gè)基因的甲基化沉默。用來(lái)剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑可以是例如哌啶。
在本方法的另一個(gè)方面，所述化學(xué)試劑包括亞硫酸氫根離子，由此在基因5’調(diào)控區(qū)中未甲基化的胞嘧啶殘基可被轉(zhuǎn)變?yōu)閬喠蛩釟潲}修飾的胞嘧啶殘基。這種方法可進(jìn)一步包括將亞硫酸氫根離子處理的基因暴露于堿性條件中，從而亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏埢?；然后檢測(cè)在受測(cè)細(xì)胞的亞硫酸氫根離子處理的基因的5’調(diào)控區(qū)中尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布，其中與暴露于堿性條件后相應(yīng)的亞硫酸氫根離子處理的未甲基化基因中尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布相比，受測(cè)細(xì)胞的基因5’調(diào)控區(qū)中尿嘧啶殘基數(shù)量或分布的減少指示所述的基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基存在甲基化，由此檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞所述基因的甲基化沉默。尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布可以通過(guò)例如測(cè)定在暴露于堿性條件后亞硫酸氫鹽修飾的基因5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列來(lái)檢測(cè)。作為選擇，或作為補(bǔ)充，尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布可以這樣來(lái)檢測(cè)，將暴露于堿性條件后的亞硫酸氫根離子處理的基因序列與寡聚核苷酸接觸，所述的寡聚核苷酸可選擇性地與含有尿嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)雜交，并檢測(cè)寡聚核苷酸的選擇性雜交。
用于這種方法中的寡聚核苷酸可以是，例如具有在SEQ ID NO23，24，111，112，115，116，119，120，125，126，129，130，133，134，139，140，143或144中所示的核苷酸序列的寡聚核苷酸。為了方便檢測(cè)，在一個(gè)方面，寡聚核苷酸可包括可檢測(cè)的標(biāo)記，因此提供了一種通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)選擇性雜交的方法?？蓹z測(cè)的標(biāo)記可以是可以方便地被檢測(cè)的任何標(biāo)記，包括，例如放射性同位素，順磁性同位素，發(fā)光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物，熒光化合物，金屬螯合物，酶，酶的底物，受體或受體的配體。在另一個(gè)方面，所述的寡聚核苷酸可以是引物延伸反應(yīng)的底物，其中所述的檢測(cè)選擇性雜交包括檢測(cè)引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物。例如，寡聚核苷酸(引物)可以是甲基化特異性引物，如具有在SEQ IDNO23，24，111，112，115，116，119，120，125，126，129，130，133，134，139，140，143或144中所示的核苷酸序列的寡聚核苷酸，其可選擇性地與含有SFRP1，SFRP2，SFRP4或SFRP5基因甲基化區(qū)的核苷酸序列雜交，并使其延伸。
尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布的檢測(cè)也可以這樣來(lái)檢測(cè)，例如將基因的5’調(diào)控區(qū)與含有正向和反向引物的擴(kuò)增引物對(duì)在適合擴(kuò)增的條件下接觸，其中所述引物對(duì)的至少一條引物含有可選擇性與含尿嘧啶殘基的5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列雜交的寡聚核苷酸，因而擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生指示在所述基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基甲基化，因此可檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞的基因的甲基化沉默。用于這種方法中的擴(kuò)增引物對(duì)的實(shí)例見(jiàn)表2和3，包括，例如在SEQ ID NO23和24，SEQ IDNOS111和112，SEQ ID NOS115和116，SEQ ID NOS119和120，SEQID NOS125和126，SEQ ID NOS129和130，SEQ ID NOS133和134，SEQ ID NOS139和140，或SEQ ID NOS143和144中所示的引物對(duì)，它們是可用于檢測(cè)SFRP1，SFRP2，SFRP4或SFRP5基因5’調(diào)控區(qū)甲基化的甲基化特異性引物。
另外，尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布的檢測(cè)可以這樣來(lái)檢測(cè)，將基因的5’調(diào)控區(qū)與含有正向和反向引物的擴(kuò)增引物對(duì)在適合擴(kuò)增的條件下接觸，其中所述引物對(duì)的兩條引物可選擇性地與含有胞嘧啶殘基的5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列雜交，但不與含尿嘧啶殘基的5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列雜交，因而擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生可指示在所述基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中缺少胞嘧啶殘基甲基化，因此可檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中基因的甲基化沉默?？捎糜谶@種方法中的擴(kuò)增引物對(duì)的實(shí)例見(jiàn)表2和3，包括，例如在SEQ ID NOS25和26，SEQ ID NOS113和114，SEQ ID NOS117和118，SEQ ID NOS121和122，SEQ ID NOS127和128，SEQ IDNOS131和132，SEQ ID NOS135和136，SEQ ID NOS141和142或SEQ ID NOS145和146中所示的引物對(duì)，它們是可用于檢測(cè)SFRP1，SFRP2，SFRP4或SFRP5基因5’調(diào)控區(qū)缺少甲基化的未甲基化特異性引物。
尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布的檢測(cè)也可以這樣來(lái)檢測(cè)，將基因的5’調(diào)控區(qū)與第一擴(kuò)增引物對(duì)和第二擴(kuò)增引物對(duì)在適合擴(kuò)增的條件下接觸，其中所述第一擴(kuò)增引物對(duì)含有一條正向引物和一條反向引物，其中所述第一引物對(duì)的至少一條引物含有可與含尿嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，其中所述第二擴(kuò)增引物對(duì)含有一條正向引物和一條反向引物，其中所述第二引物對(duì)的兩條引物可與含胞嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列選擇性雜交，但不與含尿嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)的對(duì)應(yīng)核苷酸序列雜交，其中如果由所述第一引物對(duì)可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的話，其具有第一長(zhǎng)度，其中如果由所述第二引物對(duì)可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的話，其具有與第一長(zhǎng)度不同的第二長(zhǎng)度，因而擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度可指示尿嘧啶殘基，因此可指示基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基的甲基化，因此可檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中基因的甲基化沉默。
與癌癥有關(guān)的基因的甲基化沉默的檢測(cè)也可以這樣來(lái)進(jìn)行，將受測(cè)細(xì)胞與脫甲基試劑接觸，然后檢測(cè)與未用脫甲基試劑接觸過(guò)的受測(cè)細(xì)胞中RNA的表達(dá)水平相比，由所述基因編碼的RNA的表達(dá)增加。這種方法可以進(jìn)一步包括檢測(cè)在相應(yīng)的表現(xiàn)出受控的生長(zhǎng)的細(xì)胞，或相應(yīng)細(xì)胞的提取物中所述基因5’調(diào)控區(qū)的CpG島中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化，如果存在的話。所述脫甲基試劑可以是甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如5-氮雜-2′-脫氧胞苷。RNA表達(dá)增加的檢測(cè)可應(yīng)用用于檢測(cè)RNA的任何方法進(jìn)行，包括，例如，northern印跡分析，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或與核苷酸序列陣列的選擇性雜交，如在此所公開(kāi)的。因此，本發(fā)明的方法可以高通量的形式實(shí)施，其中所述的受測(cè)細(xì)胞或受測(cè)細(xì)胞的提取物包括一系列受測(cè)細(xì)胞或受測(cè)細(xì)胞的提取物的一種，或其組合；而所述的一系列受測(cè)細(xì)胞或受測(cè)細(xì)胞的提取物中的每一份是相同的或不同的，或是其組合。根據(jù)實(shí)施本發(fā)明的高通量方法，受測(cè)細(xì)胞或受測(cè)細(xì)胞的提取物可被安排在陣列中，所述陣列可以是可尋址的陣列，其在固體支持物如微芯片，玻璃板或珠子上。
根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)研究的受測(cè)細(xì)胞可以是來(lái)自于細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞，例如已建立的細(xì)胞系或培養(yǎng)中的原代細(xì)胞，或可以包括從受試者例如人類受試者中獲得的樣本。這樣，所述樣本可以是器官樣本，組織樣本，或細(xì)胞樣本，例如消化道/胃腸道組織樣本，肝樣本，皮膚樣本，淋巴結(jié)樣本，腎樣本，肺樣本，肌肉樣本，骨樣本，或腦樣本。例如，胃腸道樣本可包括胃樣本，小腸樣本，結(jié)腸樣本，直腸樣本，或其組合。樣本也可包括一種生物流體樣本，例如骨髓，血液，血清，淋巴，腦脊液，唾液，痰液，糞便，尿液，或精液樣本，其中可含有細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物，特別是核酸分子。
本發(fā)明也涉及減緩或抑制細(xì)胞的無(wú)調(diào)控生長(zhǎng)的方法，所述細(xì)胞中至少一種與癌癥有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出表觀遺傳學(xué)上的沉默。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施，例如恢復(fù)由所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因編碼的多肽在所述細(xì)胞中的表達(dá)，由此減緩或抑制細(xì)胞的無(wú)調(diào)控生長(zhǎng)。這種表達(dá)的恢復(fù)例如可通過(guò)將細(xì)胞與脫甲基試劑(例如，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)，組蛋白脫乙酰酶抑制劑或其組合接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因是甲基化沉默基因，所述方法包括將細(xì)胞與至少一種脫甲基試劑接觸，例如與DAC接觸。在一個(gè)方面，細(xì)胞可在體外與脫甲基試劑接觸，例如在培養(yǎng)基中或其他有助于細(xì)胞生存的介質(zhì)中。如果需要，與脫甲基試劑接觸過(guò)的細(xì)胞可進(jìn)一步施予受試者。在另一個(gè)方面，所述試劑可以施予受試者，這樣，生長(zhǎng)不受調(diào)控的細(xì)胞可與該試劑接觸。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法包括將編碼所述多肽的多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)所述細(xì)胞中，這樣多肽可由所述多聚核苷酸表達(dá)出來(lái)，從而在細(xì)胞中恢復(fù)多肽的表達(dá)。所述多肽可以但不是必須包含在載體中，所述載體如病毒載體，和/或可以在可促進(jìn)多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞的基質(zhì)中進(jìn)行配制，如脂質(zhì)體或微泡?？梢酝ㄟ^(guò)將細(xì)胞與多聚核苷酸在體外接觸而將多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞中，在此情況下，含有多聚核苷酸的細(xì)胞可以但不是必須被施于受試者。也可以通過(guò)將細(xì)胞與多聚核苷酸在體內(nèi)接觸而可將多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞中。
表觀遺傳學(xué)沉默基因可以是采用在此所公開(kāi)的方法，檢測(cè)特定類型的細(xì)胞如特定類型的癌癥細(xì)胞而鑒定出的任何基因。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)沉默基因用在表1中所列的基因來(lái)例示，舉個(gè)例子，采用表4中所列的擴(kuò)增引物對(duì)(SEQ ID NOS149至296；例如，SEQ ID NOS149和150，或SEQ ID NOS151和152，等等)對(duì)由結(jié)直腸癌細(xì)胞中獲得的核酸分子進(jìn)行RT-PCR，可獲得包括表1中的基因的部分的GenBank登記的多聚核苷酸序列。結(jié)直腸癌細(xì)胞和/或胃癌細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)沉默基因的示例是PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1和SNRPN，它們并不顯示有可檢測(cè)到的基底表達(dá)，而用DAC處理時(shí)可重新表達(dá)，但用TSA處理不會(huì)重新表達(dá)；HOXA1，GRO3和DLX7，它們顯示有基底水平的表達(dá)，但在用DAC而不用TSA處理時(shí)其表達(dá)會(huì)增強(qiáng)；POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPPIR21A，F(xiàn)PGT和TRIM32，它們可被單獨(dú)使用的TSA上調(diào)，而它們的基底表達(dá)和在DAC處理下的上調(diào)在這些基因中有所不同。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種治療癌癥患者的方法，其中所述患者的癌細(xì)胞中表現(xiàn)有至少一種基因的表觀遺傳學(xué)沉默表達(dá)。這種方法可以通過(guò)例如恢復(fù)患者的癌細(xì)胞中一種或多種表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)來(lái)實(shí)施。例如，當(dāng)至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因是甲基化沉默基因時(shí)，可通過(guò)對(duì)受試者施予足以恢復(fù)受試者癌細(xì)胞中甲基化沉默基因表達(dá)的量的脫甲基試劑來(lái)治療患者。作為選擇，或作為補(bǔ)充，患者可以這樣來(lái)治療，對(duì)受試者施用至少一種多聚核苷酸，所述多聚核苷酸編碼由所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因中的一種或多種所編碼的至少一種多肽，并且施用量足以使所述的至少一種多肽在患者的癌細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)對(duì)患者施予多聚核苷酸時(shí)，多聚核苷酸可包含在載體(例如，病毒載體)中，所述載體優(yōu)選表達(dá)載體，和/或可以在可促進(jìn)靶癌細(xì)胞攝取多聚核苷酸的基質(zhì)中進(jìn)行配制(例如，在脂質(zhì)體中)。
根據(jù)本發(fā)明的方法要治療的癌癥可以是任何類型的癌癥，包括，例如癌(carcinoma)或肉瘤(sarcoma)。例如，其中所述的癌癥是結(jié)直腸癌，胃癌或結(jié)直腸癌和胃癌，患者的治療可通過(guò)恢復(fù)一種或多種表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述表觀遺傳學(xué)沉默基因包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPLl3，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT，TRIM32，其家族成員，或其組合。包括SFRP1，SFRP2，SFRP4和SFRP5在內(nèi)的SFRP基因提供了一個(gè)家族基因的實(shí)例，其中的一種或多種基因在結(jié)直腸癌，胃癌或兩者中被表觀遺傳學(xué)地沉默。
本發(fā)明也涉及一種為治療癌癥患者而選擇治療策略的方法。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施，例如，根據(jù)在此公開(kāi)的方法，鑒定至少一種與癌癥有關(guān)的甲基化沉默基因(即，將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除產(chǎn)物接觸，檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物與陣列上的一部分核苷酸序列之間的選擇性雜交)；然后選擇用于恢復(fù)一種或多種已被確定的甲基化沉默基因在患者癌細(xì)胞中的表達(dá)的試劑。例如，被選擇的試劑可以是編碼已被確定的甲基化沉默基因的多聚核苷酸，例如，編碼由PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3或DLX7基因，這樣的基因的家族成員，或這樣的基因的組合所編碼的多肽的多聚核苷酸。被選擇用于恢復(fù)甲基化沉默基因的表達(dá)的試劑也可以是脫甲基試劑如DAC。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療患有結(jié)直腸癌、胃癌或兩者的個(gè)體的方法，其中與所述癌癥有關(guān)的細(xì)胞含有至少一種甲基化沉默基因。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施，例如施予受試者可以恢復(fù)所述的至少一種甲基化沉默基因的表達(dá)的試劑，其量足以恢復(fù)所述的甲基化沉默基因在與所述癌癥有關(guān)的細(xì)胞中的表達(dá)。所述試劑可以是編碼所述的至少一種甲基化沉默基因的多聚核苷酸，例如，編碼由PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3和/或DLX7基因，其家族成員，或其組合所編碼的多肽的多聚核苷酸；所述試劑或者是一種脫甲基試劑如DAC。用于治療患有結(jié)直腸癌、胃癌或兩者的個(gè)體的試劑可與所述癌癥的細(xì)胞離體接觸，此后所述細(xì)胞可以被再施予患者；或者，所述試劑被施于患者癌細(xì)胞所在的部位。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分離的寡聚核苷酸，其具有在SEQ IDNOS1至296的任何一個(gè)中所示的核苷酸序列，還涉及多種分離的寡聚核苷酸，其包括在SEQ ID NOS1至296中所示的分離的寡聚核苷酸中的至少兩種。另外，本發(fā)明涉及擴(kuò)增引物對(duì)，其包括在SEQ ID NOS1至296中所示的一條正向引物和一條反向引物(如，SEQ ID NOS1和2，SEQ ID NOS3和4，SEQ ID NOS5和6，等等)，其中所述擴(kuò)增引物對(duì)可以擴(kuò)增在表1中所列的基因的核苷酸序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明的擴(kuò)增引物對(duì)可以用來(lái)特異地?cái)U(kuò)增核酸分子的甲基化的5’調(diào)控區(qū)，這樣的擴(kuò)增引物對(duì)的示例是SEQ ID NOS23和24，SEQ ID NOS111和112，SEQ ID NOS115和116，SEQ ID NOS119和120，SEQ IDNOS125和126，SEQ ID NOS129和130，SEQ ID NOS133和134，SEQ ID NOS139和140或SEQ ID NOS143和144，它們可擴(kuò)增具有甲基化的5’調(diào)控區(qū)的SFRP家族成員。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的擴(kuò)增引物對(duì)可以用來(lái)特異地?cái)U(kuò)增核酸分子的未甲基化的5’調(diào)控區(qū)，這樣的擴(kuò)增引物對(duì)的示例是SEQ ID NOS25和26，SEQ ID NOS113和114，SEQ ID NOS117和118，SEQ ID NOS121和122，SEQ ID NOS127和128，SEQ ID NOS131和132，SEQ ID NOS135和136，SEQ IDNOS141和142或SEQ ID NOS145和146，它們可擴(kuò)增具有未甲基化的5’調(diào)控區(qū)的SFRP家族成員。
本發(fā)明還涉及試劑盒，它含有本發(fā)明的至少一種分離的寡聚核苷酸，包括例如多種這樣的分離的寡聚核苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒中的多種分離的寡聚核苷酸包括至少一對(duì)擴(kuò)增引物(即，一條正向引物和一條反向引物)，還可以包括多對(duì)擴(kuò)增引物，包括例如在表2，表3和/或表4中所示的擴(kuò)增引物對(duì)。因此，本發(fā)明的試劑盒可以含有，例如一種或多種甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)，未甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)，或甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)和未甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)的組合，其包括用于擴(kuò)增特定基因的甲基化形式或未甲基化形式的甲基化特異性引物對(duì)和未甲基化特異性引物對(duì)，所述的特定基因已知是或懷疑是在一種或多種類型癌癥細(xì)胞中被甲基化沉默的基因。
本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步包括有用的其他試劑，例如與所述試劑盒的寡聚核苷酸用于共同目的的試劑。例如，當(dāng)試劑盒中含有一種或多種甲基化特異和/或未甲基化特異的擴(kuò)增引物對(duì)時(shí)，所述試劑盒可以進(jìn)一步含有例如對(duì)照多聚核苷酸，其可以是甲基化或未甲基化的；還可以含有一種或多種修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑，和/或一種或多種用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。當(dāng)所述試劑盒中含有一種或多種可與甲基化或未甲基化的基因序列選擇性雜交的多聚核苷酸時(shí)，所述試劑盒中可以進(jìn)一步含有例如甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶。


圖1總結(jié)了在不同來(lái)源的一系列人類癌癥細(xì)胞系中，選自組1a(見(jiàn)表1)的6個(gè)基因的甲基化特異PCR(MSP)分析。基因的名稱標(biāo)示在上側(cè)，細(xì)胞系的名稱標(biāo)示在左側(cè)。黑框表示完全甲基化，灰框和空白框分別表示部分的甲基化和沒(méi)有甲基化?！癗D”表示沒(méi)有被測(cè)定(因?yàn)槿鄙費(fèi)SP中的擴(kuò)增)。
圖2總結(jié)了在124個(gè)原發(fā)性CRC樣本中，SFRP基因的MSP分析(見(jiàn)實(shí)施例1)。基因的名稱表示在上面。每行代表一種原發(fā)性CRC腫瘤?；铱蚝涂瞻卓蚍謩e表示甲基化和沒(méi)有甲基化。
發(fā)明詳述 本發(fā)明是基于開(kāi)發(fā)用于鑒定在細(xì)胞基因組例如癌癥細(xì)胞基因組中的表觀遺傳學(xué)沉默基因的方法。本方法的示例是鑒定在結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞中的74種表觀遺傳學(xué)沉默基因，包括由于甲基化和/或組蛋白脫乙?；饔枚怀聊幕?。如在此所公開(kāi)的，揭示了腫瘤特征(tumor profiling)的模式，其通過(guò)鑒定CRC和胃癌(GC)中SFRP1，SEZ6L，LPPHI和CXX1基因的甲基化沉默來(lái)例示。這樣的腫瘤特征可以延伸至SFRP1基因的相關(guān)家族成員，其中，在CRC和GC中，也檢測(cè)到SFRP2，SFRP4和SFRP5的高度甲基化(SFRP3在5’調(diào)控區(qū)缺少CpG島)。因此，本發(fā)明提供了鑒定與癌癥有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因的方法，并進(jìn)一步提供了檢測(cè)與基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)沉默有關(guān)的癌癥的方法，治療患有這樣的癌癥的患者的方法，和用于實(shí)施這些方法的組合物。
基因啟動(dòng)子的異常的高度甲基化被認(rèn)為是癌癥中與腫瘤抑制基因的失活相關(guān)的主要機(jī)制。轉(zhuǎn)錄的沉默是由甲基化和/或組蛋白脫乙酰酶(HDAC)活性介導(dǎo)的，而甲基化是主要的。如在此所公開(kāi)的，基于cDNA微陣列的分析被用來(lái)篩選人類CRC中的表觀遺傳學(xué)沉默基因。對(duì)超過(guò)10,000個(gè)基因進(jìn)行的篩選鑒定出大量的表觀遺傳學(xué)沉默基因，包括數(shù)種啟動(dòng)子高度甲基化的(即，甲基化沉默的)基因和其它啟動(dòng)子未甲基化的基因，對(duì)于后者，其表達(dá)的增加是通過(guò)HDAC抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)的(見(jiàn)實(shí)例1)。通過(guò)許多這樣的高度甲基化的基因的預(yù)測(cè)的功能或染色體位置，確定了它們?cè)谀[瘤發(fā)生中的地位，從而確定了所公開(kāi)的方法的有效性。鑒定了優(yōu)選在CRC和GC中高度甲基化的一組基因，包括SFRP1基因，如在此所公開(kāi)的，它所屬于的基因家族在CRC中也是頻繁地被高度甲基化的。除了說(shuō)明腫瘤抑制基因功能喪失的機(jī)制以外，本結(jié)果還提供了可檢測(cè)基本上所有的CRC的一系列分子標(biāo)記(見(jiàn)圖2)。
癌癥的進(jìn)展不僅與遺傳決定的基因功能改變有關(guān)，而且與表觀遺傳學(xué)決定的基因功能改變有關(guān)。后者涉及基因啟動(dòng)子中異常的高度甲基化的CpG島，伴隨著基因轉(zhuǎn)錄的喪失。為了隨機(jī)篩選癌癥基因組以鑒定這樣的基因座，已經(jīng)花費(fèi)了很大的努力來(lái)識(shí)別這種啟動(dòng)子甲基化。這些搜索策略，包括在高頻率雜合性喪失(LOH)的區(qū)域和在整個(gè)基因組內(nèi)鑒定CpG島的高度甲基化，均被證明可用于鑒定腫瘤特異的高度甲基化的CpG島。然而，也會(huì)受到一些問(wèn)題的困擾，如鑒定了一些與基因啟動(dòng)子無(wú)關(guān)的位點(diǎn)，所使用的CpG島亞類的甲基化敏感限制性位點(diǎn)的潛在偏差，或在很多島中缺乏位點(diǎn)和/或一旦鑒定發(fā)生變化的基因座，需要費(fèi)力地搜索附近的基因。
通過(guò)將基因表達(dá)狀態(tài)(expression status)和表觀遺傳學(xué)調(diào)控結(jié)合在一起，目前公開(kāi)的微陣列策略避免了以前的方法的劣勢(shì)。而且，該方法利用了以下的觀察結(jié)果，即癌癥中高度甲基化基因的沉默可能依賴于致密的CpG島甲基化和HDAC活性(Cameron等，Nature Genet.21103-107，1999，在此整入以供參考)。如采用結(jié)腸癌細(xì)胞所例示的，所公開(kāi)的方法有效地鑒定出一些新基因，其轉(zhuǎn)錄的抑制在腫瘤發(fā)生中具有重要作用。令人注目的是，所公開(kāi)的基因組篩選方法可鑒定集中于特定腫瘤類型的基因高度甲基化事件，可同時(shí)涉及一個(gè)基因家族的多個(gè)成員(實(shí)例1)。
因此，提供了鑒定表觀遺傳學(xué)沉默基因的方法，例如鑒定與癌癥有關(guān)的甲基化沉默基因的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定與至少一種癌癥有關(guān)的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因的方法。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“至少一種”的含義是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。例如，所公開(kāi)的微陣列方法鑒定了74個(gè)基因，它們?cè)诮Y(jié)直腸癌中是表觀遺傳學(xué)沉默的。而且，已確定的是，被鑒定為在CRC中表觀遺傳學(xué)沉默的幾種基因也是在胃癌細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)沉默的。正是這樣，該方法鑒定了與CRC和/或GC有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默的基因。
術(shù)語(yǔ)“表觀遺傳學(xué)上被沉默”或“表觀遺傳學(xué)沉默的”，當(dāng)用于基因時(shí)是指未被轉(zhuǎn)錄的基因，或被轉(zhuǎn)錄的水平與對(duì)應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞(如，正常細(xì)胞)中該基因的轉(zhuǎn)錄水平相比是減少的，這是由不同于遺傳改變的一種機(jī)制導(dǎo)致的?；虺聊谋碛^遺傳學(xué)機(jī)制是為人所熟知的，包括，例如基因5’調(diào)控區(qū)CpG島中CpG二核苷酸的高度甲基化，以及由于例如組蛋白乙?；瘜?dǎo)致的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，這樣基因的轉(zhuǎn)錄減少或被抑制。檢測(cè)一種基因的表觀遺傳學(xué)沉默的方法在此被公開(kāi)，包括，例如在細(xì)胞與一種可緩解表觀遺傳學(xué)沉默的試劑例如脫甲基試劑接觸后，檢測(cè)基因的再表達(dá)(再活化)，其中所述的沉默是由高度甲基化導(dǎo)致的。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“甲基化”或“高度甲基化”，當(dāng)用于基因時(shí)，其含義是指與所述基因相關(guān)的CpG島中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基在5’位置被甲基化，即5′-甲基胞嘧啶。在此所使用的術(shù)語(yǔ)“甲基化狀態(tài)”是指相對(duì)豐度，包括在CpG島中CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的存在或缺少。通常，CpG島中的胞嘧啶殘基在轉(zhuǎn)錄活性基因中是未甲基化的，因此，在CpG島中檢測(cè)到甲基化胞嘧啶殘基表明基因的表達(dá)減少或被抑制。因此，如上所討論的，在此所提到的“甲基化沉默的”基因是指基因不被轉(zhuǎn)錄，或與在對(duì)應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞(通常是正常細(xì)胞)中所述基因的轉(zhuǎn)錄水平相比，其轉(zhuǎn)錄的水平降低，這是由于基因5’調(diào)控區(qū)的CpG島中CpG二核苷酸的高度甲基化。甲基化沉默基因表達(dá)的結(jié)果是含有該基因的細(xì)胞中該基因編碼的多肽(即，基因產(chǎn)物)水平降低，或完全缺乏，這樣在該細(xì)胞中正常由該基因產(chǎn)物所提供的功能降低或缺少。
鑒定與癌癥有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因的方法可以這樣來(lái)進(jìn)行，例如在適合于核酸扣除產(chǎn)物與陣列的互補(bǔ)核苷酸序列選擇性雜交的條件下，將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除產(chǎn)物(即，對(duì)應(yīng)于在用至少一種可以重新激活表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)的試劑接觸過(guò)的癌細(xì)胞中表達(dá)的，但不在所述癌細(xì)胞的對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子)接觸；并檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物和陣列的一部分核苷酸序列的選擇性雜交，其中對(duì)應(yīng)于在所述癌細(xì)胞的對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子在所述的適合于雜交的條件下并不與所述的這部分核苷酸序列雜交，因此與陣列的這部分核苷酸序列選擇性雜交的核酸扣除產(chǎn)物代表了癌細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)沉默基因(見(jiàn)實(shí)施例1)。所提到的細(xì)胞的“對(duì)應(yīng)于RNA的核酸分子”的含義是RNA如mRNA或polyA+RNA，利用來(lái)自細(xì)胞的RNA作為模板產(chǎn)生的cDNA，或利用RNA或cDNA作為模板產(chǎn)生的cRNA。為了實(shí)施本發(fā)明的方法，與細(xì)胞的RNA對(duì)應(yīng)的核酸分子通?？杀豢商綔y(cè)地標(biāo)記，例如用放射性同位素，順磁性同位素，發(fā)光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物，金屬螯合物，酶，酶底物，受體或受體的配體；或能夠例如利用可檢測(cè)到的標(biāo)記探針來(lái)檢測(cè)，這樣核酸分子和陣列的核苷酸序列的雜交可被檢測(cè)到。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“代表基因組的核苷酸序列陣列”的含義是有組織的一組核苷酸序列與固體支持物相連接，例如，與一種微芯片或玻璃板相連接，其中所述的序列可特異地和選擇性地與在細(xì)胞中表達(dá)的核酸分子雜交。陣列的選擇是以要被檢測(cè)的細(xì)胞所來(lái)源的生物體和/或要被檢測(cè)的一種或多種組織為基礎(chǔ)。通常，陣列代表一種真核細(xì)胞或細(xì)胞類型的基因組，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞類型，優(yōu)選是人類細(xì)胞，包括一種或多種組織的細(xì)胞，如果需要的話(如，結(jié)直腸上皮細(xì)胞)。通常，“代表”基因組的探針陣列可鑒定細(xì)胞中至少大約10％的表達(dá)核酸，一般至少大約20％或40％，通常是大約50％至70％，典型地是至少大約80％或90％，特別是95％至99％，或細(xì)胞或生物體的更多的表達(dá)核酸分子。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到的是，代表的核酸分子越多，本發(fā)明的方法就越可能鑒定在癌癥中表觀遺傳學(xué)上沉默的所有基因。含有代表特定基因組的核苷酸序列的陣列可應(yīng)用熟知的方法進(jìn)行制備，或從商業(yè)渠道中購(gòu)得(如，Invitrogen Corp.；Affymetrix)，其實(shí)例為在本研究(實(shí)施例1)中被應(yīng)用的Human GeneFiltersTM微陣列，ReleaseII，陣列(Research Genetics；現(xiàn)在是Invitrogen Corp.的子公司)。
