專利名稱：一種c-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬多肽化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種c-端乙胺化多肽及其衍生物的固相
制備方法。
背景技術(shù)：
多肽是氨基酸按一定順序縮合所成的肽鏈，肽鏈經(jīng)過修飾形成多肽衍生物。
多肽或其衍生物的c端經(jīng)過乙胺化修飾后可以增強(qiáng)其生物活性及蛋白酶解穩(wěn)定
性，從而提高其在生物體內(nèi)的利用率。c端乙胺化的多肽主要是促黃體生成釋放
激素的類似物，包括亮丙瑞林、組胺瑞林、阿拉瑞林、德舍瑞林等，主要作用是 有效地抑制垂體-性腺系統(tǒng)功能，臨床上主要用于前列腺癌及子宮內(nèi)膜異位癥的
治療，每年的銷售額高達(dá)10億美元以上。c-端乙胺化多肽的制備方法目前主要
有以下三種。
(l)液相合成法1974年，日本武田化工的FujinoMasahiko等人首先提出 了該類多肽的的液相制備方法[JP19740027442， US4008209]:以氨基為Z保護(hù)的 氨基酸為原料，以HBr脫除Z保護(hù)基，液相片段法合成C端乙胺化的亮丙瑞林。 該法制備周期長(zhǎng)，反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境污染嚴(yán)重，僅適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備，不宜 放大。(2)固、液相合成法RonaldLeeGendrich等人采用Boc固相法合成了促 黃體生成釋放激素類似物[US3914412]，氨解后，加入無水HF在液相中脫保護(hù) 及切割，得到產(chǎn)物。該法雖然繼承了固相法快速的優(yōu)勢(shì)，但是需要使用劇毒、強(qiáng) 腐蝕的HF試劑，污染嚴(yán)重；且仍須在液相中進(jìn)一步反應(yīng)才能得到產(chǎn)物，延長(zhǎng)了 制備周期。(3) Fmoc固相一步法借助于昂貴、稀有的固相載體，比如Sieber Ethylamine resin[J. Pept. Res. 2005， 66(1): 57-64]和Indole resin[J. Org. Chem. 1998, 63， 5300-5301]，采用溫和的Fmoc固相合成法一步法制備此類多肽及其衍生物。 這種方法雖然簡(jiǎn)便，但是所用固相載體及其制備技術(shù)均未國產(chǎn)化，載體完全依賴 進(jìn)口，導(dǎo)致多肽制備成本高，極大限制了這種方法的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、高效及成本低廉的C-端乙胺化多肽的制備 方法，解決目前C-端乙胺化多肽及多肽衍生物制備方法工藝繁瑣、周期長(zhǎng)、污 染嚴(yán)重或成本高、不易放大的問題。
一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，具體技術(shù)方案如下 (1)固相載體的制備向帶有過濾裝置的容器中加入三苯甲基氯型樹脂。向所述容器中加入溶劑二 氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)、 二甲基甲酰胺(DMF)、 N-甲基吡咯烷酮中 的一種或幾種，浸沒樹脂，靜置0.5h 2h。然后向所述容器中通入物質(zhì)的量為三 苯甲基氯型樹脂5 20倍的乙胺氣體，密閉所述容器，10。C 50。C下反應(yīng)lh 3h。 反應(yīng)結(jié)束后，向所述容器中加入溶劑二氯甲烷、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一種或幾種，浸沒樹脂，過濾；然后再向所述容器中加入溶劑 二氯甲垸、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯垸酮中的一種或幾種，浸沒樹 脂，過濾，得到a。
(2) C端氨基酸與固相載體的連接
