本發(fā)明涉及一種腫瘤的標志物，特別涉及一種可作為結(jié)直腸癌靶向治療的新型生物標志物。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是世界第三大常發(fā)性腫瘤，也是中國和美國的第三大新發(fā)病例和致死性腫瘤。全球每年新發(fā)大腸癌病人高達93萬，在我國每年新發(fā)病例高達13-16萬人，其發(fā)病率正以4.2％的速度遞增，但是大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，失去了最佳的治療時機，導致大腸癌患者確診后5年生存率很低，在我國每5分鐘就有1人死于大腸癌。

目前針對結(jié)直腸癌病人的化療最常用的藥物包括氟尿嘧啶類化合物5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑，這些藥物雖然顯著延長了患者的壽命，但是耐藥性的產(chǎn)生以及其無法從根本上治愈結(jié)直腸癌一直是困擾我們的難題。腫瘤干細胞(CSC)或者稱為腫瘤起始細胞(TIC)是一群具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞,雖然在腫瘤細胞總數(shù)中只占很小比例,但與腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療失敗等密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中已經(jīng)鑒定了集中重要的標志物例如CD133,LGR5,CD44和EPHB2。細胞增殖與腫瘤增長緊密相關(guān)，例如KI67和PCNA標志的增殖細胞群。核膜結(jié)構(gòu)短板LAMINA只表達在已經(jīng)分化的細胞，不表達在成體干細胞中。缺少LAMINA可以指示干細胞和多能性狀態(tài)。

另外人體腫瘤細胞為了不受限制地不斷生長，必須要克服的一個障礙就是伴隨著細胞分裂進行而不斷縮短(丟失)的端粒DNA問題。所以大約有85～90％的腫瘤細胞都會用到端粒酶(Telomerase)。由于在絕大部分人體正常細胞里都不會表達端粒酶，所以科學家們認為端粒酶抑制療法會是一個不錯的抗癌手段，而且還會是一種廣譜的抗癌方法。但是在另外的10～15％人體腫瘤細胞中是檢測不到端粒酶活性的，但是這些腫瘤細胞會采用另外一種端粒替代延長機制(ALT)來保證端粒的長度，端粒延長替代機制(Alterative lengthening of telomere,ALT)的特點包括:具有不均一的端粒長度,存在與ALT相關(guān)的PML小體(APBs)以及同源重組增加。ALT細胞內(nèi)存在的ALT相關(guān)蛋白及異?；钴S的同源重組為ALT機制的激活和維持提供了可能，端粒酶抑制療法對這部分腫瘤細胞是無效的。因此尋找更為特異性針對不同疾病發(fā)生發(fā)展需要的生物標志物并將其作為診斷及治療的靶點，開的相對應(yīng)的靶向藥物對提高包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的腫瘤治療效果有著重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服無法針對端粒酶陰性腫瘤干細胞提供靶向治療存在的問題和技術(shù)不足，提供一種用于結(jié)直腸癌的靶向性生物標志物的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個主要目的是根據(jù)這些靶點設(shè)計預測、診斷腫瘤耐藥試劑盒、篩選正對該特異性通路關(guān)鍵蛋白例如PML及其相關(guān)分子的治療腫瘤耐藥的藥物，下調(diào)或者抑制ALT的作用，達到有效治療不含端粒酶的耐藥腫瘤。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

端粒延長替代機制(ALT)作為結(jié)直腸癌干細胞標志物的應(yīng)用，其特征是：以端粒延長替代機制(ALT)作為結(jié)直腸癌生物標志物及治療靶點。

進一步的，該標志物的應(yīng)用是利用結(jié)直腸病人腫瘤組織中，端粒長度相對短的腫瘤具有高的ALT特性，使用小分子藥物靶向抑制ALT。

進一步的，靶向抑制ALT使得結(jié)直腸腫瘤干細胞的端粒變短。

所述的ALT途徑為染色體外的端粒重復環(huán)(T-CIRCLES)。

所述的ALT途徑為PML小體位于端粒位置(APBs)。

進一步的，靶向ALT之后，降低腫瘤干細胞APB表達，使細胞端粒長度縮短。

進一步的，通過靶向ALT可以降低腫瘤干細胞的增殖能力和致癌性。

進一步的，通過采用特異性抑制劑抑制ALT，消除腫瘤干細胞的增殖能力和致癌性。

進一步的，采用ATR抑制劑VE-821來處理結(jié)腸癌細胞系HCT116以抑制ALT。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：