可重新激活表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)的試劑可以是甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(如，5-氮雜-2′-脫氧胞苷；DAC)，組蛋白脫乙酰酶抑制劑(如，曲古抑菌素A；TSA)，或試劑組合如DAC和TSA的組合?？梢詮募?xì)胞例如用這樣的試劑處理過(guò)的癌癥細(xì)胞中分離出RNA，將該RNA或該RNA的cDNA產(chǎn)物與來(lái)自于未用所述試劑處理過(guò)的相應(yīng)細(xì)胞(如，癌癥細(xì)胞)的RNA分子接觸，在此條件下，僅在處理過(guò)的細(xì)胞中表達(dá)的RNA(或cDNA)可以被分離，由此獲得核酸扣除產(chǎn)物。進(jìn)行核酸扣除反應(yīng)的方法是為人熟知的(Hedrick等，Nature 308149-155，1984，在此整入以供參考)，執(zhí)行這種方法的試劑盒可從商業(yè)渠道中購(gòu)得(如，Gibco/BRL；見(jiàn)實(shí)施例1)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以有至少一種(例如，1，2，3，4，5或更多種)表觀遺傳學(xué)沉默的基因與至少一種(例如，1，2，3或更多種)癌癥有關(guān)。所述癌癥可以是，例如一種癌(carcinoma)或肉瘤(sarcoma)，包括一種或多種特定類型的癌癥，例如，消化道/胃腸道癌癥，肝癌，皮膚癌，乳癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病，腎癌，肺癌，肌肉癌，骨癌或腦癌。與癌癥有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因在此的例示是在表1中所列舉的基因(提供了GenBank注冊(cè)號(hào)；見(jiàn)，例如互聯(lián)網(wǎng)URL″ncbi.nlm.nih.gov″)，它們與CRC和/或GC有關(guān)。關(guān)于表1，在CRC細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)上沉默的而又能通過(guò)細(xì)胞與DAC的接觸而被重新激活的基因(即，甲基化沉默基因)的例示是PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3和DLX7；可以通過(guò)癌癥細(xì)胞與TSA的接觸而被重新的表觀遺傳學(xué)沉默基因的例示是POR1，MBNL，TRADD，PDIP RAD23B，RPL13，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT和TRIM32。而且，如在此所公開(kāi)的，已鑒定出的表觀遺傳學(xué)沉默基因的相關(guān)家族成員也可被表觀遺傳學(xué)沉默，包括，例如SFRP2，SFRP4和SFPR5，它們與SFRP1相關(guān)，它們單獨(dú)或它們的組合與124個(gè)受測(cè)CRC樣本的123個(gè)相關(guān)(見(jiàn)實(shí)施例1；圖2)。
與正常的未甲基化的基因啟動(dòng)子區(qū)中CpG二核苷酸的異常DNA甲基化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的沉默是在腫瘤發(fā)生中被最廣泛研究的表觀遺傳學(xué)異常。由甲基-CpG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)錄輔阻遏物，染色質(zhì)重構(gòu)蛋白和組蛋白脫乙酰酶組成的蛋白復(fù)合體與高度甲基化的DNA區(qū)域的結(jié)合可導(dǎo)致染色質(zhì)處于轉(zhuǎn)錄抑制(沉默)的狀態(tài)。在真核細(xì)胞中，緊接著鳥嘌呤核苷殘基5’端的胞嘧啶殘基的甲基化主要發(fā)生在CG含量低的區(qū)域。相反，CpG島通常在正常細(xì)胞中保持未甲基化狀態(tài)，除了在X染色體失活和親代的特異性印記的過(guò)程中，其中5’調(diào)控區(qū)的甲基化與轉(zhuǎn)錄的抑制有關(guān)。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)基因的從頭甲基化已經(jīng)在一小部分視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中證明(Sakai等，Am.J.Hum.Genet.48880，1991)，VHL基因的異常甲基化在一組散發(fā)性腎細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919700-9704，1994)。腫瘤抑制基因的表達(dá)也可被正常的未甲基化的5’CpG島的重新DNA甲基化所消除(見(jiàn)，例如，Issa等，Nature Genet.7536，1994；Merlo等，NatureMed.1686，1995；Herman等，Cancer Res.56722，1996)。
啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島的異常甲基化還與癌癥的進(jìn)一步發(fā)展有關(guān)。比如在造血細(xì)胞腫瘤中，E-鈣依粘連蛋白(Graff等，Cancer Res.555195-5199，1995)，DAP激酶(Katzenellenbogen等，Blood934347-4353，1999)，和細(xì)胞周期調(diào)控子p15INK4B和p16INK4A的過(guò)度甲基化都與基因的失活相關(guān)(Herman等，Cancer Res.57837-841 1997；Melki等，Blood 953208-3213，2000；Ng等，Clin.Canc.Res.71724-1729，2001)。由于過(guò)度甲基化導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄沉默還在CDKN2A基因(Herman等，Cancer Res.554525-4530，1995)，MGMT(Esteller等，Cancer Res.59793-797，1999)，和MLH1基因(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA956870-6875，1998)中發(fā)現(xiàn)。
染色體17p13.3位置的CpG島的過(guò)度甲基化在多種常見(jiàn)類型的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)(Makos等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891929，1992；Makos等，Cancer Res.532715，1993；Makos等，Cancer Res.532719，1993)，而且在腦癌，結(jié)腸癌和眼癌中還與17p丟失和p53突變的時(shí)間和頻率一致。與正常非甲基化啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的過(guò)度甲基化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄沉默向我們展示了不同于編碼區(qū)突變機(jī)制的另外一種使腫瘤抑制基因失活的機(jī)制(Baylin等，Cancer Cells 3383，1991；Jones和Buckley，Adv.Cancer Res.541-23，1990)。這種變化還與VHL，染色體3p上一種腎癌腫瘤抑制基因(Herman等，supra，1994)，染色體6q上的雌激素受體基因(Ottaviano等，Cancer Res.542552，1994)和染色體11p上的H19基因(Steenman等，Nature Genetics，7433，1994)的表達(dá)丟失相關(guān)。SOCS-1基因的表達(dá)的甲基化沉默與多種癌癥有關(guān)，包括肝細(xì)胞癌，多發(fā)性骨髓瘤和急性白血病(Yoshikawa等，Nat.Genet.2829-35，2001，在此整入以供參考)。
因此，本發(fā)明提供了通過(guò)在受測(cè)細(xì)胞中檢測(cè)如表1所示的至少一種基因或其組合的表觀遺傳學(xué)沉默來(lái)鑒定生長(zhǎng)不受調(diào)控或有此傾向的細(xì)胞的方法。例如，所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因可以是PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT或TRIM32基因，或這些基因的組合。生長(zhǎng)不受調(diào)控或有此傾向的細(xì)胞可以是一種贅生性細(xì)胞，其可以是，例如一種惡化前的細(xì)胞如胃腸道息肉細(xì)胞，或可以是一種癌癥細(xì)胞，例如癌細(xì)胞如結(jié)直腸癌細(xì)胞或胃癌細(xì)胞，或肉瘤細(xì)胞。
在一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法一部分需要比較待測(cè)細(xì)胞中基因的甲基化狀態(tài)與正常生長(zhǎng)的細(xì)胞中對(duì)應(yīng)的基因的甲基化狀態(tài)。此處所使用的名詞“對(duì)應(yīng)的”是指參考材料，通過(guò)它就可以比較待測(cè)材料。一般地，參考材料提供一個(gè)對(duì)照或者標(biāo)準(zhǔn)讓待測(cè)材料具有可比性。比如，對(duì)于一個(gè)待測(cè)其甲基化狀態(tài)的SFRP基因，參照一個(gè)對(duì)應(yīng)的非甲基化的SFRP基因，就是指待測(cè)甲基化狀態(tài)的SFRP基因的類型與非甲基化SFRP基因的類型相同，比如，待測(cè)基因和對(duì)應(yīng)的非甲基化基因都是人類SFRP1基因。對(duì)于待測(cè)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，參考一個(gè)對(duì)應(yīng)的正常生長(zhǎng)的細(xì)胞一般是指參考正常的細(xì)胞，即其細(xì)胞周期和生長(zhǎng)方式具有健康個(gè)體中該類細(xì)胞所具有的特征的細(xì)胞，這樣，如果待測(cè)細(xì)胞被認(rèn)為是一種CRC細(xì)胞，那么對(duì)應(yīng)的細(xì)胞可以是例如正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞。
本發(fā)明中的方法在實(shí)踐的時(shí)候需要的樣本包括待測(cè)細(xì)胞，或者是待測(cè)細(xì)胞的抽提物，其含有所述細(xì)胞的核酸分子，特別是基因組DNA，它們包括所有或者部分用來(lái)檢測(cè)甲基化狀態(tài)的基因的5’端調(diào)控區(qū)域的CpG島。一般地，待測(cè)細(xì)胞是那些被懷疑已經(jīng)失去生長(zhǎng)控制的細(xì)胞，比如被懷疑具有損傷的活組織檢查樣本，或者是與惡化前或者惡化以后的細(xì)胞接近的細(xì)胞或者是曾經(jīng)與之接近的細(xì)胞，如從一個(gè)被懷疑是損傷部位的周圍一塊地方或者幾塊地方取下來(lái)的細(xì)胞樣本，這樣的待測(cè)細(xì)胞可以提供例如外科手術(shù)需要進(jìn)行到什么程度的信息，或者是一些從外科手術(shù)邊緣收集的細(xì)胞樣本，這樣的待測(cè)細(xì)胞可以用于檢測(cè)癌癥是否已經(jīng)完全摘除，或者是檢測(cè)癌癥是否已經(jīng)重生。
根據(jù)本發(fā)明的方法研究的待測(cè)細(xì)胞也可以是來(lái)自于生物體并進(jìn)行了培養(yǎng)的原代細(xì)胞，其目的可以是例如為了建立具有實(shí)質(zhì)上和建立培養(yǎng)物的細(xì)胞來(lái)源一樣的特性的原代細(xì)胞培養(yǎng)物，或者是出于為了能夠重新施用于生物體而治療和/或擴(kuò)增細(xì)胞的目的。例如，結(jié)腸上皮細(xì)胞可以從一個(gè)患有CRC的病人的身上獲得，其中所述細(xì)胞的一個(gè)或者更多個(gè)基因的表達(dá)表現(xiàn)出與癌癥相關(guān)的甲基化沉默。這些培養(yǎng)中的細(xì)胞可以用一種或者更多種試劑處理，以檢測(cè)這些試劑使沉默的基因恢復(fù)表達(dá)的能力，進(jìn)而提供一種鑒定可以用于治療該癌癥病人或者另外一個(gè)患有以一種或者更多種同樣的基因的甲基化沉默為特征的CRC的病人的藥物的方法。
待測(cè)細(xì)胞可以用臨床上通常用來(lái)獲得含有細(xì)胞的樣本的任何方式從生物體上獲得。比如，待測(cè)細(xì)胞(或者含有這些待測(cè)細(xì)胞的樣本)可以通過(guò)活組織檢查程序獲得，例如對(duì)含有待測(cè)細(xì)胞的器官或者組織進(jìn)行活體穿刺取樣。這樣，待測(cè)細(xì)胞可以從各種樣本中獲取，例如胃腸道樣本(如，息肉活檢)，肝樣本，骨髓樣本，皮膚樣本，淋巴結(jié)樣本，腎樣本，肺樣本，肌肉樣本，骨樣本，腦樣本或類似樣本。待測(cè)細(xì)胞也可以是生物流體的成分，例如，血液，淋巴，腦脊液，唾液，痰，糞便，尿或精液。如果合適的話，待測(cè)細(xì)胞也可以通過(guò)灌洗來(lái)得到，比如要從結(jié)腸，子宮，腹腔，或者類似的地方獲取樣品，或者可以通過(guò)抽吸來(lái)獲得，比如要獲得骨髓樣本。
本發(fā)明中的方法在實(shí)踐時(shí)也可以使用待測(cè)細(xì)胞的提取物，其中所述提取物包括待測(cè)細(xì)胞的核酸分子，特別是基因組DNA，其中的待測(cè)基因中包含全部或者部分CpG島。所述提取物可以是粗提取物，包括例如含有待測(cè)細(xì)胞的組織的凍溶樣本；也可以包括部分提純的基因組DNA，其可能含有例如核基質(zhì)的成分；或者可以包括基本純化的基因組DNA，其可以是例如用蛋白酶處理和乙醇沉淀后得到的。在某些具體實(shí)施方案中，待測(cè)細(xì)胞還可以是包埋在石蠟中的組織切片樣本的成分。
由于表觀遺傳學(xué)沉默包括甲基化沉默，因此用來(lái)鑒定細(xì)胞是否表現(xiàn)出或者易于表現(xiàn)出生長(zhǎng)失控的方法可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中一個(gè)或者多個(gè)目標(biāo)基因的甲基化來(lái)實(shí)施。基因的CpG島中的CpG二核苷酸的甲基化可以通過(guò)各種各樣已知的檢測(cè)核酸分子甲基化的方法來(lái)檢測(cè)。這樣的方法包括讓基因與一種或者一系列可以選擇性的修飾非甲基化的胞嘧啶殘基或者是甲基化的胞嘧啶殘基但不會(huì)對(duì)兩者均起作用的化學(xué)試劑接觸，這樣甲基化修飾的存在與否就可以被檢測(cè)；將基因序列與一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶接觸，這種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)中含有CpG二核苷酸，然后就可以用這種內(nèi)切酶來(lái)剪切含有或者缺乏甲基化胞嘧啶殘基的CpG位點(diǎn)，但不能夠在兩種情況下都能夠剪切，這樣這些序列的剪切是否發(fā)生就可以被檢測(cè)到；或者將包含基因的核酸分子與能夠與該基因序列選擇性雜交的寡聚核苷酸探針，引物或者擴(kuò)增引物對(duì)接觸，這樣也可以用來(lái)確定是否有CpG甲基化的存在。這里提供了運(yùn)用這些方法的一些例子，并且這些方法的一些修改和變動(dòng)也本技術(shù)領(lǐng)域是已知的。
目標(biāo)基因的甲基化可以這樣來(lái)檢測(cè)，例如，將含有包含該基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，這種對(duì)甲基化敏感的內(nèi)切酶在含有其胞嘧啶殘基被甲基化的CpG二核苷酸的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)上剪切，這樣，該核酸分子的剪切就可以作為指示甲基化，也就是待測(cè)細(xì)胞中這個(gè)基因甲基化沉默的標(biāo)志。甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶是眾所周知的，例如有Acc III，Ban I，BstNI，Msp I和Xma I。作為選擇或者作為補(bǔ)充，甲基化沉默也可以這樣來(lái)檢測(cè)，將包含著含有基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，這種內(nèi)切酶在含有其胞嘧啶殘基被甲基化的CpG二核苷酸的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)處剪切，倘若CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基被去甲基化的話，這樣核酸分子沒(méi)有發(fā)生剪切便是待測(cè)細(xì)胞中該基因甲基化沉默的指示。這樣的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶的例子是Acc II，Ava I，BssH II，BstU I，Hpa II，或者Not I。
檢測(cè)包含目標(biāo)基因序列的核酸分子被甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶剪切的發(fā)生與否可以通過(guò)任何一種有效的檢測(cè)多聚核苷酸序列長(zhǎng)度或者連貫性的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。比如，目標(biāo)基因序列的斷裂可以通過(guò)Southern印跡分析來(lái)確定，這種方法允許對(duì)剪切位點(diǎn)進(jìn)行作圖，或者用其他電泳方法或者色譜方法，這些方法可以基于相對(duì)大小，電荷，或者是二者的組合來(lái)分離核酸分子。目標(biāo)基因的剪切還可以通過(guò)寡聚核苷酸連接分析來(lái)檢測(cè)，其中，在核酸分子與限制性內(nèi)切酶接觸之后，設(shè)計(jì)有兩個(gè)寡聚核苷酸，第一個(gè)寡聚核苷酸與限制性內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)上游且相鄰的位置選擇性雜交，第二個(gè)寡聚核苷酸與限制性內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)的下游且相鄰的位置選擇性雜交，然后將這兩個(gè)寡聚核苷酸與目標(biāo)基因接觸，并進(jìn)一步與連接酶接觸，如果沒(méi)有剪切發(fā)生，那么兩個(gè)相鄰的寡聚核苷酸分子就可以被連接到一起，而在剪切發(fā)生的情況下，連接不發(fā)生。通過(guò)測(cè)定連接反應(yīng)之后的寡聚核苷酸分子的大小或者是其他參數(shù)，被連接的寡聚核苷酸分子就會(huì)與沒(méi)有連接的寡聚核苷酸分子區(qū)別開(kāi)來(lái)，因此也就提供了一種指示限制性內(nèi)切酶活性的方法。
基因的甲基化沉默也可以通過(guò)將包含待測(cè)細(xì)胞基因的核酸分子的5’端調(diào)控區(qū)域與可以選擇性的修飾非甲基化或者甲基化的胞嘧啶殘基的化學(xué)試劑接觸，然后檢測(cè)這樣接觸之后的產(chǎn)物，其中這種產(chǎn)物就是指示該基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基是否甲基化的標(biāo)記，這樣也就達(dá)到了檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞中基因的甲基化沉默的目的。例如，這種產(chǎn)物可以通過(guò)電泳方法，色譜方法，質(zhì)譜方法，或者是這些方法的組合來(lái)檢測(cè)。
在這種實(shí)施方案的一個(gè)方面，用可以修飾胞嘧啶殘基但卻不能夠修飾甲基化的胞嘧啶殘基的肼與基因接觸，然后再將經(jīng)過(guò)肼處理的基因序列與一種可以在被肼處理的胞嘧啶殘基處剪切核酸分子的試劑接觸，比如哌啶，這樣就會(huì)產(chǎn)生包括片斷的產(chǎn)物。根據(jù)分子量來(lái)分離這些片斷，例如可以利用電泳方法，色譜方法，或者質(zhì)譜方法來(lái)分離，然后再與經(jīng)過(guò)相同處理的對(duì)應(yīng)的非甲基化的基因序列的分離模式比對(duì)，待測(cè)基因上在某些位置出現(xiàn)的缺口就說(shuō)明這個(gè)基因含有甲基化的胞嘧啶殘基。這樣，缺口的存在就是待測(cè)細(xì)胞中目標(biāo)基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基甲基化的一個(gè)指示。
在另外一個(gè)方面，含有目標(biāo)基因的核酸分子與含有亞硫酸氫根離子的化學(xué)試劑接觸，比如亞硫酸氫鈉，它可以將沒(méi)有甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)變成亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基，然后再將經(jīng)過(guò)亞硫酸氫根離子處理過(guò)的基因序列暴露在堿性環(huán)境中，這樣亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基又被轉(zhuǎn)變成尿嘧啶殘基。亞硫酸氫鈉可以快速地與胞嘧啶的5，6-雙鍵反應(yīng)(但與甲基化的胞嘧啶反應(yīng)很慢)，形成磺化胞嘧啶反應(yīng)中間產(chǎn)物，這種中間產(chǎn)物非常易于進(jìn)行脫氨反應(yīng)，而形成磺化尿嘧啶。這樣，如果將磺化尿嘧啶暴露于堿性環(huán)境中就可以去除磺基，結(jié)果形成尿嘧啶。然后這些DNA分子又可以被擴(kuò)增，例如通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，接著再測(cè)序以確定所有CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。在PCR反應(yīng)中，Taq聚合酶將尿嘧啶識(shí)別作胸腺嘧啶，結(jié)果PCR的產(chǎn)物只有在起始模板DNA含有5-甲基化胞嘧啶的位置才有胞嘧啶。通過(guò)比較待測(cè)細(xì)胞中被亞硫酸氫根離子處理過(guò)的基因序列與經(jīng)過(guò)相同處理的對(duì)應(yīng)的沒(méi)有甲基化的基因序列之間的尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布，檢測(cè)到待測(cè)細(xì)胞中基因的尿嘧啶殘基數(shù)量或者分布的減少就說(shuō)明待測(cè)細(xì)胞中目標(biāo)基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基上發(fā)生了甲基化。尿嘧啶的數(shù)量或者分布也可以通過(guò)將經(jīng)過(guò)亞硫酸氫根離子處理，再暴露在堿性環(huán)境中的目標(biāo)基因序列與可以選擇性的與含有或者缺少尿嘧啶殘基的目標(biāo)基因的核苷酸序列雜交的寡聚核苷酸接觸，然后檢測(cè)與寡聚核苷酸分子的選擇性雜交(或者是沒(méi)有雜交發(fā)生)。
在這里提到的“選擇性的雜交”或者“選擇性地進(jìn)行雜交”或者“特異性雜交”是指兩個(gè)核酸分子在一般嚴(yán)緊或者高度嚴(yán)緊的條件下發(fā)生穩(wěn)定的相互作用。這樣，選擇性雜交比較偏向于在寡聚核苷酸和目標(biāo)核酸分子雜交，而基本上不在寡聚核苷酸和非目標(biāo)核酸分子的核酸分子之間發(fā)生，包括與編碼基因家族中相關(guān)但不同的成員的核酸分子之間也不發(fā)生。一般地，可以用作與目標(biāo)核酸分子選擇性雜交的探針或者引物的寡聚核苷酸在長(zhǎng)度上至少有大約12到15個(gè)核苷酸，一般是大約18到20核苷酸長(zhǎng)度，常用的是至少21到25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，特殊情況下會(huì)是26到35個(gè)核苷酸長(zhǎng)度或者更長(zhǎng)?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明方法的寡聚核苷酸的實(shí)例在此公開(kāi)，如SEQ ID NOS1至296(見(jiàn)表2，3和4)。
適合于選擇性雜交的條件可以通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，或者可以估計(jì)，比如，基于要雜交的寡聚核苷酸和目標(biāo)核酸分子的相對(duì)GCAT(或者GCAU)含量，雜交寡聚核苷酸的長(zhǎng)度，雜交的寡聚核苷酸分子和目標(biāo)序列之間的錯(cuò)配數(shù)目(如果有的話)(參見(jiàn)，比如Sambrook等，″Molecular CloningA laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress 1989))。這樣，被用來(lái)獲得特定的嚴(yán)緊水平的雜交條件會(huì)隨著雜交的核酸分子的性質(zhì)而改變。需要額外考慮的是核酸分子是否被固定化了，比如固定在濾膜上。逐步增高的嚴(yán)緊條件的例子如下2XSSC/0.1％SDS在大約室溫條件下(雜交條件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大約室溫條件下(低嚴(yán)緊條件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大約42攝氏度條件下(一般嚴(yán)緊條件)；0.1XSSC在大約62攝氏度條件下(高嚴(yán)緊條件)。雜交和/或洗滌可以在其中一種條件下進(jìn)行，比如高嚴(yán)緊條件，或者其中的每一個(gè)條件都被使用，例如，每個(gè)條件進(jìn)行10到15分鐘，按上面列出的順序，重復(fù)列出的這些步驟的任何一個(gè)或者所有的步驟。
寡聚核苷酸與目標(biāo)基因(比如表1中所列基因)的選擇性雜交可以通過(guò)讓寡聚核苷酸帶上可檢測(cè)的標(biāo)記這樣的方法來(lái)檢測(cè)。這些可檢測(cè)的標(biāo)記可以是任何一種能夠方便地與寡聚核苷酸連接的分子，而且還可以用容易獲得的儀器來(lái)檢測(cè)。比如，這種可檢測(cè)的標(biāo)記可以是一種熒光化合物比如Cy3，Cy5，F(xiàn)am，熒光黃，羅丹明，或者綠色熒光蛋白，或者是其增強(qiáng)型或者改進(jìn)型；放射性原子核如硫-35，technicium-99，磷-32，氘或者碘-125；順磁旋轉(zhuǎn)標(biāo)記如碳-13，Gd-17，Mn-55，Dy-162，Cr-52，或者Fe-52；發(fā)光物質(zhì)如發(fā)光蛋白；化學(xué)發(fā)光物質(zhì)；金屬螯合劑；一種酶如熒光素酶或者β-半乳糖苷酶，或者是酶底物；或者是一種受體或受體的配體，比如生物素。檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記的方法是根據(jù)標(biāo)記的性質(zhì)來(lái)選擇的，同樣將標(biāo)記連接到寡聚核苷酸上的方法也是如此(參見(jiàn)，比如，Hermanson，″Bioconjugate Techniques″(Academic Press 1996)，其在此被整入以供參考)。
例如，選擇性雜交的檢測(cè)也可以利用寡聚核苷酸作為引物延伸反應(yīng)的底物，進(jìn)一步讓樣本在足夠使引物延伸反應(yīng)進(jìn)行的條件下與脫氧核糖核苷酸(dNTPs)接觸，如果需要的話，這些脫氧核糖核苷酸可以包括可檢測(cè)的dNTP(比如一種熒光標(biāo)記的dNTP，一種地高辛配體標(biāo)記的dNTP，或者是一種生物素標(biāo)記的dNTP)，另外還要有DNA依賴型的DNA聚合酶，接著就可以檢測(cè)引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物。進(jìn)行引物延伸反應(yīng)的條件在本領(lǐng)域是已知的(參見(jiàn)，比如，Sambrook等，如上，1989)。
包含目標(biāo)基因序列的核酸分子經(jīng)過(guò)亞硫酸氫根離子處理，接著暴露在堿性環(huán)境中之后，檢測(cè)其中尿嘧啶的數(shù)量或者分布也可以通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)比如PCR來(lái)實(shí)現(xiàn)。擴(kuò)增反應(yīng)是在適合于擴(kuò)增引物對(duì)的正向引物和反向引物與目標(biāo)核酸分子選擇性雜交的條件下進(jìn)行的。一般地，反應(yīng)是在含水緩沖溶液中進(jìn)行的，pH在7～9之間，常常pH是大約8。另外，反應(yīng)一般在引物的摩爾量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目標(biāo)核酸分子的情況下進(jìn)行的，比如引物∶基因組DNA的摩爾比例約為100∶1。當(dāng)樣本中目標(biāo)核酸分子的量不知道的時(shí)候，比如在一個(gè)診斷程序中用到的生物樣本，這時(shí)就可以用一定范圍的引物量加到樣本中做平行實(shí)驗(yàn)，雖然一般即使很少量的引物加到樣本中也可以形成足夠的摩爾逾量而使得這樣的擴(kuò)增反應(yīng)可以繼續(xù)。
足量的三磷酸脫氧核糖核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP可以單獨(dú)也可以混合在一起加到合成反應(yīng)混合物中，如果混在一起加入的話，還可以進(jìn)一步包括引物，最后溶液需要加熱到90～100攝氏度，維持大約1到10分鐘，優(yōu)選是1到4分鐘。經(jīng)過(guò)這段加熱期之后，溶液需要冷卻到室溫，這樣更有利于引物的雜交。往冷卻下來(lái)的混合物中加入影響引物延伸反應(yīng)的合適的試劑，一般是一種聚合酶，接著反應(yīng)就可以在這里公開(kāi)的條件下(參見(jiàn)實(shí)施例1)進(jìn)行或者是按照本領(lǐng)域已知的條件進(jìn)行。如果聚合酶是熱穩(wěn)定的，那么它還可以與其它試劑一起被加入。聚合酶可以是任何一種用來(lái)指導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物的合成的酶，比如包括E.coli DNA聚合酶I，E.coli DNA聚合酶I的Klenow片斷，T4 DNA聚合酶，其它可獲得的DNA聚合酶，聚合酶的突變蛋白，反轉(zhuǎn)錄酶，或者其他酶，包括熱穩(wěn)定酶，它們?cè)诒绢I(lǐng)域都是熟知的而且可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得。擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物是否甲基化可以通過(guò)測(cè)序方法，寡聚物限制性分析(Saiki等，BioTechnology 31008-1012，1985)，等位基因特異性寡聚核苷酸探針?lè)治?Conner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80278，1983)，寡聚核苷酸連接反應(yīng)分析(Landegren等，Science 2411077，1988)，以及類似的方法(也請(qǐng)參見(jiàn)，Landegren等，Science 242229-237，1988)來(lái)檢測(cè)。
在一種實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是通過(guò)將目標(biāo)基因序列(例如列在表1中的基因)在適合于擴(kuò)增的條件下與包括正向引物和反向引物的擴(kuò)增引物對(duì)接觸來(lái)進(jìn)行的，其中該引物對(duì)中至少有一個(gè)引物包含可以與含有尿嘧啶殘基的目標(biāo)基因序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，因而擴(kuò)增產(chǎn)物的生成就是待測(cè)細(xì)胞中目標(biāo)基因的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化的標(biāo)記。在另外一種實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是通過(guò)將目標(biāo)基因序列在適合于擴(kuò)增的條件下與包括正向引物和反向引物的擴(kuò)增引物對(duì)接觸來(lái)進(jìn)行的，但其中該引物對(duì)的兩個(gè)引物都能夠與含有胞嘧啶殘基的目標(biāo)基因序列選擇性雜交，而不與含有尿嘧啶殘基的目標(biāo)基因序列雜交，因而擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的生成就是待測(cè)細(xì)胞中目標(biāo)基因的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基非甲基化的標(biāo)記。
在又另外一個(gè)實(shí)施方案中，甲基化特異性的擴(kuò)增反應(yīng)比如甲基化特異性PCR(MSP)可以單獨(dú)使用或者與亞硫酸氫鹽處理組合使用，從而檢測(cè)核酸分子的甲基化狀態(tài)(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,265,171；6,200,756；和6,017,704，其中每一篇都在此整入以供參考；也可參見(jiàn)實(shí)施例1)。MSP是一種特別靈敏的方法，可以用來(lái)檢測(cè)數(shù)目很少的甲基化等位基因，而且只需要使用很少量的核酸樣本，包括石臘包埋的材料，該方法還可以方便地在多重分析中采用，比如包括，在單個(gè)樣本中同時(shí)檢測(cè)甲基化和非甲基化產(chǎn)物，這樣就可以提供一個(gè)內(nèi)標(biāo)。
在MSP反應(yīng)中使用的擴(kuò)增引物對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)之后可以特異性地區(qū)分未經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的或未經(jīng)修飾的DNA，甲基化的和非甲基化的DNA。針對(duì)非甲基化DNA的MSP引物對(duì)(非甲基化特異性引物對(duì))一般在3’-CpG對(duì)中具有胸腺嘧啶殘基以區(qū)別于甲基化DNA中保留的胞嘧啶，對(duì)于反義引物則采用互補(bǔ)序列來(lái)設(shè)計(jì)。MSP引物對(duì)的序列中常常含有相對(duì)少量的胞嘧啶或者鳥嘌呤殘基，這是由于在正義(正向)引物中缺乏胞嘧啶，而在反義(反向)引物中缺乏鳥嘌呤所致；胞嘧啶被修飾之后成為尿嘧啶，而尿嘧啶在擴(kuò)增產(chǎn)物中是作為胸腺嘧啶來(lái)擴(kuò)增的。MSP未甲基化(MSP(U))特異引物對(duì)和MSP甲基化(MSP(M))特異引物對(duì)的例子見(jiàn)表2和3。例如，可用于這樣的方法的擴(kuò)增引物對(duì)包括，例如，在SEQ ID NO23和24，SEQ ID NOS111和112，SEQ ID NOS115和116，SEQ ID NOS119和120，SEQ IDNOS125和126，SEQ ID NOS129和130，SEQ ID NOS133和134，SEQID NOS139和140或SEQ ID NOS143和144中所示的引物對(duì)，它們是用于檢測(cè)SFRP1，SFRP2，SFRP4或SFRP5基因5’調(diào)控區(qū)的甲基化的甲基化特異性引物；在SEQ ID NOS25和26，SEQ ID NOS113和114，SEQ ID NOS117和118，SEQ ID NOS121和122，SEQ ID NOS127和128，SEQ ID NOS131和132，SEQ ID NOS135和136，SEQ ID NOS141和142或SEQ ID NOS145和146中所示的引物對(duì)，它們是用于檢測(cè)SFRP1，SFRP2，SFRP4或SFRP5基因5′調(diào)控區(qū)中缺少甲基化的未甲基化特異性引物?？紤]到例示出的甲基化特異和未甲基化特異引物對(duì)，和含有表1中所列舉的靶基因的部分的核苷酸序列的可利用性，要理解的是，可用于擴(kuò)增如表1中列舉的甲基化或未甲基化的基因或其他已鑒定的靶基因，以及與列舉出的基因相關(guān)的家族成員如SFRP家族成員的其他甲基化特異和未甲基化特異引物對(duì)很容易被制備。