于C-端乙胺化多肽或其衍生物的C端氨基酸及縮合試劑中加入溶劑二氯甲 垸、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯垸酮中的一種或幾種，溶解混合物。 然后將所得的混合物溶液加入到所述的a中，2(TC 60'C下反應(yīng)lh 10h。反應(yīng)結(jié) 束后，過濾。然后加入溶劑二氯甲烷、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯垸 酮中的一種或幾種，浸沒樹脂，過濾；再向所述容器中加入二氯甲垸、四氫呋喃、 二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯垸酮中的一種或幾種，浸沒樹脂，過濾，得到b。其 中，所述的縮合試劑包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)， N-羥基苯并三氮唑(HOBt)， 苯并三氮唑-N， N， N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)， 2-(7-偶氮苯并三氮 唑)-N， N， N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)， N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑 (HOAT)，卡特縮合劑BOP reagent,六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯烷基磷 (PyBOP)中的一種或幾種。所述的氨基酸為氨基為芴甲氧羰基(Fmoc)保 護(hù)的氨基酸。所述的氨基酸和縮合試劑的物質(zhì)的量的比例為1: 1~1.5。所述的
氨基酸和縮合試劑與樹脂的物質(zhì)的量的比例為5~2: 1。
(3) 氨基保護(hù)基的脫除
在b中加入脫保護(hù)試劑，20'C 6(TC下反應(yīng)0.5h 2h。反應(yīng)完畢后，過濾。然 后加入適量溶劑二氯甲垸、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯垸酮中的一種 或幾種，浸沒樹脂，過濾；再向所述容器中加入溶劑二氯甲烷、四氫呋喃、二甲 基甲酰胺、N-甲基吡咯垸酮中的一種或幾種，浸沒樹脂，過濾，得到c。所述的 脫保護(hù)試劑為哌啶(PIP)與二甲基甲酰胺體積比為1: 1~4的溶液。
(4) 氨基酸與氨基酸的縮合
向C端第二個(gè)氨基酸及縮合試劑中加入溶劑二氯甲垸、四氫呋喃、二甲基 甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一種或幾種，溶解。然后將所得的混合物溶液加入 到所述的c中，20'C 60'C下反應(yīng)lh 3h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后加入溶劑二 氯甲烷、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一種或幾種，浸沒樹脂，過濾；再向所述容器中加入溶劑二氯甲垸、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡 咯垸酮中的一種或幾種，浸沒樹脂，過濾，得到d。所述的縮合試劑、氨基酸、 氨基酸與縮合試劑的比例、氨基酸和縮合試劑與樹脂的比例均符合(2)中的要 求。
(5) 肽鏈的延長(zhǎng)
按照多肽或其衍生物C端到N端的順序，循環(huán)(3)和(4)的操作，合成 所需的多肽或其衍生物肽鏈e。
(6) 多肽的切割及分離純化
在所述的e中加入適量切割試劑，0'C 60'C下反應(yīng)lh 3h。過濾，在濾液 中加入乙醚，產(chǎn)生沉淀，然后離心，得到沉淀。將沉淀溶于溶劑水、乙腈、甲醇、 二甲基甲酰胺中的一種或幾種，經(jīng)制備高效液相色譜分離純化，冷凍干燥后得到 目標(biāo)產(chǎn)物f。其中所述的切割試劑為三氟乙酸(TFA)、重蒸水、三乙基硅垸(TES)、 1， 2二硫蘇糖醇(DTT)、苯酚、苯甲硫醚、三異丙基硅烷、苯甲醚、乙二硫醇 中的一種或幾種。
本發(fā)明的反應(yīng)路線如下
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本發(fā)明的有益效果是(1)采用自制的固相載體，大大降低了 C端乙胺化 多肽及其衍生物的制備成本。該載體起始原料為國產(chǎn)普通的多肽合成用樹脂，價(jià)格便宜。經(jīng)過非常簡(jiǎn)單、價(jià)廉的改造后，即可用于C端乙胺化多肽及其衍生物 的制備，解決了固相載體國產(chǎn)化、經(jīng)濟(jì)化制備的問題，從而節(jié)約了制備成本。(2) 采用Fmoc固相一步法合成C端乙胺化多肽或及其衍生物，無需經(jīng)過液相法中間 產(chǎn)物分離純化的步驟，工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，制備周期短，試劑低毒無污染。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過以下實(shí)例作進(jìn)一步舉例說明，這些實(shí)例不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例h制備亮丙瑞林(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt)