研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸病人腫瘤組織中，端粒長度相對短的腫瘤具有高的ALT特性，而在癌旁和遠癌正常組織中ALT非常少，并且ALT與增殖的腫瘤干細胞緊密相關(guān)。使用小分子藥物靶向抑制ALT可以顯著抑制腫瘤干細胞的增殖、成球以及小鼠體內(nèi)成瘤能力?？筛鶕?jù)此靶點開發(fā)新的治療結(jié)直腸癌的藥物以及能夠早期診斷與檢測結(jié)直腸癌的試劑。利用此靶點可很好的靶向短端粒的結(jié)直腸癌，有助于提高藥物療效同時減輕毒副作用，從而提高結(jié)直腸癌的治療效果。

附圖說明

圖1.結(jié)直腸癌病人腫瘤組織、癌旁組織、遠癌組織和血液的端粒長度。其中(A)展示通過qPCR計算T/S ratio的相對端粒長度散點圖，總共展示45個病人的數(shù)據(jù)，按照腫瘤部位的端粒長度進行排序。(B)箱型圖展示相對端粒長度的分布情況。(C)Southern blot雜交TRF方法對部分腫瘤的端粒長度進行檢測，HEF指人胚胎成纖維細胞。(D)皮爾森相關(guān)性顯示TRF和T/S ratio存在高的相關(guān)性。(E)使用QFISH檢測同一個病人的腫瘤部位和遠癌部位的端粒長度。(F)對QFISH結(jié)果進行定量分析。(G)對應(yīng)腫瘤的T/S ratio結(jié)果。

圖2.短端粒的腫瘤具有跟高的PML表達水平和APBs頻率。其中(A)免疫熒光分析PML在腫瘤中的表達情況。(B)每個細胞中PML的平均數(shù)。(C)不同組織中PML陽性細胞的比例。(D)對PML的熒光信號進行定量分析。(E)使用IHC檢測PML的特異性。(F)使用2D凝膠電泳檢測T-circle，HeLa作為陰性對照，U2OS作為陽性對照。(G，H)使用免疫熒光在HeLa和U2OS以及腫瘤和遠癌組織中對APB進行分析。(I)APB陽性細胞的比例。(J)每個細胞中APB的個數(shù)。

圖3.短端粒病人腫瘤中的腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞顯示出端粒長度的差異。其中(A，B，C)流式分選腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞和T/S ratio檢測相對端粒長度。(D)LGR5免疫熒光和端粒FISH對LGR5陽性和陰性細胞的端粒長度進行檢測。右邊為定量結(jié)果。

圖4.靶向抑制ALT使得腫瘤干細胞的端粒變短和成瘤能力降低。其中(A)Western blot檢測不同濃度VE-821對PML的抑制效果。(B)使用3.2μM的VE-821處理結(jié)直腸癌細胞系HCT11672小時后對APB的影響，U2OS作為對照。(C，D)用VE-821處理后對HCT116和U2OS的APB點數(shù)目的影響統(tǒng)計圖。(E)用VE-821處理后對HCT116和U2OS的端粒長度影響。(F)使用CD44和CD133抗體流式分選腫瘤類干細胞。(G)分選不同細胞群后使用VE-821處理后端粒長度變化。(H)TRF驗證端粒長度變化。(I)注射加3.2μM的VE-821處理的CD44+CD133+類干細胞和不加藥的CD44+CD133+類干細胞到裸鼠后5周成瘤情況。(J)裸鼠成瘤數(shù)目統(tǒng)計。(K)裸鼠成瘤重量統(tǒng)計。

具體實施方式

下面通過實施例和附圖對本發(fā)明做詳細說明。

實驗發(fā)現(xiàn)和結(jié)果：

結(jié)腸癌臨床樣本端粒長度檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤呈現(xiàn)異質(zhì)性短端粒

我們用qPCR方法檢測了54例臨床樣本的腫瘤、癌旁和遠癌組織，以及20 例樣本的血液端粒長度。腫瘤端粒長度存在異質(zhì)性，且跨越較大區(qū)間。87％的腫瘤樣本的端粒長度短于癌旁和遠癌組織，其余小部分腫瘤端粒長度顯示出稍長或接近對照組織。癌旁和遠癌之間的端粒長度相似，差異不大。成對樣本T檢驗分析顯示腫瘤端粒長度顯著低于癌旁和遠癌組織。

此外，我們還采用TRF(端粒末端限制性片段測量)和QFISH(熒光定量原位雜交)檢測端粒長度，得到了與T/S ratio一致的結(jié)果，證明了實驗結(jié)果的準確性。圖1給出了結(jié)直腸癌病人腫瘤組織、癌旁組織、遠癌組織和血液的端粒長度。其中：(A)展示通過qPCR計算T/S ratio的相對端粒長度散點圖，總共展示45個病人的數(shù)據(jù)，按照腫瘤部位的端粒長度進行排序。(B)箱型圖展示相對端粒長度的分布情況。(C)Southern blot雜交TRF方法對部分腫瘤的端粒長度進行檢測，HEF指人胚胎成纖維細胞。(D)皮爾森相關(guān)性顯示TRF和T/S ratio存在高的相關(guān)性。(E)使用QFISH檢測同一個病人的腫瘤部位和遠癌部位的端粒長度。(F)對QFISH結(jié)果進行定量分析。(G)對應(yīng)腫瘤的T/S ratio結(jié)果。