因此，一方面，MSP被用來(lái)檢測(cè)經(jīng)亞硫酸氫根離子處理并接著進(jìn)行堿處理的目標(biāo)基因中的尿嘧啶殘基的數(shù)量和分布。這樣的方法可以這樣來(lái)實(shí)施，將基因序列與第一引物對(duì)和第二引物對(duì)在適合于擴(kuò)增的條件下接觸，其中第一擴(kuò)增引物對(duì)含有一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物，該第一引物對(duì)中的至少一個(gè)引物包含可以與含有尿嘧啶殘基的目標(biāo)基因的核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，而第二擴(kuò)增引物對(duì)含有一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物，該第二引物對(duì)的兩個(gè)引物都能夠與含有胞嘧啶殘基的目標(biāo)基因選擇性雜交，而不與含有尿嘧啶殘基的目標(biāo)基因序列雜交，這樣由第一引物對(duì)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物(如果有的話)會(huì)有一個(gè)第一長(zhǎng)度，而由第二引物對(duì)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物(如果有的話)會(huì)有一個(gè)第二長(zhǎng)度，其不同于第一長(zhǎng)度，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度就是一種指示尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布的標(biāo)記，這樣，待測(cè)細(xì)胞中目標(biāo)基因的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化也就可以通過(guò)這個(gè)方法來(lái)檢測(cè)。
尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布也可以這樣來(lái)檢測(cè)，將基因的5’端調(diào)控區(qū)域與第一引物對(duì)和第二引物對(duì)在適合于擴(kuò)增的條件下接觸，其中第一擴(kuò)增引物對(duì)含有一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物，該第一引物對(duì)中的至少一個(gè)引物包含可以與含有尿嘧啶殘基的基因5’端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，而第二擴(kuò)增引物對(duì)含有一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物，該第二引物對(duì)的兩個(gè)引物都能夠與含有胞嘧啶殘基的基因5’端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列選擇性雜交，而不與含有尿嘧啶殘基的基因5’端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列雜交，這樣由第一引物對(duì)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物(如果有的話)會(huì)有一個(gè)第一長(zhǎng)度，而由第二引物對(duì)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物(如果有的話)會(huì)有一個(gè)第二長(zhǎng)度，其不同于第一長(zhǎng)度，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度就是一種指示尿嘧啶殘基并因而指示基因5’端調(diào)控區(qū)域的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化的標(biāo)記，由此可以檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞中基因的甲基化沉默。
在表現(xiàn)出或者被懷疑表現(xiàn)出失去控制的生長(zhǎng)的細(xì)胞中的基因的甲基化沉默(比如，一種癌癥相關(guān)的基因)的檢測(cè)也可以這樣進(jìn)行，將待測(cè)細(xì)胞與一種脫甲基化試劑接觸，然后再與沒(méi)有用脫甲基化試劑接觸過(guò)的待測(cè)細(xì)胞中RNA的表達(dá)水平比較，檢測(cè)由這個(gè)基因編碼的RNA的表達(dá)量增加。這樣的方法可以進(jìn)一步包括檢測(cè)表現(xiàn)出正常生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)細(xì)胞或者對(duì)應(yīng)細(xì)胞的提取物中基因的5’端調(diào)控區(qū)域的CpG島中的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化(如果有的話)。脫甲基化試劑可以是甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑如DAC。RNA表達(dá)量的增加可以用任何一種檢測(cè)RNA的方法來(lái)檢測(cè)，例如包括RNA點(diǎn)雜交分析，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析，或者與核苷酸序列陣列的選擇性雜交，如在此所公開(kāi)的。相應(yīng)地，本發(fā)明的這些方法也可以以高通量的形式進(jìn)行，其中待測(cè)細(xì)胞或者待測(cè)細(xì)胞的提取物包括多份待測(cè)細(xì)胞的一份或者待測(cè)細(xì)胞的提取物，或者是其組合；所述的多份待測(cè)細(xì)胞中的每一份，或者所述的多份待測(cè)細(xì)胞的提取物可以是相同的或者不同的，或者是其組合。
在將本發(fā)明的方法應(yīng)用于高通量的形式時(shí)，待測(cè)細(xì)胞或者待測(cè)細(xì)胞的抽提物可以被安排在一個(gè)陣列上，這種陣列可以是一種可追蹤的(addressable)陣列，可以在一個(gè)固體支持物如微芯片，玻璃板，或者玻璃珠上，細(xì)胞(或者提取物)可以順序地或者是平行地與寡聚核苷酸探針或者引物(或者引物對(duì))接觸，如在此所公開(kāi)的。安排在陣列中的樣本或者是安排成其它可再現(xiàn)形式的樣本可以被指定地址(即，陣列上的位置)，這樣就利于確定樣本的來(lái)源。將樣本排列成陣列特別是可尋址陣列的另外一個(gè)好處是可以用自動(dòng)化系統(tǒng)對(duì)一個(gè)或者多個(gè)樣本在不同時(shí)間增加或者去除試劑，或者是為特定的樣本加入不同的試劑。除了可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的好處之外，這樣的高通量分析還能夠提供檢測(cè)單個(gè)樣本的兩份等份，三份等份，或者更多等份的手段，這樣可以增加獲得的結(jié)果的合理性，而且還可以在和待測(cè)樣本同樣的條件下檢測(cè)對(duì)照樣本，從而為比較不同分析的結(jié)果提供了內(nèi)標(biāo)。方便的是，陣列上某個(gè)位置的細(xì)胞或者抽提物可以與兩種或者更多種寡聚核苷酸探針或者引物(或者引物對(duì))接觸，其中所述寡聚核苷酸是被不同地標(biāo)記的或者是包括產(chǎn)生可區(qū)別的產(chǎn)物的反應(yīng)，從而提供了一種進(jìn)行多重分析的手段。這樣的分析可以允許檢測(cè)一個(gè)或者多個(gè)，尤其是2，3，4，5，10，15，20或者更多個(gè)基因，以鑒定待測(cè)細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)沉默基因。
本發(fā)明也提供用作鑒定表觀遺傳學(xué)沉默基因(或者鑒定這些基因的缺乏)的探針或者引物的寡聚核苷酸。在這里被使用的術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”，“多聚核苷酸”或者“核酸分子”是指一段由兩個(gè)或者更多脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸組成，由磷脂鍵連接起來(lái)的序列。這里提到的“基因”是指包含在基因組中的一段多聚核苷酸序列。然而，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，包含基因的一部分的核酸分子可以從細(xì)胞中分離出來(lái)或者作為基因組DNA被研究，比如通過(guò)雜交反應(yīng)或者PCR反應(yīng)。因此，在基因組中，也許并不清楚某個(gè)基因在哪一個(gè)特定的核苷酸位置起始或者結(jié)束，對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，對(duì)于在此被鑒定和/或研究的各種基因，基因可以被認(rèn)為是不連續(xù)的(discrete)核酸分子，它至少包括GenBank注冊(cè)號(hào)列在表1中的核苷酸序列。
為了討論的方便，這里用到的術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”是指用作探針或者引物的多聚核苷酸，而使用更加廣泛的術(shù)語(yǔ)“多聚核苷酸”或者“核酸分子”則是包含了具有兩個(gè)或者多個(gè)核苷酸的任何序列，包括寡聚核苷酸。另外，術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”是指存在于陣列上的分子。因此，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，這里使用的各種術(shù)語(yǔ)可以方便地區(qū)分不同的核酸分子。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括了RNA和DNA，其可以是一個(gè)基因或者是基因的一部分，cDNA，合成的多聚脫氧核糖核酸序列，或者類似的分子。一般地，寡聚核苷酸或者多聚核苷酸可以是單鏈也可以是雙鏈，還可以是DNA/RNA雜交分子，然而應(yīng)該注意的是，用來(lái)作為探針或者引物的雙鏈寡聚核苷酸的兩條鏈在使用的時(shí)候需要分開(kāi)，比如通過(guò)加熱含有寡聚核苷酸的溶液到高于特定寡聚核苷酸的熔點(diǎn)。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”，“多聚核苷酸”和類似物包括自然發(fā)生的核酸分子，這些核酸分子可以從細(xì)胞中分離，也可以是比如通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化之后得到的片斷，還可以是合成的分子，比如這些分子可以通過(guò)化學(xué)合成的方法或者酶學(xué)方法如PCR來(lái)制備。在各種各樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸可以包含核苷或者核苷酸類似物，或者其骨架鍵不是磷酯鍵，比如是硫酯鍵，硫代磷酸鍵，類似肽鍵的鍵或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠連接核苷生成合成的多聚核苷酸的其它任何化學(xué)鍵(參見(jiàn)，比如，Tam等，Nucl.Acids Res.22977-986，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology13351-360，1995，每個(gè)文獻(xiàn)在此整入以供參考)。非自然發(fā)生的核苷類似物或者連接核苷或類似物的非自然發(fā)生的連接鍵的整入在該多聚核苷酸要暴露于可能含有核酸水解活性的環(huán)境中時(shí)特別有用，這些環(huán)境包括例如組織培養(yǎng)液，細(xì)胞或者存活個(gè)體，因?yàn)檫@種被修飾的多聚核苷酸可以被設(shè)計(jì)成對(duì)于降解較不敏感(假如需要的話，也可以設(shè)計(jì)成對(duì)于降解更加敏感)。
一般地，組成多聚核苷酸的核苷酸是自然發(fā)生的脫氧核糖核苷酸，比如腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤或者胸腺嘧啶連接到2’-脫氧核糖上，或者是核糖核苷酸，比如腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤或者尿嘧啶連接到核糖上。盡管如此，多聚核苷酸(或者寡聚核苷酸)也可以包含核苷酸類似物，包括非自然發(fā)生的合成的核苷酸或者被修飾過(guò)的自然發(fā)生的核苷酸。這些核苷酸類似物在本領(lǐng)域是已知的，而且可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得，含有這些核苷酸類似物的多聚核苷酸也是如此(Lin等，Nucl.Acids Res.225220-5234，1994；Jellinek等，Biochemistry3411363-11372，1995；Pagratis等，Nature Biotechnol.1568-73，1997，每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考)。
包含自然發(fā)生的核苷酸和磷酯鍵的多聚核苷酸可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備或者用合適的多聚核苷酸作為模板通過(guò)DNA重組方法來(lái)制備。與此相比，包含核苷酸類似物或者非磷酯鍵的共價(jià)鍵的多聚核苷酸一般都通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)制備，盡管某些酶如T7聚合酶可以將某些類型的核苷酸類似物整合到多聚核苷酸中，并因而被用來(lái)由一個(gè)合適的模板來(lái)重組合成這樣一段多聚核苷酸(Jellinek等，如上，1995)。這樣，多聚核苷酸可以通過(guò)例如傳統(tǒng)的磷酸三酯方法和磷酸二酯方法的方法來(lái)制備，比如，包括例如使用二乙基磷酸脒的自動(dòng)化方法(參見(jiàn)，Beaucage等，Tetrahedron Lett.，221859-1862，1981)，或者一種在被修飾的固體支持物上進(jìn)行的寡聚核苷酸合成方法(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,458,066)。
本發(fā)明的可以選擇性地與目標(biāo)核酸分子雜交且可以作為檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)和/或甲基化(或者甲基化缺乏；“非甲基化”)的試劑的寡聚核苷酸被設(shè)計(jì)成與目標(biāo)基因上游(5’)或者下游(3’)大約2000個(gè)核苷酸之內(nèi)的核苷酸序列選擇性雜交，一般是在大約1000個(gè)核苷酸的區(qū)域內(nèi)，這些區(qū)域含有需要檢測(cè)胞嘧啶甲基化的CpG島，更常見(jiàn)的是在大約500個(gè)核苷酸內(nèi)的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。另外，如上面所說(shuō)明的，本發(fā)明的寡聚核苷酸，或者對(duì)于本發(fā)明的方法有用的寡聚核苷酸，在長(zhǎng)度上至少要有大約12個(gè)核苷酸，一般至少是大約14或15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通常是大約18到20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，也可以是大約25，30，35或者更多的核苷酸，這樣它可以選擇性地與目標(biāo)核酸分子雜交(參見(jiàn)，例如表2，3和4)。需要注意的是，寡聚核苷酸的長(zhǎng)度會(huì)部分地依賴于目標(biāo)基因。比如，當(dāng)目標(biāo)基因是由含有相似性非常高的區(qū)域的緊密相關(guān)的基因組成的家族的一員時(shí)，使用更長(zhǎng)的寡聚核苷酸可以保證其與目標(biāo)基因的選擇性雜交，而最小化與相關(guān)基因序列的交互雜交，如果有的話。
本發(fā)明中的寡聚核苷酸被設(shè)計(jì)成與對(duì)應(yīng)于基因組的基因座的雙鏈核酸分子的至少一條鏈基本互補(bǔ)(當(dāng)間插序列要被擴(kuò)增時(shí)，則是與雙鏈的每條鏈互補(bǔ))，這些寡聚核苷酸被用于區(qū)分甲基化或者非甲基化的胞嘧啶殘基時(shí)，會(huì)包含一定量的鳥嘌呤和胞嘧啶，正如上述討論的一樣。本發(fā)明的寡聚核苷酸的實(shí)例是下列的擴(kuò)增引物對(duì)，1)用于靶基因核苷酸序列的RT-PCR的引物對(duì)(見(jiàn)，例如，表4，SEQ ID NOS149至296)；2)用于靶基因核苷酸序列的甲基化特異或未甲基化特異擴(kuò)增的引物對(duì)(見(jiàn)，例如，表2，其中的MSP(M)表示甲基化特異引物對(duì)(如，SEQ ID NOS3和4)，MSP(U)表示未甲基化特異引物對(duì)(如，SEQ ID NOS5和6)，也見(jiàn)表3)；或3)用于亞硫酸氫鹽PCR的引物對(duì)(見(jiàn)，例如，表2，SEQ ID NOS1和2)。
因此，本發(fā)明提供了選自SEQ ID NOS1至296中的任何一個(gè)的寡聚核苷酸，并進(jìn)一步提供了多個(gè)這樣的寡聚核苷酸，其包括SEQ IDNOS1至296所示的寡聚核苷酸中的至少兩個(gè)(例如，2，3，4，5或更多個(gè))，其中所述的擴(kuò)增引物對(duì)可擴(kuò)增表1所列的基因的核苷酸序列，在某些情況下，擴(kuò)增依賴于例如靶序列是否甲基化。本發(fā)明也提供了一種擴(kuò)增引物對(duì)，它含有一條正向引物和一條反向引物，特別是含有SEQ ID NOS1至296的寡聚核苷酸中的一個(gè)，特別是兩個(gè)，其可以是表2，3和4中所示的引物對(duì)中的一條正向引物，一條反向引物，或兩條引物(例如，SEQ ID NOS1和2，SEQ ID NOS3和4；SEQ ID NOS5和6，等等)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的擴(kuò)增引物對(duì)可用來(lái)特異地?cái)U(kuò)增核酸分子的甲基化5’調(diào)控區(qū)，這種擴(kuò)增引物對(duì)的示例是SEQ ID NOS23和24，SEQ ID NOS111和112，SEQ ID NOS115和116，SEQ ID NOS119和120，SEQ ID NOS125和126，SEQ ID NOS129和130，SEQ ID NOS133和134，SEQ ID NOS139和140或SEQ ID NOS143和144，它們可擴(kuò)增具有甲基化5’調(diào)控區(qū)的SFRP家族成員(見(jiàn)表2和3)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的擴(kuò)增引物對(duì)可用來(lái)特異地?cái)U(kuò)增核酸分子的未甲基化的5’調(diào)控區(qū)，這種擴(kuò)增引物對(duì)的示例是SEQ ID NOS25和26，SEQ IDNOS113和114，SEQ ID NOS117和118，SEQ ID NOS121和122，SEQID NOS127和128，SEQ ID NOS131和132，SEQ ID NOS135和136，SEQ ID NOS141和142或SEQ ID NOS145和146，它們可擴(kuò)增具有未甲基化的5’調(diào)控區(qū)的SFRP家族成員(見(jiàn)表2和3)。
本發(fā)明還涉及試劑盒，其中包括至少一種分離的本發(fā)明的寡聚核苷酸，包括例如多種這樣的分離的寡聚核苷酸。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒的多種分離的寡聚核苷酸包括至少一個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)(即，一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物)，也可以包括多個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)，包括，例如在表2，表3和/或表4中所示的擴(kuò)增引物對(duì)。這樣，本發(fā)明的試劑盒可以包括，例如，一個(gè)或者多個(gè)甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)，非甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)，或者甲基化特異性引物對(duì)和非甲基化特異性引物對(duì)的組合，這種組合包含用來(lái)擴(kuò)增特定基因的甲基化形式或者非甲基化形式的甲基化特異性引物對(duì)和非甲基化特異性引物對(duì)，所述特定基因已知或者被懷疑在一種或者多種類型的癌癥細(xì)胞中被甲基化沉默。
本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步包含額外的試劑，它們是很有用的，例如，確保所述試劑盒中的寡聚核苷酸能夠更好地使用。例如，當(dāng)試劑盒含有一種或者多種甲基化特異性和/或非甲基化特異性擴(kuò)增引物時(shí)，該試劑盒可以進(jìn)一步包括例如可以被甲基化的或者非甲基化的對(duì)照寡聚核苷酸；一種或者更多種可以修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑，和/或一種或更多種用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。如果試劑盒包含一種或者多種能夠與甲基化或者非甲基化基因序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，那么試劑盒還可以進(jìn)一步包括，例如，甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明的試劑盒還可以包括至少第二引物對(duì)，它可以是但不一定是上述所列引物對(duì)中的一種，它可以用來(lái)進(jìn)行例如巢式擴(kuò)增反應(yīng)。這些額外的引物對(duì)可以基于目標(biāo)基因的擴(kuò)增部位的期望序列，利用依據(jù)目標(biāo)基因的相關(guān)GenBank注冊(cè)號(hào)所獲得的序列信息(參見(jiàn)表1)來(lái)設(shè)計(jì)。
在一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有一對(duì)甲基化特異性引物和一對(duì)非甲基化特異性引物，它們的特異性都是針對(duì)同一個(gè)目標(biāo)基因，因而使用該試劑盒的用戶可以確定某個(gè)特定目標(biāo)基因是否甲基化。在另外一種實(shí)施方案中，試劑盒含有多對(duì)這樣的甲基化特異性和非甲基化特異性引物，因而用戶就可以確定一個(gè)或者更多個(gè)目標(biāo)基因的甲基化。例如，這樣的試劑盒可含有在SEQ ID NOS3和4中所示的引物對(duì)(見(jiàn)表2；MSP(M))和在SEQ ID NOS5和6中所示的引物對(duì)(表2；MSP(U))，由此提供了用于確定S100A10基因的5’調(diào)控區(qū)是否甲基化的擴(kuò)增引物對(duì)(也見(jiàn)，GenBank注冊(cè)號(hào)AA44051；表1)。甲基化和/或未甲基化特異性引物對(duì)的其它組合可根據(jù)表2和3來(lái)確定，由此提供的試劑盒可以測(cè)定不同基因和/或例如SFRP基因家族的一個(gè)基因家族的不同成員的甲基化狀態(tài)。這樣的試劑盒可進(jìn)一步包含一個(gè)引物對(duì)，其包括可與利用甲基化特異或未甲基化特異性引物對(duì)所產(chǎn)生的所期望的擴(kuò)增產(chǎn)物選擇性雜交的寡聚核苷酸，由此提供了可用于進(jìn)行巢式擴(kuò)增程序的試劑。
本發(fā)明的試劑盒還可以包括一種能夠連接或者整合到試劑盒中的寡聚核苷酸上的可檢測(cè)的標(biāo)記，或者多種不同的可檢測(cè)的標(biāo)記，這樣用戶就可以根據(jù)需要為特定的應(yīng)用選擇合適的標(biāo)記，而且如有需要的話，還可以包括將可檢測(cè)標(biāo)記連接或者整合到寡聚核苷酸上所需的試劑。作為選擇或者作為補(bǔ)充，試劑盒可以包含一種或者多種用于進(jìn)行雜交反應(yīng)的試劑，這樣選擇性雜交的條件就可以很快的獲得；和/或者可以包括一種或者多種標(biāo)準(zhǔn)核酸分子，例如含有甲基化胞嘧啶殘基的標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)SFRP1核苷酸序列，其對(duì)應(yīng)于SFRP1上寡聚核苷酸選擇性雜交的區(qū)域，或者所述的標(biāo)準(zhǔn)核酸分子是對(duì)應(yīng)于目標(biāo)序列的含有非甲基化胞嘧啶殘基的標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)SFRP1核苷酸序列，或者是二者的組合。這樣的標(biāo)準(zhǔn)具有數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括，例如，可以確認(rèn)用待測(cè)細(xì)胞或其抽提物進(jìn)行的反應(yīng)是否正確有效，或者可以用來(lái)比較不同時(shí)間檢測(cè)的樣本或者收集于不同來(lái)源的樣本。
當(dāng)試劑盒含有一種或者多種用來(lái)進(jìn)行引物延伸(或者擴(kuò)增)反應(yīng)的寡聚核苷酸，那么試劑盒可以進(jìn)一步包括用于進(jìn)行選擇性雜交反應(yīng)的試劑，以使所述寡聚核苷酸可以作為延伸反應(yīng)的底物；和/或一種或多種用于進(jìn)行引物延伸(或擴(kuò)增)反應(yīng)的試劑，比如，dNTPs，其中的一種或者多種可以被可檢測(cè)的標(biāo)記標(biāo)記或者為了方便地連接上可檢測(cè)的標(biāo)記而被修飾；一種或者一系列的多聚酶；和/或一種或多種標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)核酸分子。如果本發(fā)明的試劑盒含有兩種或者更多種寡聚核苷酸(或者引物對(duì))，例如在此例示的或者其它可以用于實(shí)踐本發(fā)明的方法的寡聚核苷酸，那么試劑盒可以提供一系列方便來(lái)源的試劑，有了這些，技術(shù)人員就可以根據(jù)自己的需要選擇一種或者多種寡聚核苷酸(或者引物對(duì))。
本發(fā)明也涉及一種減緩或者抑制表現(xiàn)出至少一種與癌癥相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄在表觀遺傳學(xué)上沉默的細(xì)胞的失控生長(zhǎng)的方法。例如，這種方法可以通過(guò)恢復(fù)由表觀遺傳學(xué)沉默基因編碼的多肽在細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)實(shí)施，這樣就可以減緩或者抑制細(xì)胞的失控生長(zhǎng)。例如，所述的表達(dá)恢復(fù)可以通過(guò)將細(xì)胞與脫甲基化試劑，組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或者二者的組合接觸來(lái)完成。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因是甲基化沉默基因，所述方法包括將細(xì)胞與至少一種脫甲基試劑接觸，例如與DAC接觸。在一個(gè)方面，細(xì)胞可在體外與脫甲基試劑接觸，例如在培養(yǎng)基中或其他有助于細(xì)胞生存的介質(zhì)中。如果需要，與脫甲基試劑接觸過(guò)的細(xì)胞可進(jìn)一步施予受試者。在另一個(gè)方面，所述試劑可以施予受試者，這樣，生長(zhǎng)不受調(diào)控的細(xì)胞可與該試劑接觸。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法包括將編碼所述多肽的多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)所述細(xì)胞中，這樣多肽可由所述多聚核苷酸表達(dá)出來(lái)，從而在細(xì)胞中恢復(fù)多肽的表達(dá)。所述多肽可以但不是必須包含在載體中，所述載體如病毒載體，和/或可以在可促進(jìn)多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞的基質(zhì)中進(jìn)行配制，如脂質(zhì)體或微泡。可以通過(guò)將細(xì)胞與多聚核苷酸在體外接觸而將多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞中，在此情況下，含有多聚核苷酸的細(xì)胞可以但不是必須被施于受試者。也可以通過(guò)將細(xì)胞與多聚核苷酸在體內(nèi)接觸而可將多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞中。
表觀遺傳學(xué)沉默基因可以是采用在此所公開(kāi)的方法，檢測(cè)特定類型的細(xì)胞如特定類型的癌癥細(xì)胞而鑒定出的任何基因。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)沉默基因用在表1中所列的基因來(lái)例示，舉個(gè)例子，采用表4中所列的擴(kuò)增引物對(duì)(SEQ ID NOS149至296)對(duì)由結(jié)直腸癌細(xì)胞中獲得的核酸分子進(jìn)行RT-PCR，可獲得包括表1中的基因的部分的GenBank登記的多聚核苷酸序列。結(jié)直腸癌細(xì)胞和/或胃癌細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)沉默基因的示例是PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1和SNRPN，它們并不顯示有可檢測(cè)到的基底表達(dá)，而用DAC處理時(shí)可重新表達(dá)，但用TSA處理不會(huì)重新表達(dá)；HOXA1，GRO3和DLX7，它們顯示有基底水平的表達(dá)，但在用DAC而不用TSA處理時(shí)其表達(dá)會(huì)增強(qiáng)；POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPPIR21A，F(xiàn)PGT和TRIM32，它們可被單獨(dú)使用的TSA上調(diào)，而它們的基底表達(dá)和在DAC處理下的上調(diào)在這些基因中有所不同。
本發(fā)明也涉及一種為治療癌癥患者而選擇治療策略的方法。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施，例如，根據(jù)在此公開(kāi)的方法，鑒定至少一種與癌癥有關(guān)的甲基化沉默基因(即，將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除產(chǎn)物接觸，檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物與陣列上的一部分核苷酸序列之間的選擇性雜交)；然后選擇用于恢復(fù)一種或多種已被確定的甲基化沉默基因在患者癌細(xì)胞中的表達(dá)的試劑。例如，被選擇的試劑可以是編碼已被確定的甲基化沉默基因的多聚核苷酸，例如，編碼由PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3或DLX7基因，這樣的基因的家族成員，或這樣的基因的組合所編碼的多肽的多聚核苷酸。被選擇用于恢復(fù)甲基化沉默基因的表達(dá)的試劑也可以是脫甲基試劑如DAC。
因此，本發(fā)明提供了一種治療癌癥患者的方法，其中所述患者的癌細(xì)胞中表現(xiàn)有至少一種基因的表觀遺傳學(xué)沉默表達(dá)。這種方法可以通過(guò)例如恢復(fù)患者的癌細(xì)胞中一種或多種表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)來(lái)實(shí)施。例如，當(dāng)至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因是甲基化沉默基因時(shí)，可通過(guò)對(duì)受試者施予足以恢復(fù)受試者癌細(xì)胞中甲基化沉默基因表達(dá)的量的脫甲基試劑來(lái)治療患者。作為選擇，或作為補(bǔ)充，患者可以這樣來(lái)治療，對(duì)受試者施用至少一種多聚核苷酸，所述多聚核苷酸編碼由所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因中的一種或多種所編碼的至少一種多肽，并且施用量足以使所述的至少一種多肽在患者的癌細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)對(duì)患者施予多聚核苷酸時(shí)，多聚核苷酸可包含在載體(例如，病毒載體)中，所述載體優(yōu)選表達(dá)載體，和/或可以在可促進(jìn)靶癌細(xì)胞攝取多聚核苷酸的基質(zhì)中進(jìn)行配制(例如，在脂質(zhì)體中)。
根據(jù)本發(fā)明的方法要治療的癌癥可以是任何類型的癌癥，包括，例如癌(carcinoma)或肉瘤(sarcoma)。例如，其中所述的癌癥是結(jié)直腸癌，胃癌或結(jié)直腸癌和胃癌，患者的治療可通過(guò)恢復(fù)一種或多種表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述表觀遺傳學(xué)沉默基因包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPLl3，GNAI2 PPP1R21A，F(xiàn)PGT，TRIM32，其家族成員，或其組合。包括SFRP1，SFRP2，SFRP4和SFRP5在內(nèi)的SFRP基因提供了一個(gè)家族基因的實(shí)例，其中的一種或多種基因在結(jié)直腸癌，胃癌或兩者中被表觀遺傳學(xué)地沉默。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了治療患有結(jié)直腸癌、胃癌或兩者的個(gè)體的方法，其中與所述癌癥有關(guān)的細(xì)胞含有至少一種甲基化沉默基因。這種方法可以這樣來(lái)實(shí)施，例如施予受試者可以恢復(fù)所述的至少一種甲基化沉默基因的表達(dá)的試劑，其量足以恢復(fù)所述的甲基化沉默基因在與所述癌癥有關(guān)的細(xì)胞中的表達(dá)。所述試劑可以是編碼所述的至少一種甲基化沉默基因的多聚核苷酸，例如，編碼由PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3和/或DLX7基因，其家族成員，或其組合所編碼的多肽的多聚核苷酸；所述試劑或者是一種脫甲基試劑如DAC。用于治療患有結(jié)直腸癌、胃癌或兩者的個(gè)體的試劑可與所述癌癥的細(xì)胞離體接觸，此后所述細(xì)胞可以被再施予患者；或者，所述試劑被施于患者癌細(xì)胞所在的部位。
細(xì)胞中一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄被甲基化沉默的結(jié)果是，所述基因的產(chǎn)物不存在于細(xì)胞中，由此導(dǎo)致與被編碼的基因產(chǎn)物的缺乏相關(guān)的功能喪失。例如，SFRP基因家族成員可以拮抗WNT/frizzled信號(hào)傳導(dǎo)(Finch等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 946770-6775，1997；Rattner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 942859-2963，1997)。因此，一種或多種SFRP基因的功能喪失可以使整個(gè)腫瘤抑制通路失效。類似地，PCDH8基因編碼細(xì)胞粘附分子家族成員，其功能的喪失已知在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中是很重要的(Strehl等，Genomics 5381-89，1998)。因此，本發(fā)明的方法是基于向由于基因表達(dá)發(fā)生表觀遺傳學(xué)沉默特別是甲基化沉默而導(dǎo)致生長(zhǎng)失控的細(xì)胞提供由所述表觀遺傳學(xué)沉默基因編碼的多肽，由此恢復(fù)細(xì)胞的受控生長(zhǎng)。正如在這里公開(kāi)的，可以直接向細(xì)胞提供所述多肽，可以向細(xì)胞中引入編碼所述多肽的外源多聚核苷酸并讓其表達(dá)，或者恢復(fù)細(xì)胞中內(nèi)源的甲基化沉默基因的表達(dá)。通過(guò)對(duì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)失控的細(xì)胞進(jìn)行所述多肽的恢復(fù)，一些與生長(zhǎng)失控相關(guān)的特征，比如包括在軟瓊脂中生長(zhǎng)的能力，缺乏接觸生長(zhǎng)抑制，或者對(duì)細(xì)胞程序性死亡的抗性都被減輕了。