(1) 乙胺樹脂的制備稱量2-氯三苯甲基氯樹脂(lmmol/g) lg，置于玻璃砂 芯反應(yīng)器中，加入DCM 15mL，靜置溶脹樹脂0.5h。通入0.326mL乙胺氣體。 lO'C下反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入15mLDMF洗滌樹脂， 過濾。再加入15mLTHF洗滌樹脂，過濾。
(2) 連接C端氨基酸Pro
稱量Fmoc-Pro-OH， HBTU和HOBt各2mmo1，加入10mL DMF溶解。然后 將混合液加入(1)中的樹脂中，同時(shí)加入4mmol二異丙基乙基胺(DIEA)， 20°C 下反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入15mLDMF洗滌樹脂，過濾。 再加入15mLNMP洗滌樹脂，過濾。
(3) 脫除Pro氨基保護(hù)基Fmoc
向(2)中的Fmoc-Pro-樹脂加入10mL20% PIP/DMF溶液，20。C下反應(yīng)0.5h。 反應(yīng)完畢后，過濾。然后向樹脂中加入15mLDMF洗滌樹脂，過濾。再加入15mL DMF洗滌樹脂，過濾。
(4) Arg與Pro的縮合
稱量Fmoc-Arg(pbf)-OH, HBTU和HOBt各2mmo1，加入10mL DMF溶解。 然后將混合液加入到步驟(3)所得的樹脂中，同時(shí)加入4mmo1 D正A， 20'C下 反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入15mLDMF洗滌樹脂，過濾。 再加入15mLDMF洗漆樹脂，過濾。
(5) 肽鏈的延長(zhǎng)。
按照亮丙瑞林序列從C端到N端的順序，重復(fù)脫保護(hù)(3)和縮合(4)兩 步反應(yīng)，合成亮丙瑞林。
(6) 亮丙瑞林的切割及純化
在步驟(5)所得的亮丙瑞林-樹脂中加入0.125mL苯甲醚、0.125mL三乙基 硅垸以及4.75mL三氟乙酸，0'C下反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，收集濾液，在濾液中加入適量無水乙醚析出亮丙瑞林，然后離心得到亮丙瑞林粗品。將亮丙瑞 林粗品溶于lmL甲醇和水體積比為l: l的溶液中，經(jīng)制備高效液相色譜純化，
凍干后得到產(chǎn)物亮丙瑞林。純度為99.3%，產(chǎn)率為80.4%， [M+]=1210.6。
實(shí)施例2:制備組胺瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt)
(1) 乙胺樹脂的制備稱量4-甲基-2-氯三苯甲基氯樹脂(lmmol/g) 2g，置于 玻璃砂芯反應(yīng)器中，加入DMF20mL，靜置溶脹樹脂lh。通入0.653mL乙胺氣 體。3(TC下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入20mLDCM洗滌樹 脂，過濾。再加入20mLDCM洗滌樹脂，過濾。
(2) 連接C端氨基酸Pro
稱量Fmoc-Pro-OH， HATU和HOAt各8mmo1， lOmmol， lOmmol，加入20mL DMF溶解。然后將混合液加入(1 )中的樹脂中，同時(shí)加入16mmo1 D正A， 40°C 下反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入20mLNMP洗滌樹脂，過濾。 再加入20mL NMP洗滌樹脂，過濾。
(3) 脫除Pro氨基保護(hù)基Fmoc
向(2)中的Fmoc-Pro-樹脂加入15mL30o/oPIP/DMF溶液，4(TC下反應(yīng)lh。 反應(yīng)完畢后，過濾。然后向樹脂中加入20mLNMP洗滌樹脂，過濾。再加入20mL DMF洗滌樹脂，過濾。
(4) Arg與Pro的縮合
稱量Fmoc-Arg(pbf)-OH， HATU和HOAt各8mmo1， lOmmol， lOmmol，加 入20mLNMP溶解。然后將混合液加入到步驟(3)所得的樹脂中，同時(shí)加入 16mmo1 D正A， 4(TC下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入20mLNMP 洗滌樹脂，過濾。再加入20mLDCM洗滌樹脂，過濾。