短端粒與腫瘤惡性程度相關(guān)

為了進一步探索端粒長度與臨床病理特征之間的關(guān)系，我們根據(jù)腫瘤的端粒長度由短到長將54例病人分成短、中、長三組，每組18個病人樣本。端粒長度通過ANOVA分析，在組內(nèi)和組間進行比較。組內(nèi)比較顯示，在短端粒組和中端粒組的腫瘤端粒長度和癌旁遠癌之間存在顯著差異，在長端粒組內(nèi)的三類組織間端粒長度無差異。在三組之間比較，只有腫瘤端粒長度存在顯著差異，三組間癌旁與遠癌組織無差異。

根據(jù)上述分類，我們進行了端粒長度和臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析。分析顯示腫瘤組織分化程度與端粒長度存在顯著關(guān)聯(lián)。大部分中低分化的腫瘤端粒短，而高分化的腫瘤端粒相對較長。我們進一步將相對正常組織的平均端粒長度作為參考，并根據(jù)腫瘤組織的端粒長度短于平均值或長于平均值分別定義為短端粒組和長端粒組。發(fā)現(xiàn)在端粒長度和腫瘤體積之間存在存在負相關(guān)，證實了短端粒腫瘤體積相對大的觀察。

綜上，這些結(jié)果顯示了短端粒腫瘤和低分化與增大的腫瘤體積有關(guān)。

端粒酶基因與TRF1表達在段端粒維持的作用

接下，我們通過綜合實驗深入分析結(jié)直腸癌中的端粒維持與異質(zhì)性。

免疫組化分析和正常遠癌組織相比，在腫瘤有限的小群細胞中檢測到了hTERT顯著的異質(zhì)性的表達。在短中長三組腫瘤組織顯示了多樣的變化，而遠癌組織的正常腸上皮細胞染色強度和陽性細胞數(shù)量則相對較低。

在mRNA水平上，短端粒組腫瘤TERT水平稍高，但并不顯著。由于有研究表明TERT promoter突變會使端粒酶沉默失效重新激活TERT，我們也檢測了啟動子突變TERT的表達水平，結(jié)果顯示正常的TERT,TERC,以及啟動子突變的TERT1/2均與端粒長度無明顯相關(guān)，可見端粒酶表達水平對結(jié)直腸癌中端粒長度異質(zhì)性和維持無顯著作用。

端粒相關(guān)因子TRF1在腫瘤中的表達同樣存在異質(zhì)性。免疫組化分析TRF1陽性在短端粒腫瘤中高于正常組織，在長端粒腫瘤中與正常接近。然而，TRF1mRNA水平在長短組腫瘤之間，以及腫瘤和正常組織之間無顯著差異，因此，僅僅以TRF1的表達水平同樣無法解釋結(jié)直腸癌中端粒長度的異質(zhì)性。

端粒延伸的替代機制和端粒延長相關(guān)

端?？梢酝ㄟ^不依賴于端粒酶的同源重組機制延伸，即延伸替代機制(ALT)，此機制可以前髓細胞白血病小體(PML)。因此我們通過免疫組化/免疫熒光檢測了PML在臨床樣本中的表達水平。結(jié)果顯示，PML表達不僅在腫瘤中遠高于正常組織(腺窩頂部和底部細胞)；在短端粒腫瘤組織中的表達，包括PML foci的頻率，PML陽性細胞的比例，熒光強度均高于短端粒腫瘤。ALT途徑的另一個特征為染色體外的端粒重復環(huán)(T-CIRCLES)，我們用T-CIRCLES實驗確認腫瘤中存在于ALT陽性細胞類似的T-CIRCLES。

ALT的另一個鮮明特征是PML小體位于端粒位置(APBs)發(fā)揮作用，我們的結(jié)果也顯示短端粒腫瘤的APBs顯著高于長端粒腫瘤。附圖2給出了短端粒的腫瘤具有跟高的PML表達水平和APBs頻率，其中(A)免疫熒光分析PML在腫瘤中的表達情況。(B)每個細胞中PML的平均數(shù)。(C)不同組織中PML陽性細胞的比例。(D)對PML的熒光信號進行定量分析。(E)使用IHC檢測PML的特異性。(F)使用2D凝膠電泳檢測T-circle，HeLa作為陰性對照，U2OS作為陽性對照。(G，H)使用免疫熒光在HeLa和U2OS以及腫瘤和遠癌組織中對APB進行分析。(I)APB陽性細胞的比例。(J)每個細胞中APB的個數(shù)。