一種或者多種甲基化沉默基因例如表1所列基因的一種或者多種的表達(dá)恢復(fù)，可以通過(guò)將細(xì)胞與一種脫甲基化試劑比如DAC接觸來(lái)完成，DAC可以在細(xì)胞復(fù)制的過(guò)程中整合到基因中，結(jié)果子代細(xì)胞就含有非甲基化的基因，這樣就可以被轉(zhuǎn)錄了。用脫甲基化試劑接觸的細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞，其中所述的脫甲基化試劑以足以導(dǎo)致靶基因脫甲基化的量加入至細(xì)胞培養(yǎng)基中，這個(gè)過(guò)程對(duì)細(xì)胞是無(wú)毒的。培養(yǎng)中的細(xì)胞可以是已建立的細(xì)胞系的細(xì)胞，或者可以是混合種群的細(xì)胞，這些細(xì)胞是從受試者體內(nèi)取出，并進(jìn)行離體處理，舉例來(lái)說(shuō)，可以確定與特定的脫甲基化試劑的接觸是否可以恢復(fù)靶基因的表達(dá)，并因此在施予受試者時(shí)發(fā)揮作用。這樣的細(xì)胞離體處理也可以用于恢復(fù)靶基因的表達(dá)，經(jīng)過(guò)這樣的處理之后，細(xì)胞可選擇性地在培養(yǎng)中擴(kuò)增，可以被重新注回受試者體內(nèi)。這種方法以及在此所公開(kāi)的任何治療方法可以進(jìn)一步包括本領(lǐng)域已知的用于治療患有特定癌癥的受試者的治療方法，或者與本方法聯(lián)合使用時(shí)有新的作用的方法。
表現(xiàn)出甲基化沉默基因表達(dá)的細(xì)胞也可以通過(guò)將試劑施用到體內(nèi)的方法使之在體內(nèi)與脫甲基化試劑接觸。如果方便的話，脫甲基化試劑可以通過(guò)下列方法引入體內(nèi)，比如在體內(nèi)表現(xiàn)出生長(zhǎng)失控的細(xì)胞的位置或者附近運(yùn)用導(dǎo)管插入法，或向流入該細(xì)胞部位的血液所在的血管中注入脫甲基化試劑。類似地，如果將要被治療的器官或者器官的一部分可以通過(guò)分路方法被分離，那么試劑可以通過(guò)分路器被施用，結(jié)果本質(zhì)上也可以將試劑施于含有所述細(xì)胞的位置。試劑也可以被系統(tǒng)地施用或者是通過(guò)其他路徑施用，如在這里所公開(kāi)的，或者如本領(lǐng)域所知的。
由于基因的表觀遺傳學(xué)沉默而導(dǎo)致減少或者缺乏的多肽也可以通過(guò)將編碼所述多肽的多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞中而被提供給細(xì)胞，這樣所述多肽在細(xì)胞中可由所述多聚核苷酸表達(dá)。這樣，本發(fā)明提供了基因治療的方法，其可在體內(nèi)或離體實(shí)施。例如，當(dāng)細(xì)胞的特征是SFRP1基因的轉(zhuǎn)錄被甲基化沉默時(shí)，可以將具有GenBank注冊(cè)號(hào)N32514(見(jiàn)表1)所示的核苷酸序列的多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)靶細(xì)胞中。
除了編碼多肽的序列，所述多聚核苷酸還可以包括有效連接的(operatively linked)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，翻譯調(diào)控元件和類似的元件，所有這些可以形成一個(gè)裸露的DNA分子，可以包含在一個(gè)載體中，或者可以包裝在一種基質(zhì)比如脂質(zhì)體或者微氣泡中，它們可以幫助多聚核苷酸進(jìn)入特定的細(xì)胞。在這里提到的術(shù)語(yǔ)“有效連接的”是指兩種或者更多種分子鄰近相連以至它們可以作為一個(gè)單位來(lái)看待，而且表現(xiàn)出的功能可以是其中一種或者所有分子的功能，或者這些功能的組合。例如，編碼SFRP1多肽的多聚核苷酸可以與另外一個(gè)(或者更多)編碼序列有效連接，這樣由所述的有效連接的編碼多肽可以表達(dá)出嵌合多肽。所述的嵌合多肽可以是融合蛋白，其中兩種(或者更多種)被編碼的多肽被翻譯成一條多肽，即，通過(guò)肽鍵共價(jià)連接；或者可以被翻譯成兩個(gè)獨(dú)立的多肽，這些多肽被翻譯出來(lái)之后，可以彼此聯(lián)系形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物。類似地，編碼需要的多肽的多聚核苷酸序列可以與調(diào)控元件有效連接，在這種情況中該調(diào)控元件可以將它的調(diào)控作用賦予該多聚核苷酸，其方式與這種調(diào)控元件調(diào)控細(xì)胞中與其正常相關(guān)的多聚核苷酸序列一樣。
融合蛋白常常表現(xiàn)出其中每個(gè)多肽組分的部分或者全部特性，因此可以用來(lái)在細(xì)胞中恢復(fù)基因的表達(dá)，還可以進(jìn)一步提供其他的優(yōu)點(diǎn)。比如，融合蛋白可以包含由于其編碼基因的表觀遺傳學(xué)沉默而導(dǎo)致其量降低或者缺乏的多肽，這種多肽可以與一種細(xì)胞區(qū)室定位結(jié)構(gòu)域有效連接，這樣該融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)或者向細(xì)胞中引入這種融合蛋白可以將編碼的多肽定位到特定的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中以發(fā)揮其活性，比如定位到細(xì)胞核。細(xì)胞區(qū)室定位結(jié)構(gòu)域已經(jīng)研究的很清楚了，比如包括質(zhì)膜定位結(jié)構(gòu)域，核定位信號(hào)，線粒體膜定位信號(hào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)和類似的結(jié)構(gòu)域，也包括可以指導(dǎo)多肽從細(xì)胞中分泌出來(lái)的信號(hào)肽(參見(jiàn)，比如，Hancock等，EMBO J.104033-4039，1991；Buss等，Mol.Cell.Biol.83960-3963，1988；美國(guó)專利號(hào)5,776,689，每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考文獻(xiàn))。融合蛋白也可以包括所需要的多肽與起其它作用的肽有效連接，包括作為受體的配體的肽，用作確定多肽在細(xì)胞中的表達(dá)的標(biāo)記的肽，或者是用于分離融合蛋白的肽，或者是任何其他感興趣的多肽或者肽，只要該融合蛋白具有所要的多肽的蛋白活性，例如，可拮抗WNT/frizzled活性的SFRP多肽活性。肽標(biāo)記比如多聚組氨酸標(biāo)記肽，比如His-6，可以用一種二價(jià)陽(yáng)離子比如鎳離子，鈷離子或者類似的離子來(lái)檢測(cè)；FLAG表位，可以用抗FLAG抗體來(lái)檢測(cè)(參見(jiàn)，比如，Hopp等，BioTechnology 61204(1988)；美國(guó)專利號(hào)5,011,912，每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考)；c-myc表位，可以用針對(duì)這種表位的特異性抗體來(lái)檢測(cè)；生物素，可以用鏈霉親和素或者親和素來(lái)檢測(cè)；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，可以用谷胱甘肽來(lái)檢測(cè)，這些標(biāo)記在本技術(shù)領(lǐng)域是已熟知的，它們?yōu)闄z測(cè)與其有效連接的多肽存在與否提供了一種方法。這些標(biāo)記還提供了額外的好處，比如它們可以幫助分離與之有效連接的多肽，如果需要獲得基本純化的形式的多肽的話，這樣的多肽可以用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。
編碼本來(lái)由表觀遺傳學(xué)沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸可以單獨(dú)使用，也可以包含在一個(gè)載體中，這可以輔助多聚核苷酸的操作，包括將所述多聚核苷酸引入到目標(biāo)細(xì)胞中。載體可以是一個(gè)用來(lái)保存多聚核苷酸的克隆載體，也可以是一個(gè)表達(dá)載體，它除了包括多聚核苷酸，還含有對(duì)多聚核苷酸和被編碼的多肽在特定細(xì)胞中的表達(dá)有用的調(diào)控元件。一個(gè)表達(dá)載體可以含有，例如，維持編碼多聚核苷酸的轉(zhuǎn)錄所必需的表達(dá)元件，或者能夠在多聚核苷酸被克隆到載體之前就可以與該多聚核苷酸有效連接的調(diào)控元件。
一個(gè)表達(dá)載體(或者編碼所需多肽的多聚核苷酸)一般含有或者編碼一段啟動(dòng)子序列，它可以為所述的編碼多聚核苷酸提供組成性的，或者如果需要的話，可以是可誘導(dǎo)的或者組織特異性的或者發(fā)育階段特異性的表達(dá)，還可以含有多聚腺嘌呤識(shí)別序列，核糖體識(shí)別位點(diǎn)或者內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，或者其他調(diào)控元件，比如組織特異性的增強(qiáng)子。載體還可以包含在原核或者真核宿主系統(tǒng)中復(fù)制所需要的元件，或者是在兩種系統(tǒng)中都需要的元件，如果需要的話。這樣的載體包括質(zhì)粒載體和病毒載體比如噬菌體，桿狀病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒(lentivirus)，腺病毒，疫苗病毒，塞姆利基森林(semliki forest)病毒和腺相關(guān)病毒，這些病毒是已熟知的，而且也都可以通過(guò)商業(yè)渠道(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，Gaithersburg MD)來(lái)獲得，或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建(參見(jiàn)，比如，Meth.Enzymol.，第185卷，Goeddel，ed.(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Canc.Gene Ther.151-64，1994；Flotte，J.Bioenerg.Biomemb.2537-42，1993；Kirshenbaum等，J.Clin.Invest.92381-387，1993；每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考)。
四環(huán)素(tet)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子對(duì)于控制編碼所需多肽的多聚核苷酸的表達(dá)特別有用。在四環(huán)素或者其類似物被施于含有與四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效連接的多聚核苷酸的個(gè)體之后，編碼的多肽就被誘導(dǎo)表達(dá)。多聚核苷酸也可以與組織特異性的調(diào)控元件有效連接，比如一種肝臟細(xì)胞特異性調(diào)控元件，如α-胎蛋白啟動(dòng)子(Kanai等，Cancer Res.57461-465，1997；He等，J.Exp.Clin.Cancer Res.19183-187，2000)或者白蛋白啟動(dòng)子(Power等，Biochem.Biophys.Res.Comm.2031447-1456，1994；Kuriyama等，Int.J.Cancer 71470-475，1997)；一種肌肉細(xì)胞特異性調(diào)控元件，比如肌球蛋白啟動(dòng)子(Delvin等，J.Biol.Chem.26413896-13901，1989；Yan等，J.Biol.Chem.27617361-17366，2001)；一種前列腺細(xì)胞特異性調(diào)控元件，比如PSA啟動(dòng)子(Schuur等，J.Biol.Chem.2717043-7051，1996；Latham等，Caner Res.60334-341，2000)；一種胰腺細(xì)胞特異性調(diào)控元件，比如彈性蛋白酶啟動(dòng)子(Omitz等，Nature 313600-602，1985；Swift等，Genes Devel.3687-696，1989)；一種白細(xì)胞特異性調(diào)控元件，比如白細(xì)胞唾液酸蛋白(CD43)啟動(dòng)子(Shelley等，Biochem.J.270569-576，1990；Kudo和Fukuda，J.Biol.Chem.27013298-13302，1995)；或者類似的啟動(dòng)子，這樣多肽的表達(dá)就可以限制在個(gè)體內(nèi)特定的細(xì)胞中，或者限制在培養(yǎng)基如器官培養(yǎng)基中一個(gè)混合群體的細(xì)胞中的特定細(xì)胞中。調(diào)控元件，包括組織特異性元件，許多都是可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得的，它們?cè)诒绢I(lǐng)域是已熟知的(參見(jiàn)，比如，InvivoGen；San Diego CA)。
病毒表達(dá)載體在將多聚核苷酸引入到細(xì)胞特別是個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞特別有效。病毒載體所具有的優(yōu)勢(shì)是它們可以以相對(duì)高的效率來(lái)侵染寄主細(xì)胞，而且可以侵染特定的細(xì)胞類型。例如，編碼所需多肽的多聚核苷酸可以被克隆到桿狀病毒載體中，它然后可以用于侵染昆蟲宿主細(xì)胞，由此提供一種產(chǎn)生大量該被編碼的多肽的方法。病毒載體也可以來(lái)源于侵染感興趣的生物的細(xì)胞的病毒，這些生物細(xì)胞比如是脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，鳥類宿主細(xì)胞或者魚類宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，病毒載體在向目標(biāo)細(xì)胞中引入多聚核苷酸方面特別有用。病毒載體還可以被發(fā)展以用于特定的宿主系統(tǒng)，特別是哺乳動(dòng)物系統(tǒng)，這樣的病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒，其他慢病毒載體，如那些基于人類免疫缺乏綜合癥(HIV)的病毒，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，皰疹病毒載體，肝病毒載體，疫苗病毒載體，或者類似的病毒載體(參見(jiàn)Miller和Rosman，BioTechniques 7980-990，1992；Anderson等，Nature 39225-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature389239-242，1997；Wilson，New Engl.J.Med.3341185-1187(1996)，每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考)。
包含在載體之中的多聚核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法被引入到細(xì)胞中(Sambrook等，如上，1989；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，MD(1987，和1995年的增補(bǔ)材料)，每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考)。這樣的方法包括如轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染(lipofection)，微注射，電轉(zhuǎn)和用病毒載體侵染；還可以包括運(yùn)用脂質(zhì)體，微乳劑或者類似物來(lái)引入，這些方法可以幫助多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，還可以使多聚核苷酸在被導(dǎo)入細(xì)胞之前避免降解。一個(gè)特別有用的方法包括將多聚核苷酸整合到微氣泡中，然后可以注射到循環(huán)通路中?？梢苑胖靡粋€(gè)超聲源使得超聲可以傳遞到腫瘤處，正在腫瘤的位置循環(huán)的含有多聚核苷酸的微氣泡被超聲波打破，這樣就可以在癌癥部位提供這種多聚核苷酸。一種特定方法的選擇需要依據(jù)比如多聚核苷酸所要導(dǎo)入的細(xì)胞，還有細(xì)胞是否分離于培養(yǎng)基中，或者是在培養(yǎng)的組織或器官中，或者是在原位。
利用病毒載體的侵染來(lái)將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中的方法是非常有益的，它可以將核酸分子高效地導(dǎo)入到細(xì)胞中(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,399,346，在此整入以供參考)。而且，病毒一般都是非常特化的，可以根據(jù)其對(duì)一種或者幾種特定類型的細(xì)胞的侵染能力以及繁殖能力來(lái)挑選需要的載體。因此，它們的天然特異性可以將包含在載體中的核酸分子定向?qū)氲教囟愋偷募?xì)胞中。這樣，基于HIV的載體可以用于侵染T細(xì)胞，基于腺病毒的載體可以用于侵染例如呼吸道上皮細(xì)胞，基于皰疹病毒的載體可以用來(lái)侵染神經(jīng)元細(xì)胞，等等。其他載體如腺相關(guān)病毒可以有更加寬泛的宿主細(xì)胞范圍，因此可以用來(lái)侵染很多類型的細(xì)胞，盡管病毒或者非病毒載體也可以用特定的受體或者配體進(jìn)行修飾，以通過(guò)受體介導(dǎo)的事件來(lái)改變其目標(biāo)特異性。本發(fā)明的多聚核苷酸，或者含有多聚核苷酸的載體可以包含在細(xì)胞中，比如在宿主細(xì)胞中，這樣含有多聚核苷酸的載體便可以增殖，或者在輔助細(xì)胞中，這樣含有多聚核苷酸的病毒載體便可以組裝。所述多聚核苷酸可以暫時(shí)地存在于細(xì)胞中，也可以穩(wěn)定地存在，例如通過(guò)整合到細(xì)胞基因組中這樣的方法。
本發(fā)明的方法還可以通過(guò)直接將所需要的多肽提供給病人體內(nèi)表現(xiàn)出生長(zhǎng)失控的細(xì)胞來(lái)實(shí)施。所述多肽可以在產(chǎn)生后被分離，然后按照需要采用這里公開(kāi)的方法制成配方。所述多肽可以與細(xì)胞在體外接觸，這種接觸發(fā)生的條件導(dǎo)致所述細(xì)胞能夠充分地透過(guò)，這樣所述多肽可以穿過(guò)細(xì)胞膜，或者可以將多肽微注射進(jìn)入細(xì)胞。如果所需的多肽與生物體的細(xì)胞在原位接觸，那么這種多肽可以包括融合蛋白，其中含有促進(jìn)其穿過(guò)細(xì)胞膜的肽或者多肽組分，比如人類免疫系統(tǒng)缺乏綜合癥病毒(HIV)TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，而且還可以進(jìn)一步包含與之有效連接的核定位結(jié)構(gòu)域。作為選擇，或者作為補(bǔ)充，所述多肽可以被包裝在基質(zhì)中以促進(jìn)多肽進(jìn)入細(xì)胞。
對(duì)于活體施用，用于實(shí)踐本發(fā)明的治療方法的試劑例如脫甲基化試劑，多聚核苷酸或者多肽一般被配制成適合于施用的組合物。因此，本發(fā)明提供含有用于恢復(fù)由于一種或者多種基因的甲基化轉(zhuǎn)錄沉默而導(dǎo)致生長(zhǎng)失控的細(xì)胞的受控生長(zhǎng)的試劑的組合物。這樣，這種試劑就可以用作治療患有與這種生長(zhǎng)失控相關(guān)的病理癥狀的病人的藥物。
這樣的組合物一般包含對(duì)于形成配方和將試劑施用于個(gè)體可接受的載劑?？杀唤邮艿妮d劑在本領(lǐng)域是已知的，包括比如含水溶液如水或者生理緩沖鹽溶液，或者其他溶劑或媒介物如乙二醇，甘油，油類物質(zhì)如橄欖油或者可注射的有機(jī)酯?？杀唤邮艿妮d劑可以含有一些生理上能夠接受的化合物，其作用是例如穩(wěn)定或者增加結(jié)合物的吸收。這樣的生理上可以接受的化合物包括例如碳水化合物如葡萄糖，蔗糖或者葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸或者谷胱甘肽，螯合試劑，低分子量蛋白或者其他穩(wěn)定劑或賦形劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，包括生理上可接受的化合物在內(nèi)的可接受載劑的選擇是依賴于比如治療試劑本身的物理化學(xué)性質(zhì)和施用該組合物的途徑，所述途徑可以是例如口服或者不經(jīng)腸胃的途徑，如靜脈內(nèi)施用并且是通過(guò)注射，插管，或者本領(lǐng)域已知的其他這樣的方法。所述藥物組合物還可以含有第二種試劑，比如診斷試劑，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，毒素，或者治療試劑，比如癌癥化療試劑。
所述試劑可以整合到一種膠囊材料中，比如在油水混合乳劑，微乳劑，微膠束，混合微膠束，脂質(zhì)體，微球體或者其他聚合物基質(zhì)當(dāng)中(參見(jiàn)，例如Gregoriadis，Liposome Technology，第1卷(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L 1984)；Fraley等，Trends Biochem.Sci.，677(1981)，每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考)。脂質(zhì)體，例如由磷脂或者其他脂類組成的脂質(zhì)體，是沒(méi)有毒性的，生理上可接受的而且可代謝的載體，它們比較容易制作和施用?！半[形(Stealth)”脂質(zhì)體(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,882,679；5,395,619和5,225,212，每篇文獻(xiàn)都在此整入以供參考)就是這樣的膠囊材料的一個(gè)例子，其對(duì)于制備用于本發(fā)明的方法的組合物非常有用，而其他的“隱蔽(masked)”脂質(zhì)體也可以類似地被應(yīng)用，這樣的脂質(zhì)體延長(zhǎng)了治療試劑在循環(huán)中的保留時(shí)間。陽(yáng)離子型脂質(zhì)體比如也可以用特異性的受體或者配體修飾(Morishita等，J.Clin.Invest.，912580-2585(1993)，這篇文獻(xiàn)在此整入以供參考)。另外，多聚核苷酸試劑可以利用比如腺病毒-多賴氨酸DNA復(fù)合物來(lái)導(dǎo)入到細(xì)胞中(參見(jiàn)，比如，Micheal等，J.Biol.Chem.2686866-6869(1993)，這篇文獻(xiàn)在此整入以供參考)。
含有治療試劑的組合物的施用途徑部分地依賴于分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。比如多肽和多聚核苷酸，如果是通過(guò)口服進(jìn)入體內(nèi)的話就不是特別有效，因?yàn)樗鼈儠?huì)在消化道中被降解。然而，比如用來(lái)使多肽對(duì)于內(nèi)源的蛋白酶降解更加不敏感或者使其更容易通過(guò)消化道吸收的化學(xué)修飾多肽的方法，都在這里公開(kāi)了或者它們是本領(lǐng)域所知的(參見(jiàn)，比如，Blondelle等，如上，1995；Ecker和Crook，如上，1995)。另外，多肽試劑可以用D型氨基酸來(lái)制備，或者可以包含一個(gè)或者多個(gè)基于肽模擬物的結(jié)構(gòu)域，它們是模擬結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子；或者是基于一種類肽比如維尼綸類肽(vinylogous peptoid)構(gòu)成。
在這里公開(kāi)的組合物可以通過(guò)各種途徑被施于個(gè)體，比如包括口服或者不經(jīng)腸道的途徑，如靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，眼瞼內(nèi)，囊內(nèi)，腹腔內(nèi)，直腸內(nèi)，腦池內(nèi)施用，或者通過(guò)皮膚被動(dòng)或者易化吸收，比如分別應(yīng)用皮膚帖或者透皮離子電滲透法。而且，所述組合物可以通過(guò)注射，插管，口服或者局部施用，后者可以是被動(dòng)式的，比如直接貼上一塊膏藥，或者是主動(dòng)式的，比如利用鼻腔噴霧或者吸入劑，在這種情況中，所述混合物的一種成分是一種合適的推進(jìn)劑。藥物組合物也可以被施于具有病理癥狀的位點(diǎn)，比如通過(guò)靜脈或者動(dòng)脈注射到給腫瘤供血的血管。
在實(shí)踐本發(fā)明的方法時(shí)施用的試劑的總用量可以以單次劑量的形式施于個(gè)體，也就是以一粒藥丸的形式或者是通過(guò)在一段相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)輸注，或者可以采用分次治療方案來(lái)施用，其中在一段延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)分多次劑量施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，治療患者的病理狀況所需要的組合物用量依賴于許多因素，包括患者的年齡，一般健康狀況，還有給藥的途徑和要進(jìn)行治療的次數(shù)?？v觀這些因素，熟練的技術(shù)人員會(huì)根據(jù)需要來(lái)調(diào)整特定的劑量。一般地，所述組合物的配方以及給藥的途徑和頻率都在一開(kāi)始就已經(jīng)通過(guò)I期和II期臨床試驗(yàn)確定了。
所述組合物可以配制成口服配方，比如藥片，或者溶液或懸浮液的形式；或者可以包含帶有有機(jī)或無(wú)機(jī)載劑的附加劑，或適合于腸道或者非腸道應(yīng)用的賦形劑，還可以與例如通常無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的載劑構(gòu)成復(fù)合物，形成藥片，藥丸，膠囊，栓劑，溶液，乳劑，懸浮液或者其他適于使用的形式。除了前面公開(kāi)的那些，載劑還可以包括葡萄糖，乳糖，甘露糖，阿拉伯樹(shù)膠，明膠，甘露醇，淀粉糊，三硅酸鎂，云母，谷物淀粉，角蛋白，膠體硅石，馬鈴薯淀粉，尿素，中等鏈長(zhǎng)的甘油三酸酯，葡聚糖和其他適于工業(yè)制備的載劑，它們可以是固體，半固體或者液體的形式。另外，助劑，穩(wěn)定劑，增稠劑或者著色劑和香料也可以被應(yīng)用，例如一種干性穩(wěn)定劑如酮丙糖(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,314,695)。
下面的實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明但是并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1基因組篩選與結(jié)直腸癌有關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因 本實(shí)施例提供了用于檢測(cè)癌癥細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)下調(diào)的基因的方法，并通過(guò)鑒定在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)下調(diào)的基因和診斷結(jié)直腸癌細(xì)胞，證實(shí)該方法的有效性(也參見(jiàn)，Suzuki等，Nature Genet.31141-149，2002，在此整入以供參考)。
方法細(xì)胞培養(yǎng)和組織樣本 細(xì)胞系在添加了10％胎牛血清的RPMI 1640或最小必須培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)。結(jié)直腸癌和正常結(jié)腸粘膜的組織樣本來(lái)自于臨床手術(shù)操作時(shí)獲得的標(biāo)本。
DAC和TSA處理和RNA制劑 RKO細(xì)胞用5-氮雜-2′-脫氧胞苷(DAC；Sigma)和/或曲古抑菌素A(TSA；Wako)根據(jù)已描述的方法(Cameron等，如上，1999)進(jìn)行處理。簡(jiǎn)言之，處理包括用DAC(200nM)處理48hr，在處理開(kāi)始后24hr的時(shí)間點(diǎn)更換藥物和培養(yǎng)基，然后添加TSA至終濃度300nM(來(lái)自1.5mM乙醇溶解的儲(chǔ)液)，并再溫育24hr。細(xì)胞也用DAC或TSA單獨(dú)處理，或應(yīng)用相同體積的PBS和/或乙醇作為對(duì)照進(jìn)行處理，和/或相同量的藥物處理。一些結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞系也被處理，為的是進(jìn)行RT-PCR分析以評(píng)價(jià)基因表達(dá)的更高水平；用5μM DAC處理72hr，每24hr更換一次藥物和培養(yǎng)基。利用TRIZOL試劑(Gibco/BRL)提取總RNA，并用作微陣列分析，cDNA扣除和RT-PCR。
cDNA扣除 在cDNA扣除前，利用MESSAGE MAKER Reagent Assembly kit(Gibco/BRL)從總RNA中分離poly A RNA。利用PCR-SelectTMcDNA扣除試劑盒(Clontech)進(jìn)行cDNA扣除實(shí)驗(yàn)，以組合處理的RKO細(xì)胞系作為檢測(cè)子(tester)，假處理的(mock treated)細(xì)胞作為驅(qū)動(dòng)子(driver)。合成的cDNA用Rsa I消化，檢測(cè)子cDNA與包含在試劑盒中的接頭(adaptors)連接。雜交后，扣除cDNA的PCR擴(kuò)增采用ADVANTAGE cDNA PCR試劑盒(Clontech)進(jìn)行。
微陣列分析 采用Mammalian GeneFilters MicroarraysTM(Research Genetics)進(jìn)行微陣列分析。針對(duì)在Johns Hopkins Comprehensive microarray core分析的大約5000種基因產(chǎn)生濾膜(filter)，針對(duì)其它5000種基因的濾膜購(gòu)買獲得(Human GeneFilters MicroarraysTMReleaseII；ResearchGenetics)?？偣卜治?0,814種基因和ESTs。根據(jù)生產(chǎn)廠商的建議進(jìn)行濾膜的雜交。簡(jiǎn)言之，5μg總RNA用SUPERSCRIPT II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco/BRL)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用oligo(dT)12-18引物和32dCTP進(jìn)行標(biāo)記。濾膜的雜交進(jìn)行12至18hr。應(yīng)用PSCAN程序(國(guó)立衛(wèi)生院)分析數(shù)據(jù)。對(duì)于扣除微陣列分析，來(lái)自cDNA扣除的第二次PCR產(chǎn)物用33p采用MULTIPRIME DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham)標(biāo)記。如上所述進(jìn)行雜交和數(shù)據(jù)分析。對(duì)于每種條件獨(dú)立地重復(fù)微陣列分析至少三次，將應(yīng)用來(lái)自假處理細(xì)胞的總RNA的cDNA時(shí)的陣列探測(cè)結(jié)果與扣除PCR產(chǎn)物的雜交結(jié)果進(jìn)行比較。
半定量RT-PCR 應(yīng)用oligo(dT)12-18引物，利用SUPERSCRIPT II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco/BRL)將DNase I(Ambion)處理的總RNA(2μg)逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。在含有1xPCR緩沖液(Gibco/BRL)，1.5mM MgCl2，0.3mM dNTP，0.25μM每種引物和2U Taq聚合酶(Gibco/BRL)的50μl體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。100ng cDNA用來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有基因被擴(kuò)增多個(gè)循環(huán)數(shù)(20至35循環(huán))以確定能夠獲得它們的表達(dá)水平中的半定量差異的合適條件。進(jìn)行GAPDH PCR(25和28循環(huán))以保證cDNA質(zhì)量和上樣準(zhǔn)確性。擴(kuò)增引物對(duì)在表4中顯示(SEQ ID NOS149至296)。
甲基化分析 如所描述的那樣進(jìn)行基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾(Baylin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939821-9826，1996，在此整入以供參考)。采用兩種程序?qū)喠蛩釟潲}修飾的基因組DNA進(jìn)行PCR分析，以測(cè)定其甲基化狀態(tài)。在第一個(gè)程序中，所有被測(cè)基因通過(guò)亞硫酸氫鹽PCR進(jìn)行分析，然后用多種甲基化CpG位點(diǎn)特異的限制性酶進(jìn)行消化(COBRA；Xiong和Laird，Nucleic Acids Res.252532-2534，1997，在此整入以供參考)。第二個(gè)程序?qū)υ诙鄠€(gè)癌細(xì)胞系和組織樣本中分析的所有基因使用甲基化特異的PCR(MSP)(Baylin等，如上，1996)。根據(jù)被測(cè)基因假設(shè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的基因組序列設(shè)計(jì)所有的亞硫酸氫鹽PCR和MSP引物。
SFRP基因的甲基化和表達(dá)分析 對(duì)SFRP2和SFRP4進(jìn)行甲基化分析，其中應(yīng)用三種不同的MSP引物對(duì)來(lái)覆蓋每種基因的5′CpG島。對(duì)于SFRP5的甲基化分析，應(yīng)用兩種不同的MSP引物對(duì)。對(duì)于RT-PCR，分別針對(duì)外顯子2和3來(lái)設(shè)計(jì)SFRP2的正義和反義引物；分別針對(duì)外顯子2和5來(lái)設(shè)計(jì)SFRP4的正義和反義引物；分別針對(duì)外顯子2和3來(lái)設(shè)計(jì)SFRP5的正義和反義引物。對(duì)于每種基因，根據(jù)細(xì)胞系中的表達(dá)數(shù)據(jù)可最佳評(píng)測(cè)基因甲基化狀態(tài)的MSP引物對(duì)被應(yīng)用；也應(yīng)用這些引物進(jìn)行原發(fā)性CRC組織的分析。
結(jié)果上調(diào)基因的微陣列分析和分類 應(yīng)用cDNA微陣列技術(shù)來(lái)鑒定基因上調(diào)的RKO CRC細(xì)胞，鑒定之前細(xì)胞用低劑量DAC和/或TSA處理過(guò)，前者可最低限度地阻斷DNA的甲基化，后者可抑制組蛋白脫乙酰酶(HDAC)活性。在最初的研究中，應(yīng)用的低劑量DAC和短時(shí)間的處理細(xì)胞僅引起為數(shù)不多的可能導(dǎo)致基因表達(dá)上調(diào)的等位基因去甲基化(Cameron等，如上，1999)，這樣的處理的靈敏性不足，其證據(jù)是不能檢測(cè)到濾膜上排列的對(duì)照基因，這些基因已知在RKO細(xì)胞中可被所述的藥物組合協(xié)同地重新活化(Cameron等，如上，1999；Toyota等，Cancer Res.604044-4048，2000)。因此，通過(guò)在假處理細(xì)胞(驅(qū)動(dòng)子)與DAC和TSA處理細(xì)胞(檢測(cè)子)之間進(jìn)行初始cDNA扣除步驟，增加篩選的敏感性。第二輪扣除后的PCR產(chǎn)物然后可被用作微陣列雜交的探針。
在濾膜上排列的已知在RKO細(xì)胞中甲基化的四種對(duì)照基因中，僅hMLH1的再表達(dá)不能被檢測(cè)到，但其他三種對(duì)照基因p16，TIMP3和PTGS2(COX2)被成功地檢測(cè)到，這可通過(guò)隨后的PCR研究來(lái)驗(yàn)證。對(duì)于未知基因，那些在假處理濾膜中顯示沒(méi)有表達(dá)(即，當(dāng)用來(lái)自假處理細(xì)胞的非扣除cDNA進(jìn)行探測(cè)時(shí)，其與空白點(diǎn)具有相同的強(qiáng)度)，而在用假處理細(xì)胞和處理細(xì)胞之間的扣除產(chǎn)物探測(cè)后顯示有可檢測(cè)到的表達(dá)的基因被選擇進(jìn)行隨后的分析，也就是在接受假處理，單獨(dú)DAC處理，單獨(dú)TSA處理或聯(lián)合藥物處理的細(xì)胞中進(jìn)行半定量RT-PCR。