(5) 肽鏈的延長(zhǎng)。
按照組胺瑞林序列從C端到N端的順序，重復(fù)脫保護(hù)(3)和縮合(4)兩 步反應(yīng)，合成組胺瑞林。
(6) 組胺瑞林的切割及純化
在步驟(5)所得的組胺瑞林-樹脂中加入O.lmL重蒸水、O.lmL乙二硫醇以 及4.8mL三氟乙酸，30'C下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，收集濾液，在濾液中 加入適量無水乙醚析出組胺瑞林，然后離心得到組胺瑞林粗品。將組胺瑞林粗品 溶于lmL甲醇和水體積比為l: 2的溶液中，經(jīng)制備高效液相色譜純化，凍干后 得到產(chǎn)物組胺瑞林。純度為99.5%，產(chǎn)率為78.4%， [M+]=1324.2。實(shí)施例3:制備阿拉瑞林(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHEt)
(1) 乙胺樹脂的制備稱量2-氯三苯甲基氯樹脂(lmmol/g) 3克，置于玻璃砂 芯反應(yīng)器中，加入THF20mL，靜置溶脹樹脂2h。通入1.306mL乙胺氣體。50°C 下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入20mLDCM洗滌樹脂，過濾。 再加入20mL DCM洗滌樹脂，過濾。
(2) 連接C端氨基酸Pro
稱量Fmoc-Pro-OH, PyBOP和HOBt各15腿o1， 22.5mmo1， 22.5畫o1，力口 入25mL NMP溶解。然后將混合液加入(1)中的樹脂中，同時(shí)加入3Ommo1 DIEA， 60'C下反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入20mL NMP洗 滌樹脂，過濾。再加入20mLDMF洗滌樹脂，過濾。
(3) 脫除Pro氨基保護(hù)基Fmoc
向(2)中的Fmoc-Pro-樹脂加入20mL50。/。PIP/DMF溶液，60。C下反應(yīng)2h。 反應(yīng)完畢后，過濾。然后向樹脂中加入20mLNMP洗滌樹脂，過濾。再加入20mL NMP洗滌樹脂，過濾。
(4) Arg與Pro的縮合
稱量Fmoc陽Arg(pbf)-OH, PyBOP和HOBt各15mmo1， 22.5mmol， 22.5mmo1， 加入25mLDMF溶解。然后將混合液加入到步驟(3)所得的樹脂中，同時(shí)加入 30mmolDIEA， 60。C下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾。然后向樹脂中加入20mLTHF 洗滌樹脂，過濾。再加入20mLTHF洗滌樹脂，過濾。
(5) 肽鏈的延長(zhǎng)。
按照組胺瑞林序列從C端到N端的順序，重復(fù)脫保護(hù)(3)和縮合(4)兩 步反應(yīng)，合成組胺瑞林。
(6) 阿拉瑞林的切割及純化
在步驟(5)所得的阿拉瑞林-樹脂中加入0.11mL重蒸水、0.12mL三異丙基 硅烷以及4.77mL三氟乙酸，6(TC下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，收集濾液，在 濾液中加入適量無水乙醚析出阿拉瑞林，然后離心得到阿拉瑞林粗品。將阿拉瑞 林粗品溶于lmL甲醇和水體積比為l: 3的溶液中，經(jīng)制備高效液相色譜純化， 凍干后得到產(chǎn)物阿拉瑞林。純度為99.1%，產(chǎn)率為76.4%， [M+]=U68.5。
權(quán)利要求
1. 一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)固相載體的制備在三苯甲基氯類型樹脂中加入溶劑，浸沒樹脂，靜置后通入乙胺氣體，在密閉的條件下充分反應(yīng)，然后加入溶劑二次以上浸沒過濾得化合物a；(2)C端氨基酸與固相載體的連接于C-端乙胺化多肽或其衍生物的C端氨基酸及縮合試劑中加入溶劑溶解，將所得的混合物溶液加到所述的化合物a中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，然后加入溶劑二次以上浸沒過濾得化合物b；(3)氨基保護(hù)基的脫除在化合物b中加入脫保護(hù)試劑哌啶/二甲基甲酰胺，反應(yīng)結(jié)束后過濾，然后加入溶劑二次以上浸沒過濾得化合物c；(4)氨基酸與氨基酸的縮合向C端第二個(gè)氨基酸及縮合試劑中加入溶劑溶解，將所得的混合物溶液加入到所述的化合物c中，反應(yīng)結(jié)束后過濾，然后加入溶劑二次以上浸沒過濾得化合物d；(5)肽鏈的延