接下來我們采用DNA損傷修復因子53BP1進一步分析是否ALT腫瘤存在DNA損傷修復。與上述結(jié)果一致的是，在短端粒腫瘤中，PML陽性細胞數(shù)量和foci數(shù)量均顯著高于遠癌組織和長端粒腫瘤。53BP1foci陽性細胞和平均每個細胞53BP1的量均高于正常組織。這些數(shù)據(jù)顯示，DNA損傷修復聯(lián)合ALT可能促成了結(jié)直腸癌中的端粒修復和長度維持。

結(jié)直腸癌腫瘤中存在腫瘤干細胞的獨特亞群

為了進一步理解端粒長度異質(zhì)性與PML的表達差異，我們采用了一系列的結(jié)直腸癌干細胞獨特的標志分析是否腫瘤干細胞和細胞增殖的存在對上述差異存在促進作用。

結(jié)果顯示，短端粒腫瘤CD44熒光強度和陽性細胞量，遠高于遠癌組織，且短端粒腫瘤和遠癌組織中的CD44水平均顯著高于長端粒組相應(yīng)組織，CD44與增殖細胞標志KI67共定位細胞明顯存在于短端粒組。且，腫瘤干細胞另一標志EPHB2，以及CD44和EPHB2雙陽性細胞在短端粒腫瘤中表達均高于長端粒腫瘤和正常組織。LGR5細胞的標記同樣在腫瘤中顯著高于正常組織。附圖3給出了短端粒病人腫瘤中的腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞顯示出端粒長度的差異。圖中：(A，B，C)流式分選腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞和T/S ratio檢測相對端粒長度。(D)LGR5免疫熒光和端粒FISH對LGR5陽性和陰性細胞的端粒長度進行檢測。右邊為定量結(jié)果。

綜上，短端粒的結(jié)直腸腫瘤富集了腫瘤干細胞，特別是增殖的腫瘤干細胞。腫瘤干細胞的比例和表達水平在腫瘤實體內(nèi)和不同腫瘤間的差異同樣證實了腫瘤干細胞的異質(zhì)性。

短端粒腫瘤預示著高度增殖的腫瘤干細胞

我們共染腫瘤干細胞標志CD44和增殖標志Ki67，發(fā)現(xiàn)在短端粒的腫瘤干細胞具有持續(xù)增殖能力。我們進一步共染增殖標志PCNA和分化標志LAMINA以分析腫瘤增殖與分化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常腺窩部位，PCNA在腺窩底部表達，LAMINA在腺窩底部和上部均有表達。我們推測在正常腺窩底部，高表達PCNA同時不表達或低表達LAMINA的細胞可能是干細胞。相反，高表達LAMINA同時不表達或低表達PCNA的細胞可能是不增殖的分化細胞。

通過免疫熒光檢測我們發(fā)現(xiàn)，短端粒病人腫瘤比長端粒病人腫瘤中有著更多的PCNA高表達同時LAMINA低表達的細胞。PCNA在短端粒病人腫瘤部位和正常部位的表達均高于正常部位；相反LAMIAN在短端粒病人腫瘤部位的表達明顯低于對應(yīng)病人的正常部位和長端粒病人的腫瘤部位，同時其在短端粒病人正常部位的表達也低于長端粒病人正常部位。而且，短端粒病人腫瘤部位有比長端粒病人腫瘤部位更多的PNCA陽性細胞，而LAMINA陽性細胞呈相反趨勢。PCNA陽性同時LAMINA陰性的細胞在短端粒病人腫瘤部位明顯高于長端粒病人腫瘤部位，進一步表明長端粒病人腫瘤增殖慢而且腫瘤干細胞較少。

我們得出結(jié)論，短端粒腫瘤比長端粒腫瘤增殖能力強分化程度低。

增值的腫瘤干細胞具有較短端粒但同時表達多能基因

為了進一步驗證腫瘤干細胞在端粒長度方面是否存在差異，我們用LGR5，CD44，CD133作為標志物進行流式細胞分選，并驗證細胞端粒長度。我們發(fā)現(xiàn)，短端粒病人腫瘤部位的LGR5陽性細胞端粒長度明顯比LGR5陰性細胞短。同樣的，CD133或CD44陽性細胞端粒長度比陰性細胞短。同時用IF-FISH的方法檢測發(fā)現(xiàn)，LGR5陽性細胞端粒明顯短于正常組織腺窩上部的LGR5陽性細胞。因此我們的結(jié)論是，可能是因為不斷增殖導致腫瘤干細胞端粒縮短。

我們通過免疫熒光和免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞表達多能基因OCT4和NANOG。OCT4高表達的部位大都在腫瘤部位，而且在CD44陽性細胞中可以找到OCT4陽性細胞，在CD44陰性細胞中可以找到OCT4陰性細胞。