在通過(guò)扣除微陣列檢測(cè)的總共10,814種基因中，74種被DAC和/或TSA的處理上調(diào)。這74種基因可被分為兩組1組基因(n＝51)，用TSA單獨(dú)處理時(shí)顯示沒(méi)有變化，在低劑量DAC單獨(dú)處理后有最小量的表達(dá)增加，但DAC和TSA聯(lián)合處理后有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用(表1)；2組基因(n＝23)，用TSA單獨(dú)處理時(shí)顯示上調(diào)，對(duì)DAC的單獨(dú)處理有可變化的初始表達(dá)或響應(yīng)。另外，1組基因可進(jìn)一步再分為兩組1a組基因(n＝24)，在假處理細(xì)胞中是完全失活的；1b組基因(n＝27)，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)顯示有基底表達(dá)。
總共56種非EST基因(表1)具有特征化的染色體位置；通過(guò)搜索所有可獲得的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)這些基因中的46種鑒定出推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。另外，在56種基因中的27種中鑒定到5′CpG島(GC含量＞60％，CpG比GpC＞0.6，最小長(zhǎng)度200bp)(Gardiner-Garden和Frommer，J.Mol.Biol.20，261-282，1987)。在剩余基因的推定的上游區(qū)域附近不能發(fā)現(xiàn)CpG島表明，要么缺少富含CpG的近端啟動(dòng)子，含有CpG島的控制區(qū)域的位置比利用可獲得的基因組數(shù)據(jù)所能確定的區(qū)域更加上游，要么鑒定的區(qū)域不是真正的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
RKO細(xì)胞中5′CpG島的甲基化分析 已被鑒定的CpG島的甲基化狀態(tài)應(yīng)用亞硫酸氫鹽PCR，結(jié)合甲基化CpG位點(diǎn)特異限制性酶(Xiong和Laird，如上，1997)和MSP(Herman等，如上，1996)進(jìn)行分析，所得結(jié)果與表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行比較。1a組基因(包括3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照基因)中具有被鑒定的5’CpG島的所有12種基因在RKO細(xì)胞中都含有這些區(qū)域的高度甲基化(表1)，并且通過(guò)RT-PCR檢測(cè)顯示沒(méi)有基底表達(dá)。1b組基因中被鑒定到5′CpG島的5種基因中的三種顯示有部分甲基化(表1)，這與其很低的基底表達(dá)水平相對(duì)應(yīng)；其他兩種基因沒(méi)有顯示任何甲基化。相比，不管是否有基底表達(dá)，2組基因中的10種基因中沒(méi)有一種顯示有5′CpG島甲基化(表1)。
CRC細(xì)胞系中1a組基因的甲基化和表達(dá)分析 對(duì)于1a組基因，可進(jìn)一步檢測(cè)其與癌癥的相關(guān)性。在一系列的8個(gè)CRC細(xì)胞系中檢測(cè)1a組基因的甲基化狀態(tài)和表達(dá)。在所有受測(cè)的CRC細(xì)胞系中均檢測(cè)到SFRP1，SEZ6L，PCDH8和FOLH1基因的高度甲基化。8個(gè)細(xì)胞系中的5個(gè)顯示KIAA0786有全部或占優(yōu)勢(shì)的甲基化。對(duì)CXX1是特別感興趣的，因?yàn)樗挥赬染色體上，正常情況下在一條等位基因上是失活的且甲基化的，而在女性細(xì)胞中的另一條等位基因上是有活性且未甲基化的。然而，在8個(gè)CRC細(xì)胞系中的5個(gè)中，僅檢測(cè)到甲基化的或甲基化占優(yōu)勢(shì)的CXX1等位基因，這些細(xì)胞系包括RKO細(xì)胞，除了HT29以外所有都來(lái)自男性患者。SNRPN也是很引人注目的，因?yàn)樗谌祟愔惺悄赶涤∮浀?maternally imprinted)，而且在該沉默的等位基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島中是高度甲基化的，如所期望的那樣，正常外周血淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的CpG島中顯示有部分甲基化(Sutcliffe等，Nature Genet.852-58，1994)。相比，RKO，HCT116和SW480 CRC細(xì)胞顯示完全的甲基化，并缺少基底表達(dá)。S100A10和TIMP2甲基化僅在RKO細(xì)胞中觀察到。重要地是，在甲基化的細(xì)胞系中，上述基因的每一種都缺少基底表達(dá)，而又可以通過(guò)與DAC的溫育而被恢復(fù)。盡管缺少甲基化，KIAA0786在SW480細(xì)胞中也沒(méi)有基底表達(dá)，然而可通過(guò)用DAC處理使其活化。
在原發(fā)性CRC組織中1a組基因的甲基化分析 在原發(fā)性結(jié)腸癌和相應(yīng)的正常結(jié)腸組織中檢查1a組基因的甲基化狀態(tài)。SFRP1的甲基化在原發(fā)性CRC樣本中觀察到，具有驚人的高頻率(17/20)，而在具有所述腫瘤的相同個(gè)體的17個(gè)正常組織中的6個(gè)，或在其腫瘤沒(méi)有顯示甲基化的三個(gè)個(gè)體的正常組織中沒(méi)有檢測(cè)到甲基化。在11個(gè)病例中，在腫瘤和正常的組織中均觀察到SFRP1甲基化，但腫瘤顯示有更強(qiáng)的甲基化信號(hào)。還在來(lái)自沒(méi)有CRC的兩個(gè)患者的正常結(jié)腸組織中檢查SFRP1的甲基化；沒(méi)有檢測(cè)到甲基化。
SEZ6L和KIAA0786也顯示在原發(fā)性CRC中有非常高頻率的高度甲基化(分別是，20病例中有13個(gè)，20個(gè)病例中有8個(gè))。然而，如同SFRP1，在其腫瘤沒(méi)有甲基化的個(gè)體的正常結(jié)腸中這些基因沒(méi)有檢測(cè)到甲基化，或?qū)τ谀[瘤有甲基化的個(gè)體，13個(gè)中的11個(gè)(SEZ6L)和8個(gè)中的4個(gè)(KIAA0786)的正常結(jié)腸中沒(méi)有檢測(cè)到甲基化。在分別來(lái)自2和4個(gè)個(gè)體的正常結(jié)腸中檢測(cè)到有一些SEZ6L和KIAA0786的甲基化，但腫瘤顯示了更強(qiáng)的甲基化信號(hào)。
如所期望的那樣，對(duì)于來(lái)自女性患者的所有組織樣本包括正常結(jié)腸粘膜都顯示有CXXl的部分甲基化，CXX1位于X染色體上。然而，14個(gè)男性患者中的3個(gè)顯示有腫瘤特異性的CXX1甲基化。S100A10和TIMP2的甲基化未在任何原發(fā)性CRC樣本中觀察到。FOLH1和PCDH8在被檢查的每個(gè)CRC樣本和對(duì)應(yīng)的正常樣本中均是同等地被甲基化。
1a組基因的甲基化模式與CRC和胃癌的關(guān)系 目前的結(jié)果表明SFRP1，SEZ6L，CXX1，KIAA0786，S100A10和TIMP2涉及腫瘤的發(fā)育和/或進(jìn)展。同樣，還在其他類型癌癥的腫瘤細(xì)胞系中檢查這些基因。出現(xiàn)了驚人的腫瘤特征模式，因?yàn)樵贑RC和胃癌中SFRP1，SEZ6L，LPPH1和CXX1的完全高度甲基化是很普遍的，而在研究的所有其他類型癌癥中通常僅觀察到部分甲基化或觀察不到甲基化(圖1)。SFRP1這種模式的例外是值得注意的。在MCF7乳癌細(xì)胞中已經(jīng)證明了SFRP1基因的促凋亡活性，該細(xì)胞并不具有這種基因的基底表達(dá)(Melkonyan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641，1997)。如在此公開(kāi)的，在MCF7細(xì)胞，以及MDA MB231乳癌細(xì)胞，和研究的4種前列腺癌細(xì)胞系中的2種中檢測(cè)到CpG島區(qū)域的完全甲基化(圖1)。
SFRP家族成員的甲基化和表達(dá)分析 為了進(jìn)一步表征上面討論的高度甲基化基因的分組以及最感興趣的基因之一，SFRP1在CRC細(xì)胞中的潛在作用，檢查其他的SFRP基因。在5個(gè)已經(jīng)鑒定的SFRP基因中，4個(gè)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在其第一個(gè)外顯子附近有致密的CpG島。SFRP3缺少5′CpG島，它在受測(cè)的7個(gè)CRC細(xì)胞系的每一個(gè)中均以基底水平表達(dá)。然而，其他3個(gè)SFRP基因的每一個(gè)在CRC細(xì)胞系中都是高度甲基化的，且具有非常高的頻率，這樣的高度甲基化與缺少基底表達(dá)是相關(guān)的，它們可通過(guò)DAC處理來(lái)恢復(fù)。
在原發(fā)性CRC組織(n＝124)中SFRP基因的甲基化分析是特別令人感興趣的。在正常結(jié)腸中這些基因不是高度甲基化的，除了結(jié)腸癌患者中SFRP2的微量甲基化，在該癌癥中這個(gè)基因是高度甲基化的。而且，正常結(jié)腸組織和來(lái)自其他組織的細(xì)胞系在缺少啟動(dòng)子甲基化的情況下表達(dá)這些基因。但在原發(fā)性CRC腫瘤中對(duì)所有四種基因均觀察到高度甲基化。在這種大量樣本分析中，它們發(fā)生的頻率是不同的，這里的分析包括了針對(duì)SFRP1的擴(kuò)展數(shù)據(jù)(SFRP1，124中的118個(gè)，95.1％；SFRP2，124中的111個(gè)，89.5％；SFRP4，124中的36個(gè)，29.0％；和SFRP5，73/124，58.9％)。驚人地是，24.1％(124中的30個(gè))顯示所有4個(gè)SFRP基因均發(fā)生CpG島的甲基化，在124個(gè)腫瘤中的123個(gè)(99.2％；圖2)中，這4個(gè)基因中至少有一個(gè)是甲基化的。
這些結(jié)果證明初始微陣列數(shù)據(jù)的邏輯挖采(logical mining)明顯地?cái)U(kuò)展了基因發(fā)現(xiàn)的關(guān)系。這些結(jié)果也揭示了基因家族的表觀遺傳學(xué)沉默與其在CRC中消除對(duì)WNT癌基因活性的阻斷的關(guān)聯(lián)。對(duì)于常見(jiàn)的人類癌癥來(lái)說(shuō)，SFRP基因家族的這種高度甲基化似乎提供了最大的分子標(biāo)記物范圍(見(jiàn)Esteller等，Cancer Res.613225-3229，2001)。
通過(guò)利用下面的觀察結(jié)果，即癌癥細(xì)胞中高度甲基化基因的轉(zhuǎn)錄沉默依賴于甲基化和HDAC活性之間的協(xié)同作用，而甲基化具有優(yōu)勢(shì)效應(yīng)(Cameron等，如上，1999)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出針對(duì)這些基因而篩選癌細(xì)胞基因組的方法?，F(xiàn)在的結(jié)果驗(yàn)證了這種概念，即染色質(zhì)的性質(zhì)與沉默的癌癥基因有關(guān)，后者則與啟動(dòng)子高度甲基化有關(guān)，并證明了該方法可有效地鑒定在腫瘤發(fā)生中具有極重要作用的基因。
從轉(zhuǎn)錄抑制染色質(zhì)的觀點(diǎn)出發(fā)，所公開(kāi)的策略提供了關(guān)于對(duì)使用的抑制劑有各種反應(yīng)的基因的啟動(dòng)子的重要信息。1a組基因的結(jié)果證實(shí)，如果單獨(dú)接受HDAC的抑制作用，則高度甲基化的基因是不會(huì)重新表達(dá)的。相比，2組基因的結(jié)果揭示，在單獨(dú)用HDAC抑制后重新表達(dá)或表達(dá)上調(diào)的那些基因是缺少啟動(dòng)子的甲基化的，即使CpG島存在于其5’區(qū)域中。本研究公開(kāi)了在用脫甲基試劑DAC處理細(xì)胞后表達(dá)上調(diào)的基因，即使這些基因的啟動(dòng)子本來(lái)未甲基化。類似的發(fā)現(xiàn)以前也有報(bào)道(Soengas等，Nature 409，207-211(2001)。上游基因如轉(zhuǎn)錄因子的甲基化可能繼而導(dǎo)致這些基因的活化，另一種可能性是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的抑制劑，如DAC，可以影響這些蛋白，但不是通過(guò)阻斷其甲基化能力來(lái)影響。最近的研究揭示了DNMT具有通過(guò)與HDAC和其他輔阻遏物蛋白的相互作用而直接抑制轉(zhuǎn)錄的潛力，而這不并依賴其甲基化活性(Rountree等，Nature Genet.25269-277，2000；Bachman等，J.Biol.Chem.27632282-32287，2001；Fuks等，Nature Genet.2488-91，2000；Fuks等，EMBO J.202536-2544，2001；Robertson等，Nature Genet.25338-342，2000)。
本研究最初使用的是已建立的細(xì)胞系，這可能對(duì)基因的檢測(cè)產(chǎn)生一些偏見(jiàn)，即認(rèn)為這些基因僅在培養(yǎng)中改變或啟動(dòng)子高度甲基化不是腫瘤特異性的(見(jiàn)，例如，Smiraglia等，Hum.Mol.Genet.101413-1419，2001)，然而，一對(duì)對(duì)原發(fā)性腫瘤和正常組織的仔細(xì)分析表明，所公開(kāi)的方法可有效地鑒定基因(12中的11個(gè))，對(duì)于這些基因，其表達(dá)的改變與高度甲基化的5’CpG島有關(guān)，在原代和培養(yǎng)的細(xì)胞中均是如此。通過(guò)微陣列方法檢測(cè)的12個(gè)基因中的7個(gè)，包括p16，COX2，TIMP3，SEZ6L，SFRP1，KIAA0786和CXX1，是在原發(fā)性腫瘤中特異地甲基化，或僅在來(lái)自CRC患者的正常結(jié)腸的區(qū)域內(nèi)甲基化，而所述基因在這些患者的CRC腫瘤中也都是甲基化的。另一個(gè)基因，TIMP2，在正常結(jié)腸、原發(fā)性CRC腫瘤或PBL中都不是甲基化的，而在惡性淋巴瘤中具有非常高頻率的高度甲基化。第9個(gè)基因，SNRPN，是一個(gè)印記基因，在沉默的等位基因的啟動(dòng)子中顯示有甲基化。另外兩個(gè)基因在正常結(jié)腸和原發(fā)性CRC中都是甲基化的；只有S100A10在原發(fā)性組織中沒(méi)有甲基化，盡管對(duì)這種基因的分析并不詳盡，但已經(jīng)有報(bào)道它在前列腺癌中是下調(diào)的(Chetcuti等，Cancer Res.616331-6334，2001)。
所公開(kāi)的微陣列方法進(jìn)一步鑒定了為數(shù)不少的以腫瘤特異性的方式高度甲基化基因。例如，一些基因如SFRP1在一些但不是全部CRC患者的正常結(jié)腸粘膜組織中是甲基化的，但沒(méi)有CRC的受試者則不會(huì)有這樣的甲基化。在正常組織中的這種甲基化反映了一種“場(chǎng)效應(yīng)(fieldeffect)”，其中惡化前的變化發(fā)生在結(jié)腸很廣泛的區(qū)域中，或者表明在正常結(jié)腸中某些CpG島有隨年齡變化而發(fā)生甲基化的傾向，正如對(duì)在CRC中頻繁地高度甲基化的一組基因的發(fā)現(xiàn)那樣(Toyota等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 968681-8686，1999)。場(chǎng)效應(yīng)更有可能性，因?yàn)樵谡＝M織中沒(méi)有甲基化的個(gè)體的年齡范圍從53至64歲，而一個(gè)46歲的老患者顯示在正常組織和腫瘤組織中均有甲基化。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是大多數(shù)被鑒定的基因具有已知的性質(zhì)或隱含的功能，它們?cè)谀[瘤發(fā)生中是很重要的。例如，1a組基因的大多數(shù)和其他組中的許多基因都定位在癌癥中經(jīng)歷頻繁LOH的染色體區(qū)域中，例如，SFRP1在染色體8p12，SEZ6L在22q11，和TIMP2在17q25(表1)。另外，許多已經(jīng)鑒定的基因編碼癌癥所涉及的通路的組分。例如，在1a組基因中，SFRP1可拮抗WNT癌基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Finch等，如上，1997)，用SFRP1轉(zhuǎn)染的乳癌細(xì)胞顯示出對(duì)促凋亡信號(hào)刺激的敏感性增加(Melkonyan等，如上，1997)。SFRP1的下調(diào)表達(dá)已經(jīng)在大多數(shù)乳癌中觀察到(Ugolini等，Oncogene 181903-1910，1999；Ugolini等，Oncogene 205810-5817，2001)。鼠SEZ6和大鼠latrophilin的表達(dá)限制在腦內(nèi)，但它們的人類同源物(SEZ6L和KIAA0786)已經(jīng)分別從肺癌和乳癌中頻繁被刪除的區(qū)域中被鑒定，盡管在人類中其功能還不清楚(Nishioka等，Oncogene 196251-6260，2000；White等，Oncogene 173513-3519，1998)。TIMP2是間質(zhì)金屬蛋白酶(TIMP)家族的組織抑制物的一個(gè)成員，所述TIMP家族還包括TIMP3，這是一個(gè)在各種惡性腫瘤中經(jīng)常被高度甲基化致使失活的基因(Bachman等，Cancer Res.59798-802，1999)。S100A10，也稱為膜聯(lián)蛋白II輕鏈或p11，它可與另一個(gè)鈣結(jié)合蛋白，膜聯(lián)蛋白II重鏈(p36；Kube等，Gene 102255-259，1991)形成異源四聚復(fù)合物。據(jù)報(bào)道，在前列腺癌中p36和p11蛋白表達(dá)經(jīng)常丟失，可能是由于p36基因的甲基化沉默(Chetcuti等，如上，2001)。CXX1是一個(gè)推定的異戊二烯化的蛋白(Frattini等，Genomics46167-169，1997)。SNRPN，可能參與前mRNA的剪接，它位于15q11-q13，這個(gè)區(qū)域涉及Prader-Will綜合征和Angelman綜合征(Nicholls等，Trends Genet.14194-200，1998)。
FOLH1和PCDH8也具有令人感興趣的特性。葉酸代謝影響DNA甲基化，一種葉酸鹽代謝酶，亞甲基四氫葉酸還原酶可影響對(duì)人類惡性腫瘤的易感性(Matsuo等，Blood 973205-3209，2001；Song等，Cancer Res.613272-3275，2001)。FOLH1參與了葉酸的攝取，在癌癥的DNA甲基化中具有一定的作用(Heston，W.D.，Urology 3A Suppl104-112，1997)。PCDH8是細(xì)胞-細(xì)胞粘附分子家族的一個(gè)成員(Strehl等，Genomics 5381-89，1998)，其功能的喪失對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移很重要。然而，F(xiàn)OLH1和PCDH8并沒(méi)有顯示腫瘤特異性或腫瘤優(yōu)勢(shì)性的甲基化。FOLH1最初被定性為前列腺特異膜抗原(PSMA)，它在前列腺癌中強(qiáng)烈表達(dá)；它還沒(méi)有在結(jié)直腸腫瘤中被研究過(guò)。在正常組織中，PCDH8在胎兒和成人的腦中專一性地表達(dá)。因此，F(xiàn)OLH1和PCDH8的甲基化可能是與基因表達(dá)有關(guān)的組織特異性現(xiàn)象，因?yàn)檫@些基因在CRC細(xì)胞中是沉默的，用DAC處理這些細(xì)胞可導(dǎo)致重新表達(dá)。
對(duì)包括基因家族SFRP在內(nèi)的多個(gè)基因在胃腸道腫瘤中發(fā)生高度甲基化的頻率偏好的鑒定表明，在染色質(zhì)構(gòu)成中的一個(gè)普遍缺陷可能使多個(gè)基因更易發(fā)生與啟動(dòng)子高度甲基化相關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默，這里所述的多個(gè)基因可以包括一個(gè)家族的相關(guān)基因。這個(gè)結(jié)果暗示了用于鑒定與正常細(xì)胞相比較在癌細(xì)胞中調(diào)控有差別的基因的其它方法。
從一種功能性的觀點(diǎn)來(lái)看，所有SFRP基因都被認(rèn)為可拮抗WNT/frizzled信號(hào)傳導(dǎo)(Finch等，如上，1997；Rattner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942859-2863，1997；Chang等，Hum.Mol.Genet.8575-583，1999；Abu-Jawdeh等，Lab.Invest.79439-447，1999)。這樣，SFRP基因功能的喪失可使整個(gè)腫瘤抑制基因通路失效。例如，APC的突變?cè)诮Y(jié)腸癌中很普遍，這可引起組成型的WNT通路作用(Morin等，Science 2751787-1790，1997；Behrens等，Science 280596-599，1998)。最初的結(jié)果表明APC的突變?cè)贑RC腫瘤中是經(jīng)常發(fā)生的，同時(shí)有SFRP基因高度甲基化的各種組合。然而，APC具有其它的功能(Mimori-Kiyosue和Tsukita，J.Cell Biol.1541105-1109，2001)。因此，通過(guò)其它機(jī)制對(duì)WNT活性進(jìn)行抑制的作用的喪失指出了一個(gè)對(duì)于結(jié)直腸腫瘤發(fā)生很重要的新的功能通路。
在此公開(kāi)的方法提供了一種手段，以鑒定各個(gè)類型癌癥中通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制發(fā)生沉默的基因的整個(gè)譜圖。發(fā)現(xiàn)這些新鑒定出的基因的甲基化模式與最初篩選的特定癌癥類型和相關(guān)的腫瘤類型形成了映射(見(jiàn)圖1)，這證實(shí)了啟動(dòng)子高度甲基化對(duì)人類癌癥的表征(profiling)的重要性。令人注意的是，CRC和胃腫瘤是由于喪失錯(cuò)配修復(fù)功能而表現(xiàn)出微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的表型的數(shù)種腫瘤類型中的兩種；在每一種中，起到聯(lián)系作用的都是涉及MLH1基因啟動(dòng)子的高度甲基化事件(Baylin和Herman，Trends Genet.16168-174，2000，在此整入以供參考)。因此，一系列這樣的標(biāo)記可用于檢查和操作調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的通路。而且，現(xiàn)在的結(jié)果證明，有限數(shù)量的高度甲基化基因就足以組成全面的標(biāo)記系列，它們可以用于特定類型的人類癌癥的靈敏檢測(cè)。上述的方法提供了用于在其它紊亂中鑒定這樣的基因系列的手段。
盡管本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)上述的實(shí)施例進(jìn)行了描述，要理解的是，各種修飾和變化包括在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明僅由權(quán)利要求書限制。
表1·RKO細(xì)胞中被DAC和TSA處理而上調(diào)的基因1a組Acc no.a基因名稱 符號(hào)位置CpG島b甲基化CR80217 前列腺素-內(nèi)源過(guò)氧化物合成酶2 PTGS2d1q25.2-q25.3是是(前列腺素G/H合成酶和環(huán)加氧酶)dAA877595 細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑2A(黑素瘤， CDKN2Ad9p21是是AA099153 金屬蛋白酶3的組織抑制劑 TIMP3d22q12.3 是是(索斯比基底營(yíng)養(yǎng)不良，假炎性)dAA444051 S100鈣-結(jié)合蛋白A10S100A10 1q21是是N32514 分泌型卷曲相關(guān)蛋白1 SFRP1 8p12-p11.1 是是W72596 CAAX序列盒1 CXX1Xq26是是H29013 發(fā)作相關(guān)基因6(鼠)-樣 SEZ6L 22q11.2-12.1是是W74533 latrophilin KIAA07861p31.1 是是AA486280 金屬蛋白酶2的組織抑制劑 T1MP2 17q25 是是H29216 原鈣依粘連蛋白8 PCDH8 13q14.3-q21.1 是是N64840 葉酸水解酶(前列腺特異膜抗原)1 FOLH1 11p11.2 是是A1017332 人SNRPN mRNA，3′UTR，部分序列SNRPN 15q12 是是N54793 妊娠特異的β-1-糖蛋白6PSG619q13.2 否H87471 犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶) KYNU2p23.3-q14.3否AA001432 層粘蛋白，a3(nicein(150kD)，kalinin(165kD)， LAMA3 18q11.2 否BM600(150kD)，epilegrin)AA034939 層粘蛋白，α2(merosin，先天的肌營(yíng)養(yǎng)不良，LAMA2) LAMA2 6q22-q23否A1298976 小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞族C，成員1(lymphotactin)SCYC1 1q21-q25否AA291484 細(xì)胞色素P450，亞族IVB，多肽1 CYP4B1 1p34-p12否R62603 膠原蛋白，VI型，a3COL6A3 2q37否T73558 脫氧核糖核酸酶1-樣3 DNASE1L33p21.1-3p14.3 否AA404246 人類假想蛋白MGC13047 10 否AA156424 ESTH16554 ESTN67972 EST
表1-續(xù)1b組Acc no.a基因名稱符號(hào) 位置 CpG島b甲基化CAA173290 同源序列盒A1HOXA1 7p15.3是部分的AA935273 GRO3癌基因 GRO3 4q21 是部分的AA256304 distal-less homeobox 7 DLX7 17q21.33 是部分的H17115 基質(zhì)抗原3 STAG3 7 是否AA454880 不均一核核糖核蛋白D HNRPD 4q21.1-q21.2 是否(富AU元件RNA結(jié)合蛋白1，37kD)AA496149 3-羥-3-甲基戊二?；?輔酶A合成酶2(線粒體)HMGCS21p13-p12 否AA176491 肌源性因子6(herculin) MYF6 12q21 否H16793 染色體8開(kāi)放閱讀框4 C8orf48p11.2否H10079 KIAA0751基因產(chǎn)物 8 否H59614 類似于推定的胰島素樣生長(zhǎng)因子II相關(guān)蛋白11p15.5 ukAA457731 SNARE蛋白 YKT6 6 ukAA419251 干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(9-27) IFITM111ukN48178 KIAA0403蛋6 ukAA027147 假想蛋白MGC3040 3 ukH18646 假想蛋白FLJ10697 10ukAA013268 含(CAG)4重復(fù)序列的人類mRNA，克隆CZ-CAG-7 UKukAA039857 ESTAA101632 ESTAA464518 ESTAA427754 ESTH16733 ESTH88953 ESTN90849 ESTN22486 ESTT62979 ESTR53558 ESTR39555 EST
表1-續(xù)組2Acc no.a基因名稱 符號(hào) 位置 CpG島b甲基化cAA425908 RAC1伴侶(arfaptin 2) POR1 11p15 是否AA405717 muscleblind(果蠅)-樣 MBNL 3 是否AA916906 TNFRSF1A-相關(guān)的經(jīng)死亡結(jié)構(gòu)域 TRADD 16q22 是否AA404394 蛋白二硫化物異構(gòu)酶-相關(guān)的 PDIP 3 是否AA489678 RAD23(釀酒酵母)同源物BRAD23B 3p25.1是否AA447514 核糖體蛋白L13 RPL13 16q24.3 是否AA071330 鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白). GNAI2 3p21 是否α-抑制活性多肽2AA669126 蛋白磷酸酶1，調(diào)節(jié)(抑制物)亞基12A PPPTR21A 12q15-q21 是否R38619 海藻糖-1-磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶 FPGT 1 是否AA055503 含tripartite基序-32 TRIM32 9q32-q34.11 是否T66981 含egf樣組件，粘液素樣，激素受體樣序列1EMR1 19p13.3 否AA480906 蛋白激酶C結(jié)合蛋白1PRKCBP120q12 否N45318 磷酸甘油酯變位酶2(肌肉) PGAM2 7p13-p12 否N30096 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A3GSTA3 6p12 否AA427733 advillin ADVIL 12否N92901 脂肪酸結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞 FABP4 8q21 否T60149 假想蛋白FLJ3449 13ukAA453578 染色體9-12-13.3上來(lái)自克隆RP11-3J10的人DNA序列9p12-p13.3ukW81520 來(lái)自PAC 106H8的人類基因，相似于Dynamin 1 ukAA446486 ESTAA447992 ESTH94605 ESTW46439 ESTaGenbank注冊(cè)號(hào).b是CpG島發(fā)現(xiàn)于假定的轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)周圍或緊挨上游區(qū)；否在假定的轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)周圍或緊挨上游區(qū)未發(fā)現(xiàn)CpG島；uk上游基因組序列未知.c是完全甲基化；部分的部分甲基化；否無(wú)甲基化作用.d陽(yáng)性對(duì)照基因.
表2·甲基化作用研究的引物序列基因名稱 方法正義 反義S100A10 亞硫酸氫鹽PCR TGAAGAGAAGTTTATAAGAAYGTTTTGT*(1)***CAACAAATCCRAACCTAAAAACTACCCA**(2)MSP(M) TCGCGTCGTTTTTTTTTATTTATTCGTC(3)AAACTCACCTTAACCGAAACGCGACG(4)MSP(U) GTTTTTGTGTTGTTTTTTTTTATTTATTTGTT(5)AACAAAACTCACCTTAACCAAAACACA(6)CXX1 亞硫酸氫鹽PCR GGAGTTTATGAGAGGGTTGGAGTTT(7) ATCACCCACTACAAAACRAACCCTA**(8)MSP(M) TGGATACGTATTTTCGGCGACGTTTC CAACGACGCGTCGCAAACCGAATCGMSP(U) TGGTTTTTGTGGATATGTATTTTTGGTGAT AATTCCTCCAACAACACATCACAAACCASEZ6L亞硫酸氫鹽PCR GGGGAATTGGYGTTAAATTTTGTAGGG*AAACAACTTCCRAAACCCCCTAAAC**MSP(M) TTCGGAAGTTGTTTCGGTTCGC CGAACATCGTAACTACAAAAAACGCGMSP(U) GGGTTTTGGAAGTTGTTTTGGTTTGT AACCACAAACATCATAACTACAAAAAACACASFRP1亞硫酸氫鹽PCR1 TGGTTTTGTTTTTTAAGGGGTGTTGAGT(19) ACACTAACTCCRAAAACTACAAAACTAAA**(20)亞硫酸氫鹽PCR2 TTAGTTTTGTAGTTTTYGGAGTTAGTG*TCCTAGCRCAAACTTCCAAAAACCTCC**MSP(M) TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC CCTACGATCGAAAACGACGCGAACGMSP(U) GTTTTGTAGTTTTTGGAGTTAGTGTTGTGT CTCAACCTACAATCAAAAACAACACAAACALPHH1亞硫酸氫鹽PCR GTTAAAGTTTAGTTGGTTTTAYGTAATTAT*CTTTTAATTTCCRTAACCCTCCTTTTAT**MSP(M) ATTAATTTTGGAGCGTTTTTCGCGCGTC TCCACGCACCGAACCAAAAACCCCGMSP(U) ATGTATTAATTTTGGAGTGTTTTTTGTGTGTT TCTCCACACACCAAACCAAAAACCCCATIMP2亞硫酸氫鹽PCR AGATAAAGAGGAGAGAAAGTTTGCCAACAACAAAAAACCRAAC**MSP(M) ATTCGTAGAAGGTAGCGCGGTCGTC CTCACCTACCCCGCTCGACCGCGMSP(U) ATATATTTGTAGAAGGTAGTGTGGTTGTT TCCTCACCTACCCCACTCAACCACASNRPN亞硫酸氫鹽PCR GTTATYGGTATAGTTGATTTTGT*(39) CTCCCCCCAAATCATTCCRATAA**(40)FOLH1亞硫酸氫鹽PCR GAGGTATTAGTGAGATTGAGAGAGATTT CCCTAAAAAAAACCAACAACAAAATCCCAMSP(M) TTCGTCGTGGTGGTTGGAGGGCGC CAACGCACAACCAACGCGAACGACGMSP(U) TTATTTTGTTGTGGTGGTTGGAGGGTGT CCCCAACACACAACCAACACAAACAACAPCDH8亞硫酸氫鹽PCR AAGGGATTGTTAGAGGTAGGYGGAG*CACAAAACTCATACCTCCAACCTCAHOXA1亞硫酸氫鹽PCR TTATGGAGGAAGTGAGAAAGTTGG TCTACACCCCCCTACCCACTAAAAGRO3 亞硫酸氫鹽PCR TAGGAATTTGGGGTAGAAAATGAATATTT ACCCRAACTATATAACTCCCCAAAATC**DLX7 亞硫酸氫鹽PCR GGAGAGTTAGGYGGGTTAGAGTTGA*CTACAAAAAAAATAACCATATCTCCMPS(M) GATTTTTCGCGGCGGTATCGTAGCGC CAACCCCTTCCTTCGTTAAACAACGCGMSP(U) GATTAGATTTTTTGTGGTGGTATTGTAGTGTAACAACCCCTTCCTTCATTAAACAACACAHNRNP亞硫酸氫鹽PCR GAAGGGGGTAGGTTAGGGAGAGG(59)CCACCATAACTCCCTCCTACTC(60)MSP(M) TGATCGGGACGCGTCGTTTTTTCGTC CTTCGCCTCCCACTCTCGCGCGACGMSP(U) TTATGTGATTGGGATGTGTTGTTTTTTTGTTCCCTTCACCTCCCACTCTCACACAACA
表2續(xù)基因名稱方法 正義 反義STAG3 亞硫酸氫鹽PCR TGGTATTTAGGAGGTTGGTGAAATA ACCCTCAATCTCCTACTCCATTAAAMSP(M)GCGGGGTTAAAGCGGGTCGTTCGC AAAAATATACGAACTAATACGCGCCACGMSP(U)GGGTGGGGTTAAAGTGGGTTGTTTGT TAAAAATATACAAACTAATACACACCACAPOR1亞硫酸氫鹽PCR GTAGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTT AACATCTTACCCTCTAAACAAATTTATACMSP(M)GTTTCGTTTTTATAATTTGCGACGTGGTC CTCAAAACGCCAAACCCGAACCGCGMSP(U)GTGATGTTAGTTTTGTTTTTATAATTTGTGAT TCCCCTCAAAACACCAAACCCAAACCAMBNL亞硫酸氫鹽PCR GAATTTATTGGTGTGTTTAGTAGTYGG*CCCRAACCACAAAATCRCCTATCAAC**MSP(M)GGGAGGGCGTTCGGTTTGTACGTTC(79) CATAAACGATCGCCCAACGACGCCG(80)MSP(U)AGTGGGAGGGTGTTTGGTTTGTATGTTT CAAATCATAAACAATCACCCAACAACACCARAD23B 亞硫酸氫鹽PCR AGGAGGAAGTTTTAGGAGTTTTTG CTAACTCACCACAAAATAATAACCMSP(M)TCGTGGTTGGCGTTCGGCGCGTGA ACCGCCGCGCAACTCGACTACCGAMSP(U)TTGTGGTTGGTGTTTGGTGTGTGA ATACCACCACACAACTCAACTACCRPL13 亞硫酸氫鹽PCR GTGTTTTATAAATGTGAATAAATAGAATTT CAATACACTCTAAAATAATAACAAAACCMSP(M)TTTTAGGGTTGTCGGGAGAGTCGCGG CAACCGAACGAAAAAAAAACGACCCCGMSP(U)GTGGTTTTAGGGTTGTTGGGAGAGTTGT AAAACAACCAAACAAAAAAAAAACAACCCCATRADD 亞硫酸氫鹽PCR GGTATTAGAAAATTTTGGTTTTTAGGGGG ACCCACCCACCTACTACACTAACCTAMSP(M)ACGGGAAGTAGTTATCGGGAGTTCGC GACGAAACCTAAATTCCCACGCCCGMSP(U)TGGATGGGAAGTAGTTATTGGGAGTTTGT(99) CTCAACAAAACCTAMTTCCCACACCCA(100)FPGT亞硫酸氫鹽PCR GTTATTTGTTTTTGAGATYGTTGTTAGAG*CTAACAACTACCATAACCCCACCTTCPDIR亞硫酸氫鹽PCR AGTGGAGAAAGGAGTTAGYGGTGGGTA*CCTACCTAACATACACRCCCTCATCCC**GNAl2 亞硫酸氫鹽PCR GGTTTAGTTATAGGTTTGGTTYGTTTAGG*CTCACCCAACAACAACAACTTCACCTCMYPT1 亞硫酸氫鹽PCR GGGTTATATTYGTTTTTTTTTGGTGGTTTA*CCTCCCTTCCTACCACAAAAACCCTCHT2A亞硫酸氫鹽PCR GTTTTTAGAGGAAAGTTTATTTTTGTAGGG(109)ATCCCCAATCCCCAACCCTCCTTCCC(110)*Y＝C或T**R＝A或G***SEQ ID NO-編號(hào)從1至110，從左至右，從上至下；顯示了代表性的SEQ ID NOS。
表3-SFRP基因的引物序列基因 方法 正義 反義SFRP2 MSP1(M)*GGGTCGGAGTTTTTCGGAGTTGCGC(111)**CCGCTCTCTTCGCTAAATACGACTCG(112)MSP1(U)*TTTTGGGTTGGAGTTTTTTGGAGTTGTGT AACCCACTCTCTTCACTAAATACAACTCAMSP2(M) AAAATAAGTTCGGGTTTCGGCGGTACCAATAAACGAACAAAACGCGAACTACGMSP2(U) GTAAAATAAGTTTGGGTTTTGGTGGTAT CACAATAAACAAACAAAACACAAACTACAMSP3(M) TTAGTATTTGGTCGCGAGGTCGTTC CCCTAAATACCGCCGCTCGCCCGMSP3(U) TTGTTAGTATTTGGTTGTGAGGTGTTT CCCCTAAATACCACCACTCACCCART-PCRGATGATGACAACGACATAATGGAAACG GAGTGTGCTTGGGGAACGGGAGCTSFRP4 MSP1(M) AGTTGTTAAGGGAGCGTTTCGAGTTTAC CTCAACCTTCGAAAACGAACCCGCCGMSP1(U) GTAGTTGTTAAGGGAGTGTTTTGAGTTTATCTCTCAACCTTCAAAAACAAACCCACCAMSP2(M)*GGGTGATGTTATCGTTTTTGTATCGAC(129) CCTCCCCTAACGTAAACTCGAAACG(130)MSP2(U)*GGGGGTGATGTTATTGTTTTTGTATTGAT CACCTCCCCTAACATAAACTCAAAACAMSP3(M) GGTTGCGTTTCGAGTTGCGGAGTTC TCCAATCGACAACAAAACGAAACGCGMSP3(U) GTTGGTTGTGTTTTGAGTTGTGGAGTTT AACTCCAATCAACAACAAAACAAAACACART-PCRGGTACAGGAAAGGCCTCTTGATGTTGGGATCTTTTACTAAGCTGATCTCTCCSFRP5 MSP1(M)*AAGATTTGGCGTTGGGCGGGACGTTCACTCCAACCCGAACCTCGCCGTACGMSP1(U)*GTAAGATTTGGTGTTGGGTGGGATGTTT AAAACTCCAACCCAAACCTCACCATACAMSP2(M) CGTTTTGGAGTTGGGGTTAGGCGGTCAAATAAATAACAACCTACGCTACGAACGMSP2(U) TTTGTTTTGGAGTTGGGGTTAGGTGGTT CCAAATAAATAACAACCTACACTACAAACART-PCRTGCGCCCAGTGTGAGATGGAGCAC(147) CCCATCCCTTAGGCCTTGTGCCAGT(148)*引物顯示于圖6并用于原發(fā)性組織樣本分析**SEQ ID NO-編號(hào)從111-148，從左至石，從上至下；顯示了代表性的SEQ ID NOS。
表4組1a 基因名稱 符號(hào) RT引物(正義)RT引物(反義)Ace No.aR80217前列腺素-內(nèi)源過(guò)氧化物合成酶2 PTGS2d TAAACAGACATTTATTCCAGAC(149)**GAAAGAAATAGTCAATATGCTTG(150)(前列腺素G/H合成酶和環(huán)加氧酶)dAA877595 細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑2A(黑素瘤， CDKN2Ad AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG CTGCCCATCATCATGACCTGGAp16，抑制CDK4)dAA099153 金屬蛋白酶3的組織抑制劑 TIMP3d CAGCTGGAGCCTGGGGGACTG CCTTGCGCTGGGAGAGGGTGAGAA444051 S100鈣-結(jié)合蛋白A10S100A10 TTTCTCTGCTTGTCAAATGAGAGTCTTAACAAAGGAGGACCTGAGAGN32514分泌型卷曲相關(guān)蛋白1 SFRP1TTGTAGTTATCTTAGAAGATAGCATGG ACGGGAATTACTATTAACATAAGCGW72596CAAX序列盒1 CXX1 CTGCTGCCGCCCCTGGGCCTCAC(159)GTAGTGTATTAGAGCAGAGCAGAATG(160)H29013發(fā)作相關(guān)基因6(鼠)-樣 SEZ6LCCCAGGAGAATGCCTACCTTTG AAACTGCCAAACAGCCCAGAAGGW74533latrophilin LPHH1CTGTGGTTGATTGCTAGTGGT AAGTGACTGAACCTTGCAGTTCTAA486280 金屬蛋白酶2的組織抑制劑 TIMP2CCCTCCTCGGCAGTGTGTGGGGTCGGGATGTCAGAGCTGGACCAGTCGAAH29216原鈣依粘連蛋白8 PCDH8ATTACTGTGCTTATAAGTGACACGGAAGTTATTGCCAAAGGAACTGTN64840葉酸水解酶(前列腺特異膜抗原)1 FOLH1GTTCGAGGAGGGATGGTGTTTGAGC(169) ATACCACACAAATTCAATACGGATTCT(170)A1017332 人SNRPN mRNA，3′UTR，部分序列SNRPNAATGACACTCTGAAATCCAGTC CTATTGTGTGATAGGCTCTGTN54793妊娠特異的β-1-糖蛋白6PSG6 TGAGTGGTAGCAAGGTTTACA ATTTCAGCCTCTTCCGAATCTH87471犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶) KYNU TTAAAAATCGAATAATACTGAAATAACCGGGGTGCCCAGCCTAACAATAAAA001432 層粘蛋白，a3(nicein(150kD)，kalinin(165kD)， LAMA3TCTCTGAAGAAGGAGGTCATGT GGAGGGAGGTGCATTGGGTAATBM600(150kD)，epilegrin)AA034939 層粘蛋白，α2(merosin，先天的肌營(yíng)養(yǎng)不良，LAMA2) LAMA2AAAGCAGTTGGTGGATTCAAAG(179) TTATTAGTTGGCTGGGCATGA(180)A1298976 小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞族C，成員1(lymphotactin)SCYC1TTCTTTACACATCAGTCACAAG GGGTGTTGAGTTACCAGATGAAA291484 細(xì)胞色素P450，亞族IVB，多肽1 CYP4B1 AAAGAAACACATCTCAGTGAAGGGCAGGAGGCTTGTAGTTTAGAAGGR62603膠原蛋白，VI型，a3COL6A3 AGTTAGCCACTGCTGGTGTTCCCTCCCTCCAGCACACAAAT73558脫氧核糖核酸酶I-樣3 DNASE1L3 CCAGAGACATCCGTTAAGGAGA TTGGGTCTAGGAGCGTTTGCTAA404246 人類假想蛋白MGC13047 MGC13047 TCTTGAGCATTGTGGTGGCCTTA(189)TTCGGGCTTCCTGGAGGGAACA(190)AA156424 ESTGCAACATGAAGATTCTGAAGGGT ACAGCAAACTGCATTTACCATCGH16554ESTTTGGAAAGA TCGTCCTGGTGC AACTTCTGGCCCTCGGAGGAAN67972ESTAACAGCAAGCATGACATATTCA GCAGAGAGAATGTGAGGAACCTT組1bAA173290 homeo box A1 HOXA1ATGCCTCAGAGGGTAGCCTTG ATTACAGACATCCTAAGACCCGAA935273 GRO3致癌基因 GRO3 TCATCAAACATAGCTCAGTCCT(199) CCAAGGGAAAGAGAAACGCTG(200)AA256304 distal-less homeobox 7DLX7 TTTCTCTGGAGGACAAGCAGTTAGTTTCTCTGCATCTCTTCTACCTCCH17115基質(zhì)抗原3 STAG3ACCTGGAGCTGTTCCTGC GTAACAGCTCTTCAAGCTCCT
表4組1b 基因名稱 符號(hào) RT引物(正義) RT引物(反義)AA454880 不均一核核糖核蛋白D HNRPD GGTGGTTATGGAGGATATGACCCAGTAAGACACTAGTAGATC(富AU元件RNA結(jié)合蛋白1，37kD)AA496149 3-羥-3-甲基戊二?；?輔酶A合成酶2(線粒體) HMGCS2 ATTTGGAGATTCACAGGAACAGC CCACTCTTAGCTGGTAAATGAAT
H10079KIAA0751基因產(chǎn)物 KIAA0751 AACCATCTTGCTTTCCTTAAATTC(209)CCCACCCTTCTTCACCCGCTTT(210)AA176491 肌源性因子6(herculin)MYF6 TACAATACCAGGATCCTCGCACAT TTGGAACTGCGAGTGGCTTAGH16793染色體8開(kāi)放閱讀框4 C8ORF4 TATTATTGTTGCATGACATTTGC AAAGTGCACCCACATGGATGTTAH59614類似于推定的胰島素樣生長(zhǎng)因子II相關(guān)蛋白 GCTTTATTGGGATTGCAAGCGT GGGCTGCCTGTCTGACCTCAA457731 SNARE蛋白YKT6 GGGCGGACGCATGATAGCTGTA GTCTTGTTCTTTGACAGAAGCTCN48178KIAA0403蛋白 KIAA0403 TTCACATAGCACACAAGTGAC(219) GACCTCTACTTCCTTGGAGCTT(220)AA419251 干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(9-27) IFITM1 CACAAGCACGTGCACTTTATTGAA TAGTAGCCGCCCATAGCCTGCAA027147 假想蛋白MGC3040 MGC3040AATGTTTCTCATTAAGTCAGGGT CCAGCCAATGGCGACTATAGAGAH18646假想蛋白FLJ10697 FLJ10697 CCCACGTTTATTTACATATGAGTTTTGTGTATATATAGATACTTGCAA013268 含(CAG)4重復(fù)序列的人類mRNA，克隆CZ-CAG-7GCAGAGTTTCACTGTATCAACTGAAGATTGTAGGGCTTAGATAA039857 EST TATTTGTGGCTCCTTCCCACTT(229) CCTCCTGCCCTCATGCCTGTAA(230)AA101632 EST CGCGTTGCATCCCTTGGATTGTA CCACGGTTGGTTAATAGTCCCTTAA464518 EST AAGTACACAAGTGGTAAGTATAG ACTCTTTGATTACAAGCACTGGAA427754 EST ATGCACACATGTTTAATTGTAG CGTAGGTATACACGTGCCATH16733EST TGCCAAGTGCAATGTTCCAGAAA TTTCGGGAGAACCCAACCTAAGH88853EST TGCTTAGGATATAGCATGAAA(239) TATCGGCATAGATATATGAGT(240)N90849EST AAATGCTTTGGAATCCCTGAGA TGTGCTTAAGTGGCAGGATN22486EST ACAAGTTTAAGAAGAACAAAGCTG TATGGACATCCAGTTGTTCCAGCAT62979EST AGGAGGGAAGGGTAACAACTCAT AGAATGTGGATGACCCCTCGGAAGR53558EST GTCAGTCTGCTCACTCCACCGT CGGATGTGGAAACCTTTCAGGAR39555EST TATCACAAGCATTTATTGAGTACC(249)TATTCTAGATATTTACTCCTTCG(250)組2AA425908 RAC1伴侶(arfaptin 2) POR1 ACAAAGGATGTACCATGTCCAA CAGATCAAGGTGATGCACAAGAA405717 museleblind(果蠅)-樣 MBNL CATACAGCAAAGTCAACTACTGC ACGCAGTTCAAATTTCATGGTTTAA916906 TNFRSF1A-相關(guān)的經(jīng)死亡結(jié)構(gòu)域 TRADD TTTGGAGAACCTGGATGGCCTATCTGCAGCACCCAGGATGAAAA404394 蛋白二硫化物異構(gòu)酶-相關(guān)的PDIR AGAGCCCACGTGGGAAGA CAGGTATCATTCACAGTGTAAT
表4組1a基因名稱 符號(hào)RT引物(正義)RT引物(反義)AA489678RAD23(釀酒酵母)同源物BRAD23B TGCCATGAGATATCTTGATTGT(259) GGGCCAATGGAGAAATGCAGC(260)AA447514核糖體蛋白L13 RPL13 TATACAGTCTTCCCACTTCACT TTCTGCCTGATCATCCCATTGTAAA071330鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白) GNA12 AAGCTACGAGAATGAGCAGGTG GTCTTGTTCTGTGATGAGGGGα-抑制活性多肽2AA669126肌球蛋白磷酸酶，目標(biāo)亞基1 MYPT1 GAAGATCAGTTAATGTCACTCC TGGTAGAAGACAAGATGATTTGR38619 海藻糖-1-磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶 FPGTTGAATGACAAAGACATAACATCC CTCAAGTTATGTGTCCCTATATTAA055503TAT相互作用蛋白，72KD HT2ATTCCGCTGCATTGCTGGCATGT(269) GCCTTGGAAGTGCCTAATTGCT(270)T66981 含egf樣組件，粘液素樣，激素受體樣序列1EMT1AGTCCCAGACCTCAAGGATCT GGGTAAATCAGTCAGACAGGCAA480906蛋白激酶C結(jié)合蛋白1PRKCBP1 CAGCTCAGTCACAGGAGAGATACAGTTCGCATCCTCTTAACN45318 磷酸甘油酯變位酶2(肌肉) PGAM2 CTCACAGGCTTCAACAAGGCA GGGAGGTGCCTTTATTGCCCAN30096 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A3GSTA3 TAGCATATAATTGGAAAGGGTTC AAGTGTTACAGAGCCATGGACAAAA427733advillin AVlLCTTTGACACATTACAGATCTGGG(279)CATCCTTGCATTCCTTGCTTGTT(280)N92901 脂肪酸結(jié)合蛋白4，脂肪細(xì)胞 FABP4 TTAACCAACGTAACCATATTGAATAAA AGGATGATAAACTGGTGGTGGAATT60149 假想蛋白FLJ3449 FLJ13449GCACATTAAACAGCATACATACC CCCTGTTCCTTGTGGAAACCTATAA453578染色體9p12-133上來(lái)自克隆RP11-3J10的人DNA序列 TTGCCCATAACTCACTGTGGCCT AAATCTGGCTGGAACGGGACAW81520 來(lái)自PAC 106H8的人類基因，相似于DynaminTGTCTTTAGGAGACGTGAGAAAG CTTCCACGGATTACTGACAGAGAA446486EST AACTTAGCACATTAACTGCAGC(289) TGCCTGAAATCCCACTACTTGG(290)AA447992EST CATTTATCTTGATCAAACCCACC ATGCTTTCTGAAGAGTGAGCCCH94605 EST CGTGGTACCTAAACATGGACAC TCTCATTGTAGGTCTCCTAAAGW46439 EST TTTGAAGCACTAAGATCAATAC(295) TTGCGAACGCGTCTGTGA(296)*Acc.No.，Genbank注冊(cè)號(hào)。bCpG島，‘是’，CpG島發(fā)現(xiàn)于假定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍或緊挨上游區(qū)‘否’，在假定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍或緊挨上游區(qū)未發(fā)現(xiàn)CpG島；‘UK’，上游基因組序列未知；c甲基化作用，‘是’，完全甲基化；‘部分的’，部分甲基化；‘否’，無(wú)甲基化作用。
d陽(yáng)性對(duì)照基因。
**-SEQ ID NO-編號(hào)從149至296，從左至右，從上至下；顯示了代表性的SEQ ID NO。
序列表<110>約翰霍普金斯大學(xué)<120>針對(duì)與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學(xué)沉默基因的基因組篩選<130>CPUSZ41965<150>US 60/362,422<151>2002-03-07<160>296<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>1tgaagagaag tttataagaa ygttttgt 28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>2caacaaatcc raacctaaaa actaccca 28<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>3tcgcgtcgtt tttttttatt tattcgtc 28<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>4aaactcacct taaccgaaac gcgacg 26<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>5gtttttgtgt tgtttttttt tatttatttg tt 32<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>6aacaaaactc accttaacca aaacaca 27<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>7ggagtttatg agagggttgg agttt 25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>8atcacccact acaaaacraa cccta 25<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>9tggatacgta ttttcggcga cgtttc 26<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>10caacgacgcg tcgcaaaccg aatcg 25<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>11tggtttttgt ggatatgtat ttttggtgat 30<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>12aattcctcca acaacacatc acaaacca28<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>13ggggaattgg ygttaaattt tgtaggg 27<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>14aaacaacttc craaaccccc taaac 25<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>15ttcggaagtt gtttcggttc gc 22<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>16cgaacatcgt aactacaaaa aacgcg 26<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>17gggttttgga agttgttttg gtttgt 26<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>18aaccacaaac atcataacta caaaaaacac a31<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>19
tggttttgtt ttttaagggg tgttgagt 28<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>20acactaactc craaaactac aaaactaaa 29<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>21ttagttttgt agttttygga gttagtg27<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>22tcctaccrca aacttccaaa aacctcc27<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>23tgtagttttc ggagttagtg tcgcgc 26<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>24cctacgatcg aaaacgacgc gaacg 25
<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>25gttttgtagt ttttggagtt agtgttgtgt 30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>26ctcaacctac aatcaaaaac aacacaaaca 30<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>27gttaaagttt agttggtttt aygtaattat 30<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>28cttttaattt ccrtaaccct ccttttat28<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>29attaattttg gagcgttttt cgcgcgtc28
<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>30tccacgcacc gaaccaaaaa ccccg 25<210>31<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>31atgtattaat tttggagtgt tttttgtgtg tt 32<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>32tctccacaca ccaaaccaaa aacccca27<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>33agataaagag gagagaaagt ttg23<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>34ccaacaacaa aaaaccraac20
<210>35<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>35attcgtagaa ggtagcgcgg tcgtc25<210>36<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>36ctcacctacc ccgctcgacc gcg 23<210>37<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>37atatatttgt agaaggtagt gtggttgtt29<210>38<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>38tcctcaccta ccccactcaa ccaca25<210>39<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>39gttatyggta tagttgattt tgt 23<210>40
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>40ctccccccaa atcattccra taa 23<210>41<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>41gaggtattag tgagattgag agagattt28<210>42<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>42ccctaaaaaa aaccaacaac aaaatccca 29<210>43<211>24<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>Amplification primer<400>43ttcgtcgtgg tggttggagg gcgc24<210>44<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>44caacgcacaa ccaacgcgaa cgacg 25<210>45<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>45ttattttgtt gtggtggttg gagggtgt 28<210>46<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>46ccccaacaca caaccaacac aaacaaca 28<210>47<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>47aagggattgt tagaggtagg yggag 25<210>48<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>48cacaaaactc atacctccaa cctca 25<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>49ttatggagga agtgagaaag ttgg 24<210>50<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>50tctacacccc cctacccact aaaa24<210>51<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>51taggaatttg gggtagaaaa tgaatattt 29<210>52<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>52acccraacta tataactccc caaaatc 27<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>53ggagagttag gygggttaga gttga 25<210>54<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>54ctacaaaaaa aataaccata tctcc 25<210>55<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>55gatttttcgc ggcggtatcg tagcgc26<210>56<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>56caaccccttc cttcgttaaa caacgcg 27<210>57<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>57gattagattt tttgtggtgg tattgtagtg t 31<210>58<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>58aacaacccct tccttcatta aacaacaca 29<210>59<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>59gaagggggta ggttagggag agg 23<210>60<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>60ccaccataac tccctcctac tc 22<210>61<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>61tgatcgggac gcgtcgtttt ttcgtc 26<210>62<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>62cttcgcctcc cactctcgcg cgacg 25<210>63<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>63ttatgtgatt gggatgtgtt gtttttttgt t 31<210>64<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>64cccttcacct cccactctca cacaaca27<210>65<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>65tggtatttag gaggttggtg aaata 25<210>66<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>66accctcaatc tcctactcca ttaaa 25<210>67<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>67gcggggttaa agcgggtcgt tcgc24<210>68<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>68aaaaatatac gaactaatac gcgccacg28<210>69<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>69gggtggggtt aaagtgggtt gtttgt 26<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>70ttaaaaatat acaaactaat acacaccaca 30<210>71<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>71gtagttgttg ttgttgttgt tgttgttt28<210>72<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>72aacatcttac cctctaaaca aatttatac 29<210>73<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>73gtttcgtttt tataatttgc gacgtggtc 29<210>74<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>74ctcaaaacgc caaacccgaa ccgcg 25<210>75<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>75gtgatgttag ttttgttttt ataatttgtg at 32<210>76<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>76tcccctcaaa acaccaaacc caaacca 27<210>77<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>77gaatttattg gtgtgtttag tagtygg 27<210>78<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>78cccraaccac aaaatcrcct atcaac26<210>79<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>79gggagggcgt tcggtttgta cgttc 25<210>80<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>80
cataaacgat cgcccaacga cgccg25<210>81<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>81agtgggaggg tgtttggttt gtatgttt 28<210>82<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>82caaatcataa acaatcaccc aacaacacca 30<210>83<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>83aggaggaagt tttaggagtt tttg 24<210>84<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>84ctaactcacc acaaaataat aacc 24<210>85<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>85tcgtggttgg cgttcggcgc gtga 24
<210>86<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>86accgccgcgc aactcgacta ccga24<210>87<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>87ttgtggttgg tgtttggtgt gtga24<210>88<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>88ataccaccac acaactcaac tacc24<210>89<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>89gtgttttata aatgtgaata aatagaattt 30<210>90<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>90caatacactc taaaataata acaaaacc28