短端粒腫瘤PML和APB表達水平較高，為了進一步驗證PML高表達細胞增殖快，我們在腫瘤部位和正常部位共染PML和KI67。結(jié)果顯示，許多細胞同時高表達PML和KI67，并且在短端粒腫瘤病人中這種雙陽性細胞比例要高于長端粒腫瘤病人和正常組織。

這些結(jié)果表明了短端粒的結(jié)直腸癌腫瘤干細胞存在ALT途徑，并且這些細胞處于增殖狀態(tài)。

靶向ALT可以降低腫瘤干細胞的增殖能力和致癌性

最后，我們用特異性抑制劑抑制ALT，檢測是否能夠消除腫瘤干細胞的致瘤能力。我們用ATR抑制劑VE-821來處理結(jié)腸癌細胞系HCT116以抑制ALT。VE-821可以降低HCT116和U2OS細胞中的PML和APB的表達量，同時能導致端粒長度縮短。

我們用CD44和CD133作為標志物，流式分選HCT116細胞系，得到CD44+CD133+,CD44+CD133-,CD44-CD133+和CD44-CD133-四組細胞。通過成球?qū)嶒瀬頇z驗細胞增殖能力，結(jié)果顯示，CD44+CD133+細胞增殖能力最強，CD44-CD133-細胞增殖能力最弱。用VE-821處理這四組細胞后，能顯著抑制CD44+CD133+,CD44+CD133-,CD44-CD133+細胞的成球能力，但是對CD44-CD133-細胞影響不大；并且處理72小時后，前三組細胞端粒長度有了明顯縮短，但第四組沒有明顯差異。通過體內(nèi)成瘤實驗，用VE-821處理后的CD44+CD133+細胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤體積減小，重量減輕，成瘤能力減弱。這些結(jié)果表明，靶向ALT之后，能降低腫瘤干細胞APB表達，使細胞端粒長度縮短，減弱其成瘤能力。參見附圖4，其中(A)Western blot檢測不同濃度VE-821對PML的抑制效果。(B)使用3.2μM的VE-821處理結(jié)直腸癌細胞系HCT11672小時后對APB的影響，U2OS作為對照。(C，D)用VE-821處理后對HCT116和U2OS的APB點數(shù)目的影響統(tǒng)計圖。(E)用VE-821處理后對HCT116和U2OS的端粒長度影響。(F)使用CD44和CD133抗體流式分選腫瘤類干細胞。(G)分選不同細胞群后使用VE-821處理后端粒長度變化。(H)TRF驗證端粒長度變化。(I)注射加3.2μM的VE-821處理的CD44+CD133+類干細胞和不加藥的CD44+CD133+類干細胞到裸鼠后5周成瘤情況。(J)裸鼠成瘤數(shù)目統(tǒng)計。(K)裸鼠成瘤重量統(tǒng)計。

下面通過實例做進一步說明：

材料方法

病人和腫瘤組織

病人結(jié)直腸癌腫瘤組織和相對應(yīng)的癌旁與遠癌組織均取自天津醫(yī)科大學總醫(yī)院。相應(yīng)的癌旁與遠癌組織分別取自腫瘤末端5cm和10cm處，并且經(jīng)過顯微鏡驗證。腫瘤組織學分類是根據(jù)前期標準建立的(在Table S1中有更多病人臨床信息)。所有病人在手術(shù)前均沒有接收腫瘤輔助治療。樣品取出后一小時之內(nèi)保存到液氮中，用于DNA,RNA,蛋白的提取和冰凍切片的包埋。新鮮樣品在冰上運送，用3.7％PFA固定，然后進行石蠟包埋。用正常結(jié)腸樣品和潰瘍性街長陽病人樣品做對照。該研究經(jīng)過了天津醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會的批準，并且在研究前取得了病人的知情同意。

用實時定量PCR檢測端粒長度

用DNeasy Blood&Tissue kit(69504,Qiagen)提取病人樣品基因組DNA.用Nanodrop 2000分光光度計檢測DNA質(zhì)量，260/280比值均在1.8到2.1之間。平均端粒長度用實時定量PCR方法進行檢測，具體方法見^1,2(Table S3).用Realplex PCR檢測系統(tǒng)(Eppendorf)進行PCR反應(yīng).我們使用連續(xù)稀釋的已知濃度的人成纖維細胞DNA制作PCR反應(yīng)的標準曲線。端粒信號T與人單拷貝基因36B4信號S的比值-T/S，可以表明端粒相對長度。每個樣品至少檢測3次。