<210>91<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>91ttttagggtt gtcgggagag tcgcgg 26<210>92<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>92caaccgaacg aaaaaaaaac gaccccg27<210>93<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>93gtggttttag ggttgttggg agagttgt 28<210>94<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>94aaaacaacca aacaaaaaaa aaacaacccc a 31<210>95<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>95ggtattagaa aattttggtt tttaggggg 29
<210>96<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>96acccacccac ctactacact aaccta 26<210>97<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>97acgggaagta gttatcggga gttcgc 26<210>98<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>98gacgaaacct aaattcccac gcccg25<210>99<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>99tggatgggaa gtagttattg ggagtttgt29<210>100<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>100ctcaacaaaa cctaaattcc cacaccca 28<210>101
<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>101gttatttgtt tttgagatyg ttgttagag 29<210>102<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>102ctaacaacta ccataacccc accttc 26<210>103<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>103agtggagaaa ggagttagyg gtgggta27<210>104<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>104cctacctaac atacacrccc tcatccc27<210>105<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>105ggtttagtta taggtttggt tygtttagg 29<210>106<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>106ctcacccaac aacaacaact tcacctc27<210>107<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>107gggttatatt ygtttttttt tggtggttta 30<210>108<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>108cctcccttcc taccacaaaa accctc 26<210>109<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>109gtttttagag gaaagtttat ttttgtaggg 30<210>110<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>110atccccaatc cccaaccctc cttccc 26<210>111<211>25<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>111gggtcggagt ttttcggagt tgcgc 25<210>112<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>112ccgctctctt cgctaaatac gactcg 26<210>113<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>113ttttgggttg gagttttttg gagttgtgt 29<210>114<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>114aacccactct cttcactaaa tacaactca 29<210>115<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>115aaaataagtt cgggtttcgg cggtac 26<210>116<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>116caataaacga acaaaacgcg aactacg 27<210>117<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>117gtaaaataag tttgggtttt ggtggtat28<210>118<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>118cacaataaac aaacaaaaca caaactaca 29<210>119<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>119ttagtatttg gtcgcgaggt cgttc 25<210>120<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>120ccctaaatac cgccgctcgc ccg 23<210>121<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>121ttgttagtat ttggttgtga ggttgttt28<210>122<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>122cccctaaata ccaccactca ccca24<210>123<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>123gatgatgaca acgacataat ggaaacg 27<210>124<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>124gagtgtgctt ggggaacggg agct24<210>125<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>125agttgttaag ggagcgtttc gagtttac28<210>126<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>126ctcaaccttc gaaaacgaac ccgccg 26<210>127<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>127gtagttgtta agggagtgtt ttgagtttat 30<210>128<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>128ctctcaacct tcaaaaacaa acccacca28<210>129<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>129gggtgatgtt atcgtttttg tatcgac 27<210>130<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>130cctcccctaa cgtaaactcg aaacg 25<210>131<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>131gggggtgatg ttattgtttt tgtattgat 29<210>132<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>132cacctcccct aacataaact caaaaca 27<210>133<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>133ggttgcgttt cgagttgcgg agttc 25<210>134<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>134tccaatcgac aacaaaacga aacgcg26<210>135<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>135gttggttgtg ttttgagttg tggagttt 28<210>136<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>136aactccaatc aacaacaaaa caaaacaca 29<210>137<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>137ggtacaggaa aggcctcttg atgttg 26<210>138<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>138ggatctttta ctaagctgat ctctcc 26<210>139<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>139aagatttggc gttgggcggg acgttc 26<210>140<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>140actccaaccc gaacctcgcc gtacg 25<210>141<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>141
gtaagatttg gtgttgggtg ggatgttt 28<210>142<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>142aaaactccaa cccaaacctc accataca 28<210>143<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>143cgttttggag ttggggttag gcggtc26<210>144<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>144aaataaataa caacctacgc tacgaacg 28<210>145<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>145tttgttttgg agttggggtt aggtggtt 28<210>146<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>146ccaaataaat aacaacct acactacaaaca30
<210>147<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>147tgcgcccagt gtgagatgga gcac24<210>148<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>148cccatccctt aggccttgtg ccagt 25<210>149<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>149taaacagaca tttatttcca gac 23<210>150<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>150gaaagaaata gtcaatatgc ttg 23<210>151<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>151agccttcggc tgactggctg g 21
<210>152<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>152ctgcccatca tcatgacctg ga 22<210>153<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>153cagctggagc ctgggggact g 21<210>154<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>154ccttgcgctg ggagagggtg ag 22<210>155<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>155tttctctgct tgtcaaatga gagt24<210>156<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>156cttaacaaag gaggacctga gag 23
<210>157<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>157ttgtagttat cttagaagat agcatgg 27<210>158<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>158acgggaatta ctattaacat aagcg25<210>159<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>159ctgctgccgc ccctgggcct cac 23<210>160<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>160gtagtgtatt agagcagagc agaatg 26<210>161<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>161cccaggagaa tgcctacctt tg 22<210>162
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>162aaactgccaa acagcccaga agg 23<210>163<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>163ctgtggttga ttgctagtgg t 21<210>164<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>164aagtgactga accttgcagt tct 23<210>165<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>165ccctcctcgg cagtgtgtgg ggtc24<210>166<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>166gggatgtcag agctggacca gtcgaa 26<210>167<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>167attactgtgc ttataagtga cacg 24<210>168<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>168gaagttattg ccaaaggaac tgt23<210>169<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>169gttcgaggag ggatggtgtt tgagc 25<210>170<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>170ataccacaca aattcaatac ggattct27<210>171<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>171aatgacactc tgaaatccag tc 22<210>172<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>172ctattgtgtg ataggctctg t21<210>173<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>173tgagtggtag caaggtttac a21<210>174<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>174atttcagcct cttccgaatc t21<210>175<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>175ttaaaaatcg aataatactg aaataacc 28<210>176<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>176ggggtgccca gcctaacaat aa 22<210>177<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>177tctctgaaga aggaggtcat gt22<210>178<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>178ggagggaggt gcattgggta at22<210>179<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>179aaagcagttg gtggattcaa ag22<210>180<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>180ttattagttg gctgggcatg a 21<210>181<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>181ttctttacac atcagtcaca ag22<210>182<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>182gggtgttgag ttaccagatg a 21<210>183<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>183aaagaaacac atctcagtga aggg24<210>184<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>184caggaggctt gtagtttaga agg 23<210>185<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>185agttagccac tgctggtgtt 20<210>186<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>186ccctccctcc agcacacaaa 20<210>187<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>187ccagagacat ccgttaagga ga 22<210>188<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>188ttgggtctag gagcgtttgc t 21<210>189<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>189tcttgagcat tgtggtggcc tta23<210>190<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>190ttcgggcttc ctggagggaa ca 22<210>191<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>191gcaacatgaa gattctgaag ggt23<210>192<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>192acagcaaact gcatttacca tcg23<210>193<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>193ttggaaagat cgtcctggtg c 21<210>194<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>194aacttctggc cctcggagga a 21<210>195<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>195aacagcaagc atgacatatt ca 22<210>196<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>196gcagagagaa tgtgaggaac ctt 23<210>197<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>197atgcctcaga gggtagcctt g21<210>198<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>198attacagaca tcctaagacc cg 22<210>199<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>199tcatcaaaca tagctcagtc ct 22<210>200<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>200ccaagggaaa gagaaacgct g21<210>201<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>201tttctctgga ggacaagcag ttag 24<210>202<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>202
tttctctgca tctcttctac ctcc24<210>203<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>203acctggagct gttcctgc 18<210>204<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>204gtaacagctc ttcaagctcc t 21<210>205<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>205ggtggttatg gaggatatga c 21<210>206<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>206ccagtaagac actactacat c 21<210>207<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>207atttggagat tcacaggaac agc 23
<210>208<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>208ccactcttag ctggtaaatg aat 23<210>209<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>209aaccatcttg ctttccttaa attc 24<210>210<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>210cccacccttc ttcacccgct tt22<210>211<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>211tacaatacca ggatcctcgc acat 24<210>212<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>212ttggaactgc gagtggctta g 21
<210>213<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>213tattattgtt gcatgacatt tgc 23<210>214<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>214aaagtgcacc cacatggatg tta 23<210>215<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>215gctttattgg gattgcaagc gt 22<210>216<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>216gggctgcctg tctgacctc 19<210>217<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>217gggcggacgc atgatagctg ta 22
<210>218<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>218gtcttgttct ttgacagaag ctc23<210>219<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>219ttcacatagc acacaagtga c 21<210>220<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>220gacctctact tccttggagc tt 22<210>221<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>221cacaagcacg tgcactttat tgaa 24<210>222<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>228tgaagattgt agggcttaga t 21<210>229<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物<400>235atgcacacat gtttaattgt ag 22<210>236<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>238tttcgggaga acccaaccta ag 22<210>239<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物<400>242tgtgcttaag tggcaggat 19<210>243<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>243acaagtttaa gaagaacaaa gctg24<210>244<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>244tatggacatc cagttgttcc agca24<210>245<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>245aggagggaag ggtaacaact cat 23<210>246<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>246agaatgtgga tgacccctcg gaag24<210>247<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>247gtcagtctgc tcactccacc gt 22<210>248<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>248cggatgtgga aacctttcag ga 22<210>249<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>249tatcacaagc atttattgag tacc 24<210>250<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>250tattctagat atttactcct tcg23<210>251<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>251acaaaggatg taccatgtcc aa 22<210>252<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>252cagatcaagg tgatgcacaa g 21<210>253<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物
<400>253catacagcaa agtcaactac tgc23<210>254<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物<400>255tttggagaac ctggatggcc t 21<210>256<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>256atctgcagca cccaggatga a 21<210>257<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物
<400>258caggtatcat tcacagtgta at 22<210>259<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物<400>260gggccaatgg agaaatgcag c21<210>261<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物<400>263
aagctacgag aatgagcagg tg22<210>264<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>264gtcttgttct gtgatgaggg g 21<210>265<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>265gaagatcagt taatgtcact cc22<210>266<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>266tggtagaaga caagatgatt tg22<210>267<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>267tgaatgacaa agacataaca tcc 23<210>268<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>269<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物<400>270gccttggaag tgcctaattg ct 22<210>271<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>271agtcccagac ctcaaggatc t21<210>272<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>擴(kuò)增引物<400>273cagctcagtc acaggagaga 20
<210>274<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>274tacagttcgc atcctcttaa c21<210>275<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>275ctcacaggct tcaacaaggc a21<210>276<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>276gggaggtgcc tttattgccc a21<210>277<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>277tagcatataa ttggaaaggg ttc 23<210>278<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>278aagtgttaca gagccatgga caa 23
<210>279<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>279ctttgacaca ttacagatct ggg 23<210>280<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>280catccttgca ttccttgctt gtt 23<210>281<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>281ttaaccaacg taaccatatt gaataaa 27<210>282<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>282aggatgataa actggtggtg gaat 24<210>283<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>283gcacattaaa cagcatacat acc 23<210>284
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>284ccctgttcct tgtggaaacc tat 23<210>285<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>285ttgcccataa ctcactgtgg cct 23<210>286<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>286aaatctggct ggaacgggac a 21<210>287<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>287tgtctttagg agacgtgaga aag 23<210>288<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>288cttccacgga ttactgacag ag 22<210>289<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>289aacttagcac aattaactgc agc 23<210>290<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>290tgcctgaaat cccactactt gg 22<210>291<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>291catttatctt gatcaaaccc acc 23<210>292<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>292atgctttctg aagagtgagc cc 22<210>293<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>293cgtggtacct aaacatggac ac 22<210>294<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>294tctcattgta ggtctcctaa ag 22<210>295<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>295tttgaagcac taagatcaat ac 22<210>296<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增引物<400>296ttgcgaacgc gtctgtga18