用DNA印跡法進行端粒末端限制片段(TRF)分析

端粒末端限制片段(TRF)分析使用商品化試劑盒(TeloTAGGG Telomere Length Assay,Cat no.12209136001,Roche Life Science).用DNeasy Blood&Tissue kit(69504,Qiagen)提取樣品基因組DNA,用限制性內(nèi)切酶Hinf I和Rsa I r對1.5ugDNA樣品進行酶切。消化好的DNA用0.8％的瓊脂糖凝膠(111860,Biowest進行電泳，電泳液為1×TAE，在電壓為6V/cm的條件小電泳4小時。凝膠經(jīng)過變性，中和后轉(zhuǎn)移到帶有正電荷的尼龍膜(RPN2020B,GE Healthcare)上過夜。濾膜用包含端粒探針的DIG Easy Hyb在42度條件下雜交過夜。根據(jù)試劑盒說明對平均末端限制性片段(TRF)長度進定量。

免疫熒光顯微技術(shù)

組織切片的免疫熒光：經(jīng)過脫蠟，水化，PBS洗等過程后，石蠟切片需要在室溫條件下用3％H₂O₂孵育10分鐘以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，然后用0.01M檸檬酸緩沖液在高溫高壓條件下抗原修復3分鐘，然后用PBS配置封閉液，濃度為5％羊血清加1％BSA(用于一抗來源為兔和小鼠)或者0.01％BSA(用于一抗來源為山羊)，室溫封閉2小時。然后一抗4度孵育過夜，所用到的一抗為PML(sc-966,Santa Cruz),CD44(ab6124,Abcam),KI67(AB9260,Millipore),EPHB2(AF467,R&D),PCNA(sc-25280,Santa Cruz),LAMINA(AB26300-100,Abcam),53BP1(ab36823,Abcam),or OCT4(sc-9081,Santa Cruz)，然后用PBS洗一抗，洗三次，每次5分鐘。二抗室溫孵育2小時，用到的二抗為(Alexa Fluor 594donkey anti-goat IgG,A-11058,Invitrogen；Goat Anti-Mouse IgG(H+L)FITC115-095-003,Jackson；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)Alexa594A-11037,Life technology；or Cy3Goat Anti-Rat IgG(H+L),A0507,Beyotime Biotech)。用無一抗的封閉液做負對照。用Hoechst 33342or DAPI染核.用Z1熒光顯微鏡拍照(Axio Imager Z1)。

用冰凍切片做LGR5(562731,BD Pharmingen)的免疫熒光。病人組織保存在液氮中，用OCT(SAKURAO.C.T.)包埋，切片厚度為7um。冰凍切片在室溫干燥30分鐘，然后用冰丙酮固定10分鐘，風干，用PBS洗兩次，每次15分鐘，封閉、一抗和二抗孵育等過程同石蠟切片的步驟。

免疫熒光定量

每個細胞或者細胞核的整體熒光強度用ImageJ1軟件定量，用非特異性背景染色作為統(tǒng)計閾值。通常在短端粒組和長端粒組隨機選擇6到12個人進行統(tǒng)計。每個病人，腫瘤部位和遠端正常部位分別選取5個視野，每個視野隨機選取20個細胞進行統(tǒng)計。每種組織類型至少統(tǒng)計100個細胞，并且比較陽性細胞的相對熒光強度。

免疫組織化學

經(jīng)過脫蠟，水化，PBS洗等過程后，石蠟切片需要在室溫條件下用3％H₂O₂孵育10分鐘以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，然后用0.01M檸檬酸緩沖液在高溫高壓條件下抗原修復3分鐘，然后用PBS配置封閉液，濃度為5％羊血清加1％BSA，室溫封閉2小時。一抗4度孵育過夜，一抗有TERT(sc-7212,Santa Cruz),PML(sc-966,Santa Cruz),TRF1(TRF11-S,Alpha Diagnostic)or NANOG(ab80892,Abcam)。PBS洗三次，二抗(HRP-Polymer anti-mouse/rabbit IHC Kit,5010,Maixin Bio；or Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Rat IgG(H+L),ZB-2307,ZSGB-BIO)37度孵育15分鐘，然后用PBS洗，接下來是DAB(3,3’-diaminobenzidine)顯色反應(yīng)。石蠟切片用蘇木精復染，然后計數(shù)。LGR5(BD Pharmingen^TM)抗體的免疫組化是用冰凍切片做成。冰凍切片風干后，用冰丙酮固定10分鐘，風干，PBS洗兩次，封閉、一抗和二抗孵育的步驟與石蠟切片一致。

組織端粒熒光原位雜交

病人組織保存在液氮中，用OCT(SAKURAO.C.T.)包埋，切片厚度為7um。熒光原位雜交方法參考³,本研究中用到的端粒探針為FITC-labeled(CCCTAA)peptide nucleic acid(PNA)probe(Panagene,Korea)。端粒在80度條件下變性3分鐘，然后端粒探針(0.5μg/ml)雜交。用Zeiss Axio Imager Z2顯微鏡拍攝熒光。對端粒長度定量時，用TFL-TELO program(gift kindly provided by P.Lansdorp,Terry Fox Laboratory,Vancouver,Canada)計量端粒熒光強度。

實時定量PCR分析基因表達

用Qiagen RNeasy Plus Universal mini kit(73404,QIAGEN)提取總RNA,并用DNase I(79254,Qiagen)處理.RNA was subject to cDNA synthesis using 用M-MLV Reverse Transcriptase(28025021,Invitrogen)將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA.PCR反應(yīng)用Realplex PCR(Eppendorf)檢測系統(tǒng)進行實驗。引物用IDT DNA網(wǎng)站(http://www.idtdna.com/site)提供的工具進行設(shè)計或者使用通過熔解曲線驗證的已發(fā)表文章中的引物(Table S4)。所有的反應(yīng)(一式兩份)擴增目的基因時用內(nèi)源性GAPDH基因表達作為對照。目的基因相對定量是通過比較循環(huán)閾值實現(xiàn)的。

雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳的方法參考⁴,有一些細微的改動。用雙向凝膠電泳分析環(huán)狀DNA分子和端粒重復DNA環(huán)(t-circles)。用Hinf I and Rsa I(12209136001,Roche Life Science)消化9ug基因組DNA,室溫條件下用0.4％的地點瓊脂糖凝膠進行第一次電泳18小時，電壓為12V，電泳液為1xTris-borate-EDTA。(separated through first dimensional running on a 0.4％low-EEO agarose gel in 1xTris-borate-EDTA at 12V for 18h at room temperature.)將有樣品的凝膠切割下來，與電泳方向呈90度放置，配置1.0％的瓊脂糖凝膠(Lanes containing samples were cut and placed at 90°to the direction of electrophoresis,poured with 1.0％agarose gel.)。第二維度在室溫條件下電泳4.5小時，電壓為60V。DNA轉(zhuǎn)到Hybond-N+Chargen Nylon Membrane(RPN2020B,GE Healthcare)中，然后用c-rich的端粒探針和DIG(12209136001,Roche Life Science)進行雜交。清洗之后，膜用Anti-DIG-APQ工作液孵育。t-circle定量參考⁵。HeLa和U2OS細胞系分別作為ALT途徑陰性和陽性的對照。腫瘤樣品包括短端粒組的NO.5、NO.15，和長端粒組的NO.46、NO.47.

PML-telomere FISH

細胞的PML-FISH步驟參見⁶。細胞爬片生長到合適密度后，用PBS洗一次，在室溫條件下用2％多聚甲醛國定10分鐘，然后用PBS洗兩次，每次5分鐘。用封閉液孵育30分鐘，(封閉液配方：3％goat serum,1mg/ml BSA,0.1％TritonX-100,1mM EDTA PH8.0),然后4度孵育一抗PML(sc-966,Santa Cruz)過夜，PBS洗一抗，洗三次，每次15分鐘。然后室溫孵育二抗兩小時(594Goat Anti-Mouse IgG(H+L),A11032,Invitrogen)。PBS洗三次，每次5分鐘，2％多聚甲醛固定2分鐘，PBS清洗，然后用70％,95％,100％乙醇各脫水5分鐘，風干。在80度條件下端粒變性3分鐘，然后室溫避光條件下，端粒探針(濃度為0.5μg/ml)雜交2小時。用清洗緩沖液洗滌細胞兩次，每次15分鐘(清洗緩沖液70％formamide,A100314-0500；10mM Tris-HCL PH7.2,T2069-100ML,SIGMA)，然后用PBS洗三次，每次5分鐘，脫水風干，用含有DAPI的Vectashield染核。

用冰凍切片做IF-FISH的具體步驟參考O'Sullivan et al⁷,并且有細微改動。病人組織保存在液氮中，用OCT(SAKURA O.C.T.)包埋，切片厚度為7um。冰凍切片干燥30分鐘，然后在冰丙酮中固定10分鐘，風干，PBS洗兩次，封閉后加一抗PML(sc-966,Santa Cruz)，4度孵育過夜，PBS洗一抗，洗三次，每次15分鐘，二抗(594Goat Anti-Mouse IgG(H+L),A11032,Invitrogen)室溫孵育兩小時。PBS洗三次，每次5分鐘，用4％多聚甲醛室溫固定2分鐘，25％，50％，95％乙醇分別脫水5分鐘，風干。然后用10mg/ml RNAse 37度孵育10分鐘，PBS洗，25％，50％，95％乙醇分別脫水5分鐘，風干。78度條件下端粒變性10分鐘，端粒探針(0.5μg/ml,FITC-labeled(CCCTAA),Panagene,Korea)室溫雜交過夜。然后用70％甲酰胺緩沖液洗四次，每次15分鐘，用PBS/0.05％Tween 20洗四次，每次5分鐘，25％，50％，95％乙醇分別脫水5分鐘，風干。用含有DAPI的Vectashield染核。根據(jù)中提到的方法統(tǒng)計APB.