權(quán)利要求
1.鑒定與至少一種癌癥相關(guān)的至少一種甲基化沉默基因的方法，包括a)在適合于核酸扣除產(chǎn)物與陣列上的互補(bǔ)核苷酸序列選擇性雜交的條件下，將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除產(chǎn)物接觸，所述核酸扣除產(chǎn)物包含對(duì)應(yīng)于在用脫甲基試劑接觸過(guò)的癌癥細(xì)胞中表達(dá)的，但不在所述癌癥細(xì)胞的對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子；和b)檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物與所述陣列的一部分核苷酸序列的選擇性雜交，其中對(duì)應(yīng)于在與所述癌癥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子在適合于選擇性雜交的條件下不與所述的那部分核苷酸序列雜交，從而與所述陣列的那部分核苷酸序列選擇性雜交的核酸扣除產(chǎn)物代表了所述癌癥細(xì)胞的甲基化沉默基因，由此鑒定出與至少一種癌癥相關(guān)的至少一種甲基化沉默基因。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的對(duì)應(yīng)于RNA的核酸分子包括cDNA。
3.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的脫甲基試劑包括5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
4.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的至少一種甲基化沉默基因與一種類型的癌癥有關(guān)。
5.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的至少一種甲基化沉默基因與至少兩種類型的癌癥有關(guān)。
6.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的至少一種甲基化沉默基因包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，或其組合。
7.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的至少一種甲基化沉默基因包括HOXA1，GR03，DLX7，或其組合。
8.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的至少一種癌癥是癌或肉瘤。
9.權(quán)利要求6中的方法，其中所述的至少一種癌癥是結(jié)直腸癌，胃癌，或結(jié)直腸癌和胃癌。
10.權(quán)利要求1中的方法，其中所述的至少一種甲基化沉默基因包括SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，或其組合。
11.權(quán)利要求10中的方法，其中所述的至少一種癌癥是結(jié)直腸癌，胃癌或結(jié)直腸癌和胃癌。
12.鑒定與至少一種癌癥相關(guān)的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因的方法，包括a)在適合于核酸扣除產(chǎn)物與陣列上互補(bǔ)的核苷酸序列選擇性雜交的條件下，將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除產(chǎn)物接觸，所述核酸扣除產(chǎn)物包含對(duì)應(yīng)于在用至少一種可以重新激活表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)的試劑接觸過(guò)的癌細(xì)胞中表達(dá)的，但不在所述癌癥細(xì)胞的對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子；和b)檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物與所述陣列的一部分核苷酸序列的選擇性雜交，其中對(duì)應(yīng)于在與所述癌癥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子在適合于選擇性雜交的條件下不與所述的那部分核苷酸序列雜交，從而與所述陣列的那部分核苷酸序列選擇性雜交的核酸扣除產(chǎn)物代表了所述癌癥細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)沉默基因，由此鑒定出與至少一種癌癥相關(guān)的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因。
13.權(quán)利要求12中的方法，其中所述的可重新激活表觀遺傳學(xué)沉默基因的表達(dá)的試劑包括甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或其組合。
14.權(quán)利要求13中的方法，其中所述的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
15.權(quán)利要求13中的方法，其中所述的組蛋白脫乙酰酶抑制劑是曲古抑菌素A。
16.權(quán)利要求12中的方法，其中所述的核酸扣除產(chǎn)物包括與在癌癥細(xì)胞中表達(dá)的RNA對(duì)應(yīng)的核酸分子，所述癌癥細(xì)胞已與5-氮雜-2′-脫氧胞苷，曲古柳菌素A，或其組合接觸過(guò)。
17.權(quán)利要求12中的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因包括在表1中所示的核酸分子，或其組合。
18.權(quán)利要求12中的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因包括甲基化沉默基因。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中所述的至少一種甲基化沉默基因包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，或其組合。
20.權(quán)利要求16中的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因包括POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT，TRIM32，或其組合。
21.權(quán)利要求12中的方法，其中所述的至少一種癌癥是癌或肉瘤。
22.權(quán)利要求12中的方法，其中所述的至少一種癌癥是結(jié)直腸癌，胃癌，或結(jié)直腸癌和胃癌。
23.一種鑒定顯示出生長(zhǎng)不受調(diào)控或具有這種傾向的細(xì)胞的方法，包括在受測(cè)細(xì)胞中檢測(cè)至少一種基因的表觀遺傳學(xué)沉默，所述的至少一種基因包括在表1中所示的核酸分子或其組合，從而確定受測(cè)細(xì)胞為顯示出生長(zhǎng)不受調(diào)控或具有這種傾向的細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23中的方法，其中所述的至少一種基因包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT，TRIM32，或其組合。
25.權(quán)利要求23中的方法，其中所述的顯示出生長(zhǎng)不受調(diào)控或具有這種傾向的細(xì)胞是贅生性細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25中的方法，其中所述的贅生性細(xì)胞是惡化前細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25中的方法，其中所述的贅生性細(xì)胞是癌癥細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27中的方法，其中所述的癌癥細(xì)胞是癌或肉瘤。
29.權(quán)利要求27中的方法，其中所述的癌癥細(xì)胞是結(jié)直腸癌細(xì)胞或胃癌細(xì)胞。
30.權(quán)利要求23中的方法，其中所述的表觀遺傳學(xué)沉默包括甲基化沉默，所述的方法包括檢測(cè)甲基化沉默。
31.權(quán)利要求30中的方法，其中檢測(cè)甲基化沉默包括將包含著含有所述基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，所述的內(nèi)切酶在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)上剪切，從而，所述核酸分子的切割就可以作為指示受測(cè)細(xì)胞中所述基因甲基化沉默的標(biāo)志。
32.權(quán)利要求31中的方法，其中所述的甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶是AccIII，BanI，BstNI，MspI，或XmaI。
33.權(quán)利要求30中的方法，其中檢測(cè)甲基化沉默包括將包含著含有所述基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，所述的內(nèi)切酶在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)處剪切，假如所述CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基被去甲基化的話，這樣，所述核酸分子沒(méi)有發(fā)生剪切便可以作為指示受測(cè)細(xì)胞中所述基因甲基化沉默的標(biāo)志。
34.權(quán)利要求33中的方法，其中所述的甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶是AccII，AvaI，BssHII，BstUI，HpaII，或NotI。
35.權(quán)利要求30中的方法，其中檢測(cè)甲基化沉默包括將含有受測(cè)細(xì)胞的所述基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域與化學(xué)試劑接觸，所述化學(xué)試劑會(huì)選擇性地修飾未甲基化的或者甲基化的胞嘧啶殘基，并檢測(cè)由于所述接觸而產(chǎn)生的產(chǎn)物，其中所述產(chǎn)物可作為指示所述基因上CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基甲基化的標(biāo)志，由此檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中所述基因的甲基化沉默。
36.權(quán)利要求35中的方法，其中所述的產(chǎn)物的檢測(cè)包括電泳法，色譜法，質(zhì)譜法，或其組合。
37.權(quán)利要求35中的方法，其中所述化學(xué)試劑是肼，由此可以產(chǎn)生經(jīng)肼處理的基因5′端調(diào)控區(qū)域，所述方法進(jìn)一步包括將被肼處理的5′端調(diào)控區(qū)域與能夠剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑接觸，獲得包含著含有所述基因的核酸分子的片斷的產(chǎn)物；按照分子量大小分離所述片斷；檢測(cè)在所述基因的5′端調(diào)控區(qū)域中已知含有胞嘧啶殘基的位置處的缺口，其中所述缺口可以作為指示所述基因中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化的標(biāo)志，由此檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中所述基因的甲基化沉默。
38.權(quán)利要求37中的方法，其中所述的可剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑是哌啶。
39.權(quán)利要求35中的方法，其中所述化學(xué)試劑包括亞硫酸氫根離子，由此在所述基因5’調(diào)控區(qū)中未甲基化的胞嘧啶殘基可被轉(zhuǎn)變?yōu)閬喠蛩釟潲}修飾的胞嘧啶殘基，所述方法進(jìn)一步包括將亞硫酸氫根離子處理的基因暴露于堿性條件中，從而亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏埢蜋z測(cè)在受測(cè)細(xì)胞的亞硫酸氫根離子處理的基因的5’調(diào)控區(qū)中尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布，其中與暴露于堿性條件后相應(yīng)的亞硫酸氫根離子處理的未甲基化基因中尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布相比，受測(cè)細(xì)胞的基因5’調(diào)控區(qū)中尿嘧啶殘基數(shù)量或分布的減少可以作為指示所述基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基甲基化的標(biāo)志，由此檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞所述基因的甲基化沉默。
40.權(quán)利要求39中的方法，其中檢測(cè)尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布包括測(cè)定在暴露于堿性條件后亞硫酸氫鹽修飾的基因5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列。
41.權(quán)利要求39中的方法，其中檢測(cè)尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布包括將暴露于堿性條件后的亞硫酸氫根離子處理的基因序列與寡聚核苷酸接觸，所述的寡聚核苷酸可選擇性地與含有尿嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)雜交，和檢測(cè)所述寡聚核苷酸的選擇性雜交。
42.權(quán)利要求41中的方法，其中所述的寡聚核苷酸具有在SEQ IDNO23，24，111，112，115，116，119，120，125，126，129，130，133，134，139，140，143或144中所示的核苷酸序列。
43.權(quán)利要求41中的方法，其中所述的寡聚核苷酸包括可被檢測(cè)的標(biāo)記，其中檢測(cè)選擇性雜交包括檢測(cè)所述的標(biāo)記。
44.權(quán)利要求43中的方法，其中所述的可被檢測(cè)的標(biāo)記是放射性同位素，順磁性同位素，發(fā)光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物，熒光化合物，金屬螯合物，酶，酶底物，受體，或受體的配體。
45.權(quán)利要求41中的方法，其中所述的寡聚核苷酸是引物延伸反應(yīng)的底物，其中檢測(cè)選擇性雜交包括檢測(cè)所述引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物。
46.權(quán)利要求45中的方法，其中所述的寡聚核苷酸具有在SEQ IDNO23，24，111，112，115，116，119，120，125，126，129，130，133，134，139，140，143或144中所示的核苷酸序列。
47.權(quán)利要求39中的方法，其中檢測(cè)尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布包括將所述基因的5’調(diào)控區(qū)與含有正向和反向引物的擴(kuò)增引物對(duì)在適合擴(kuò)增的條件下接觸，其中所述引物對(duì)的至少一條引物包括可選擇性地與含尿嘧啶殘基的5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列雜交的寡聚核苷酸，因而擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生可以作為指示在所述基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基甲基化的標(biāo)志，由此檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中所述基因的甲基化沉默。
48.權(quán)利要求47中的方法，其中所述的擴(kuò)增引物對(duì)包括在SEQ IDNO23和24，SEQ ID NOS111和112，SEQ ID NOS115和116，SEQ IDNOS119和120，SEQ ID NOS125和126，SEQ ID NOS129和130，SEQID NOS133和134，SEQ ID NOS139和140，或SEQ ID NOS143和144中所示的引物對(duì)。
49.權(quán)利要求39中的方法，其中檢測(cè)尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布包括將所述基因的5’調(diào)控區(qū)與含有正向和反向引物的擴(kuò)增引物對(duì)在適合擴(kuò)增的條件下接觸，其中所述引物對(duì)的兩條引物可選擇性地與含有胞嘧啶殘基的5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列雜交，但不與含尿嘧啶殘基的5’調(diào)控區(qū)的對(duì)應(yīng)核苷酸序列雜交，和因而擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生可作為指示在所述基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中缺少胞嘧啶殘基甲基化的標(biāo)志，由此檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中所述基因的甲基化沉默。
50.權(quán)利要求49中的方法，其中所述的擴(kuò)增引物對(duì)包括在SEQ IDNOS25和26，SEQ ID NOS113和114，SEQ ID NOS117和118，SEQ IDNOS121和122，SEQ ID NOS127和128，SEQ ID NOS131和132，SEQID NOS135和136，SEQ ID NOS141和142或SEQ ID NOS145和146中所示的引物對(duì)。
51.權(quán)利要求39中的方法，其中檢測(cè)尿嘧啶殘基的數(shù)量或分布包括將所述基因的5’調(diào)控區(qū)與第一擴(kuò)增引物對(duì)和第二擴(kuò)增引物對(duì)在適合擴(kuò)增的條件下接觸，其中所述第一擴(kuò)增引物對(duì)含有一條正向引物和一條反向引物，其中所述第一引物對(duì)的至少一條引物包括可與含尿嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，其中所述第二擴(kuò)增引物對(duì)含有一條正向引物和一條反向引物，其中所述第二引物對(duì)的兩條引物可與含胞嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)的核苷酸序列選擇性雜交，但不與含尿嘧啶殘基的基因5’調(diào)控區(qū)的對(duì)應(yīng)核苷酸序列雜交，和其中如果由所述第一引物對(duì)可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的話，其具有第一長(zhǎng)度，其中如果由所述第二引物對(duì)可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的話，其具有與第一長(zhǎng)度不同的第二長(zhǎng)度，因而所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度可作為指示尿嘧啶殘基的標(biāo)志，并因此可作為指示所述基因5’調(diào)控區(qū)中CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基甲基化的標(biāo)志，由此檢測(cè)受測(cè)細(xì)胞中所述基因的甲基化沉默。
52.權(quán)利要求30中的方法，其中檢測(cè)甲基化沉默包括a)將受測(cè)細(xì)胞與脫甲基試劑接觸，和b)檢測(cè)與不接觸脫甲基試劑的受測(cè)細(xì)胞中RNA的表達(dá)水平相比，由所述基因編碼的RNA的表達(dá)增加。
53.權(quán)利要求52中的方法，其中所述的脫甲基試劑包括甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
54.權(quán)利要求53中的方法，其中所述的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
55.權(quán)利要求23中的方法，該方法可以高通量的形式實(shí)施，其中所述的受測(cè)細(xì)胞或受測(cè)細(xì)胞的提取物包括多份受測(cè)細(xì)胞或其提取物中的一份，或其組合。
56.權(quán)利要求55中的方法，其中所述的多份受測(cè)細(xì)胞或其提取物中的各份是相同的或不同的，或其組合。
57.權(quán)利要求55中的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)在相應(yīng)的表現(xiàn)出受控的生長(zhǎng)的細(xì)胞，或相應(yīng)細(xì)胞的提取物中所述基因5’調(diào)控區(qū)的CpG島中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化，如果存在的話。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述受測(cè)細(xì)胞或受測(cè)細(xì)胞的提取物在陣列中進(jìn)行排列。
59.權(quán)利要求58中的方法，其中所述的陣列是可尋址的陣列。
60.權(quán)利要求55中的方法，其中所述受測(cè)細(xì)胞或受測(cè)細(xì)胞的提取物位于微芯片，玻璃板或小珠上。
61.權(quán)利要求23中的方法，其中所述受測(cè)細(xì)胞包括從受試者中獲得的樣本。
62.權(quán)利要求61中的方法，其中所述的受試者是人類受試者。
63.權(quán)利要求61中的方法，其中所述的樣本包括器官樣本，組織樣本或細(xì)胞樣本。
64.權(quán)利要求63中的方法，其中所述的樣本包括胃腸道樣本，肝樣本，皮膚樣本，淋巴結(jié)樣本，腎樣本，肺樣本，肌肉樣本，骨樣本，或腦樣本。
65.權(quán)利要求64中的方法，其中所述的胃腸道樣本包括胃樣本，小腸樣本，結(jié)腸樣本，或直腸樣本。
66.權(quán)利要求61中的方法，其中所述的樣本包括生物流體。
67.權(quán)利要求66中的方法，其中所述的生物流體包括骨髓，血清，淋巴，腦脊液，唾液，痰液，糞便，尿液或精液。
68.一種減緩或抑制細(xì)胞的無(wú)調(diào)控生長(zhǎng)的方法，所述細(xì)胞中至少一種與癌癥有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出表觀遺傳學(xué)上的沉默，所述方法包括恢復(fù)由所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因編碼的多肽在所述細(xì)胞中的表達(dá)，由此減緩或抑制所述細(xì)胞的無(wú)調(diào)控生長(zhǎng)。
69.權(quán)利要求68中的方法，其中恢復(fù)多肽的表達(dá)包括將細(xì)胞與一種脫甲基試劑，一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或其組合接觸。
70.權(quán)利要求69中的方法，其中所述的脫甲基試劑包括甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
71.權(quán)利要求68中的方法，其中所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因包括甲基化沉默基因，所述的方法包括將細(xì)胞與至少一種脫甲基試劑接觸。
72.權(quán)利要求71中的方法，其中所述的細(xì)胞與脫甲基試劑的接觸是在培養(yǎng)中進(jìn)行。
73.權(quán)利要求71中的方法，其中所述的細(xì)胞與脫甲基試劑的接觸包括將所述試劑施予含有所述細(xì)胞的受試者。
74.權(quán)利要求71中的方法，其中所述的脫甲基試劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
75.權(quán)利要求68中的方法，其中恢復(fù)多肽的表達(dá)包括將編碼所述多肽的多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)所述細(xì)胞中，而所述多肽由所述多聚核苷酸表達(dá)出來(lái)。
76.權(quán)利要求75中的方法，其中所述的多聚核苷酸包含在載體中。
77.權(quán)利要求76中的方法，其中所述的載體是病毒載體。
78.權(quán)利要求75中的方法，其中將多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞包括將所述細(xì)胞與所述多聚核苷酸離體接觸。
79.權(quán)利要求75中的方法，其中將多聚核苷酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞包括將所述細(xì)胞與所述多聚核苷酸在體內(nèi)接觸。
80.權(quán)利要求75中的方法，其中所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因包括在表1中所示的核酸分子。
81.權(quán)利要求68中的方法，其中所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，或其組合。
82.權(quán)利要求68中的方法，其中所述的表觀遺傳學(xué)沉默基因包括POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT，TRIM32，或其組合。
83.一種治療癌癥患者的方法，其中所述患者中的癌癥細(xì)胞顯示至少一種基因的表達(dá)在表觀遺傳學(xué)上被沉默化，所述方法包括恢復(fù)所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因在患者的癌癥細(xì)胞中的表達(dá)，由此治療癌癥患者。
84.權(quán)利要求83中的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因包括甲基化沉默基因。
85.權(quán)利要求84中的方法，包括將脫甲基試劑施予受試者，其量足以恢復(fù)所述的甲基化沉默基因在受試者癌癥細(xì)胞中的表達(dá)。
86.權(quán)利要求83中的方法，包括對(duì)受試者施用至少一種多聚核苷酸，所述多聚核苷酸編碼由所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因編碼的至少一種多肽，并且施用量足以使所述的至少一種多肽在患者的癌癥細(xì)胞中表達(dá)。
87.權(quán)利要求86中的方法，其中所述的多聚核苷酸包含在載體中。
88.權(quán)利要求87中的方法，其中所述的載體是病毒載體。
89.權(quán)利要求86中的方法，其中所述的多聚核苷酸包括基質(zhì)。
90.權(quán)利要求89中的方法，其中所述的基質(zhì)是脂質(zhì)體。
91.權(quán)利要求83中的方法，其中所述的癌癥是癌或肉瘤。
92.權(quán)利要求83中的方法，其中所述的癌癥是結(jié)直腸癌，胃癌，或結(jié)直腸癌和胃癌。
93.權(quán)利要求92中的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，POR1，MBNL，TRADD，PDIP，RAD23B，RPL13，GNAI2，PPP1R21A，F(xiàn)PGT，TRIM32，其家族成員，或其組合。
94.權(quán)利要求92中的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學(xué)沉默基因包括SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5或其組合。
95.一種為治療癌癥患者而選擇治療策略的方法，包括a)鑒定與所述癌癥相關(guān)的至少一種甲基化沉默基因，該方法的實(shí)施是通過(guò)在適合于核酸扣除產(chǎn)物與陣列上的互補(bǔ)核苷酸序列選擇性雜交的條件下，將代表基因組的核苷酸序列陣列與核酸扣除產(chǎn)物接觸，所述核酸扣除產(chǎn)物包含對(duì)應(yīng)于在用至少一種可以重新激活甲基化沉默基因的表達(dá)的試劑接觸過(guò)的患者癌癥細(xì)胞中表達(dá)的，但不在所述癌癥細(xì)胞的對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子；和檢測(cè)核酸扣除產(chǎn)物與所述陣列的一部分核苷酸序列的選擇性雜交，其中對(duì)應(yīng)于在與所述患者癌癥細(xì)胞對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞中表達(dá)的RNA的核酸分子在適合于選擇性雜交的條件下不與所述的那部分核苷酸序列雜交，從而與所述陣列的那部分核苷酸序列選擇性雜交的核酸扣除產(chǎn)物代表了所述患者癌癥細(xì)胞中甲基化沉默的基因；以及b)選擇用于恢復(fù)所述的至少一種甲基化沉默基因在患者癌癥細(xì)胞中的表達(dá)的試劑，由此為治療癌癥患者選擇治療策略。
96.權(quán)利要求95中的方法，其中所述的試劑包括編碼所述的至少一種甲基化沉默基因的多聚核苷酸。
97.權(quán)利要求96中的方法，其中所述的多聚核苷酸包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，其家族成員，或其組合。
98.權(quán)利要求97中的方法，其中所述的試劑包括含有SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5或其組合的多聚核苷酸。
99.權(quán)利要求95中的方法，其中所述的試劑包括脫甲基試劑。
100.權(quán)利要求99中的方法，其中所述的脫甲基試劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
101.一種治療患有結(jié)直腸癌，胃癌或同時(shí)患有結(jié)直腸癌和胃癌的受試者的方法，其中與結(jié)直腸癌或胃癌相關(guān)的細(xì)胞含有至少一種甲基化沉默基因，所述方法包括將一定量的可恢復(fù)所述的至少一種甲基化沉默基因的表達(dá)的試劑施予受試者，所述量足以恢復(fù)與結(jié)直腸癌，胃癌或結(jié)直腸癌和胃癌相關(guān)的細(xì)胞中甲基化沉默基因的表達(dá)。
102.權(quán)利要求101中的方法，其中所述的試劑包括編碼所述的至少一種甲基化沉默基因的多聚核苷酸。
103.權(quán)利要求102中的方法，其中所述的多聚核苷酸包括PTGS2，CDKN2A，TIMP3，S100A10，SFRP1，CXX1，SEZZ6L，KIAA0786，TIMP2，PCDH8，F(xiàn)OLH1，SNRPN，HOXA1，GRO3，DLX7，其家族成員，或其組合。
104.權(quán)利要求103中的方法，其中所述的多聚核苷酸包括SFRP1，SFRP2，SFRP4，SFRP5或其組合。
105.權(quán)利要求102中的方法，其中所述的多聚核苷酸包含在載體中。
106.權(quán)利要求105中的方法，其中所述的載體是病毒載體。
107.權(quán)利要求102中的方法，其中所述的多聚核苷酸包括基質(zhì)。
108.權(quán)利要求107中的方法，其中所述的基質(zhì)是脂質(zhì)體。
109.權(quán)利要求101中的方法，其中所述的試劑包括脫甲基試劑。
110.權(quán)利要求105中的方法，其中所述的脫甲基試劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
111.權(quán)利要求101中的方法，其中施用所述試劑包括將結(jié)直腸癌，胃癌，結(jié)直腸癌和胃癌的細(xì)胞與所述試劑離體接觸，所述的方法進(jìn)一步包括將離體接觸的細(xì)胞注入患者體內(nèi)。
112.權(quán)利要求101中的方法，其中施用所述試劑包括將所述試劑施于患者的結(jié)直腸癌，胃癌，結(jié)直腸癌和胃癌細(xì)胞所在的部位。
113.一種分離的寡聚核苷酸，包括SEQ ID NOS1至296中的任何一個(gè)。
114.多種分離的寡聚核苷酸，包括權(quán)利要求113中所述的分離的寡聚核苷酸中的至少兩種。
115.一對(duì)擴(kuò)增引物，包括在SEQ ID NOS1至296中所示的一條正向引物和一條反向引物，其中所述的擴(kuò)增引物對(duì)可擴(kuò)增表1中的核酸分子的部分序列。
116.權(quán)利要求115中的擴(kuò)增引物對(duì)，其可特異地?cái)U(kuò)增所述核酸分子的甲基化的5’調(diào)控區(qū)域。
117.權(quán)利要求116中的擴(kuò)增引物對(duì)，包括SEQ ID NOS23和24，SEQ ID NOS111和112，SEQ ID NOS115和116，SEQ ID NOS119和120，SEQ ID NOS125和126，SEQ ID NOS129和130，SEQ ID NOS133和134，SEQ ID NOS139和140或SEQ ID NOS143和144。
118.權(quán)利要求115中的擴(kuò)增引物對(duì)，其可特異地?cái)U(kuò)增所述核酸分子的未甲基化的5’調(diào)控區(qū)域。
119.權(quán)利要求118中的擴(kuò)增引物對(duì)，包括SEQ ID NOS25和26，SEQ ID NOS113和114，SEQ ID NOS117和118，SEQ ID NOS121和122，SEQ ID NOS127和128，SEQ ID NOS131和132，SEQ IDNOS135和136，SEQ ID NOS141和142或SEQ ID NOS145和146。
120.試劑盒，其含有權(quán)利要求113中的至少一種分離的寡聚核苷酸。
121.權(quán)利要求120中的試劑盒，其含有多種分離的寡聚核苷酸。
122.權(quán)利要求121中的試劑盒，其中所述的多種包括至少一個(gè)含有一正向引物和一反向引物的擴(kuò)增引物對(duì)。
123.權(quán)利要求122中的試劑盒，其含有多個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)。
124.權(quán)利要求122中的試劑盒，其中所述的擴(kuò)增引物對(duì)包括一個(gè)甲基化特異擴(kuò)增引物對(duì)，一個(gè)未甲基化特異擴(kuò)增引物對(duì)，或含有至少一個(gè)甲基化特異擴(kuò)增引物對(duì)和至少一個(gè)未甲基化特異擴(kuò)增引物對(duì)的組合。
125.權(quán)利要求120中的試劑盒，進(jìn)一步包含可修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑。
126.權(quán)利要求120中的試劑盒，進(jìn)一步包含甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶。
127.權(quán)利要求120中的試劑盒，進(jìn)一步包含用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。
全文摘要
提供了一種鑒定癌癥細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)沉默基因例如甲基化沉默基因的方法。另外，提供了通過(guò)檢測(cè)基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)沉默來(lái)鑒定癌癥的方法，還提供了治療患有這樣的癌癥的患者的方法，所述的癌癥例如結(jié)直腸癌和/或胃癌。還提供了用于實(shí)施這些方法的試劑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1650033SQ03810154
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2003年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月7日
發(fā)明者S·B·貝林, D·西德蘭斯基, J·G·赫爾曼, H·鈴木 申請(qǐng)人:約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院