用流式細胞術(shù)從組織中分離細胞

組織分離是根據(jù)⁹描述的方法進行。首先用含有青霉屬(500U/ml)、鏈霉素(500mg/ml)和兩性霉素B(1.25mg/ml)(E485,Amresco)的PBS緩沖液劇烈清洗四次。用剪刀將組織剪碎，過40mm細胞濾網(wǎng)(352340,BD Biosciences)，然后用Dulbecco’s modified Eagle medium(12800017,Invitrogen)37度孵育1小時，培養(yǎng)液中添加成分：2.5％fetal bovine serum(Hyclone),penicillin/streptomycin(15140-122,Invitrogen),1.5mg/ml(75U/mL)collagenase type IV(17104019,Life technologies),20mg/ml Hyaluronidase(H-6254,Sigma),and DNase I(79254,Qiagen)。然后用含有1％BSA的PBS重懸。原代細胞用指標抗體孵育，LGR5-APC(562903,BD),CD133-APC(130-098-129,Miltenyi Biotec),or CD44-FITC antibody(H20441-02H,Sungene Biotech Co.).用BD Ariall細胞分選儀進行流式細胞術(shù)分析和細胞分選。分選出的細胞用QIAamp DNA micro kit(56304,QIAGEN)提取DNA，然后用qPCR檢測端粒長度。

熒光激活細胞分選術(shù)分選細胞系

收細胞之后用PBS洗兩次，用FACS緩沖液重懸，緩沖液成分：含有0.1％的PBS溶液，緩沖液中含有直標抗體10μl CD133/2(293C3)-APC(130-098-129,Miltenyi Biotec)和10μlCD44-FITC(H20441-02H,Sungene Biotech Co.).。然后在冰上避光孵育20分鐘，然后用4mlFACS緩沖液清洗。用500μl FACS緩沖液重懸細胞沉淀，然后用BD AriaII細胞分選儀(BD Biosciences)分選細胞。

細胞培養(yǎng)和處理

結(jié)腸癌細胞系(HCT116)¹⁰，在37度5％CO₂條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液為RPMI 1640(11875085,Life technologies)加10％FBS.骨肉瘤細胞(U2OS)和子宮頸癌細胞(HeLa)培養(yǎng)液為high-glucose Dulbecco's modified eagle medium高糖杜氏培養(yǎng)基(12800017,Gibco)加10％FBS和1％青霉素和鏈霉素。細胞用ATR 抑制劑VE-821(S8007,Selleckchem)處理，用DMSO處理后作為對照。

蛋白質(zhì)印記

蛋白質(zhì)印記(western blot)實驗步驟是根據(jù)⁶進行的。實驗過程中抗體為PML(sc-966,Santa Cruz)andβ-actin(sc1616R,Santa Cruz)。蛋白質(zhì)條帶檢測使用Enhanced ECL Amersham^TM prime western blotting detection reagent(RPN2232,GE Healthcare)。

細胞成球?qū)嶒?/p>

成球?qū)嶒炇歉鶕?jù)¹¹的方法進行實驗。分選出的HCT116細胞用低粘度6孔板(3471,Corning)培養(yǎng)，每個孔培養(yǎng)5000個細胞，培養(yǎng)條件為37度5％CO₂，培養(yǎng)液為無血清的DMEM/F12，含有表皮生長因子(EGF,20ng mL^-1)和纖維母細胞生長因子(FGF,10ng mL^-1)。培養(yǎng)液每48小時更換一次，細胞成長為非粘聯(lián)的聚合體或球體。細胞培養(yǎng)14天后計數(shù)。能在體外形成球體的結(jié)腸癌細胞中富含干細胞或祖細胞，這些細胞能夠在無血清狀態(tài)下成活并懸浮成長，而分化細胞在該條件下會導致細胞死亡。

致瘤實驗

為了檢測用VE-821處理過的CD133⁺CD44⁺stem-like cells的致瘤能力,用流式細胞術(shù)分選出細胞后，用濃度為3.2mM的VE-821處理后培養(yǎng)12小時，然后計數(shù)1000個細胞，然后注射到6周大的免疫缺陷的雌鼠兩側(cè)皮下，具體方法參考¹²。在短時期內(nèi)可以形成明顯的腫瘤，并且在注射5周后對腫瘤稱重。本實驗使用的小鼠經(jīng)過了南開大學動物保護和利用委員會的批準。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。

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