長(zhǎng)按照多肽或其衍生物C端到N端的順序，循環(huán)(3)和(4)的操作，合成所需的多肽或其衍生物肽鏈化合物e；(6)多肽的切割及分離純化在所述的化合物e中加入切割試劑，切割反應(yīng)后過濾，在濾液中加入乙醚，產(chǎn)生沉淀，然后離心，得到沉淀化合物；將沉淀化合物溶于溶劑中，經(jīng)制備高效液相色譜分離純化，冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物f；上述六步操作如下id="icf0001" file="S2008100433623C00011.gif" wi="187" he="94" top= "176" left = "13" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>反應(yīng)式中R1＝Cl或H，R2＝甲基或甲氧基。
2、 根據(jù)權(quán)利l要求的一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，其特征 是步驟(1) ~ (5)中所述的溶劑為二氯甲垸、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲 基吡咯烷酮中的一種或幾種。
3、 根據(jù)權(quán)利l要求的一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，其特征 是步驟(1)中靜置的時(shí)間為0.5~2小時(shí)，乙胺氣體通入量為三甲苯基氯類型樹 脂物質(zhì)的量的5 20倍，三甲苯基氯類型樹脂與乙胺的反應(yīng)條件為1(TC 5(TC下 反應(yīng)1小時(shí)~3小時(shí)。
4、 根據(jù)權(quán)利l要求的一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，其特征 是步驟(2)反應(yīng)條件為2(TC 60'C下反應(yīng)1小時(shí)~10小時(shí)，所述的縮合試劑包括 二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N， N， N'， N'-四甲基脲 六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N， N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N-羥 基-7-偶氮苯并三氮唑、卡特縮合劑、六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯垸基磷 中的一種或幾種；所述的氨基酸為氨基為芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸；所述的氨 基酸和縮合試劑的物質(zhì)的量的比例為1: 1~1.5;所述的氨基酸和縮合試劑混合 物與樹脂的物質(zhì)的量的比例為5~2: 1。
5、 根據(jù)權(quán)利l要求的一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，其特征 是步驟(3)反應(yīng)條件為2(TC 6(TC下反應(yīng)0.5小時(shí)~2小時(shí)，脫保護(hù)劑中哌啶與 二甲基甲酰胺的體積比為1: 1~4。
6、 根據(jù)權(quán)利l要求的一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，其特征 是步驟(4)反應(yīng)條件為20'C 60'C下反應(yīng)1小時(shí)~3小時(shí)，所述的縮合試劑和氨 基酸、氨基酸與縮合試劑的比例、氨基酸和縮合試劑與樹脂的比例均滿足權(quán)利要 求4。
7、 根據(jù)權(quán)利1要求的一種C-端乙胺化多肽及其衍生物的制備方法，其特征 是(6)中所述的切割試劑為三氟乙酸、重蒸水、三乙基硅烷、1， 2二硫蘇糖 醇、苯酚、苯甲硫醚、三異丙基硅烷、苯甲醚、乙二硫醇中的一種或幾種，切割 反應(yīng)條件為0'C 60。C下反應(yīng)1小時(shí)~3小時(shí)，所述的溶劑為水、乙腈、甲醇、二 甲基甲酰胺中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽的制備方法，特別涉及一種C端乙胺化多肽或其衍生物的制備方法。本發(fā)明解決了液相合成法周期長(zhǎng)、Boc固液法使用劇毒試劑及Fmoc方法成本高的問題。制備步驟(1)制備的固相載體；(2)將C端氨基酸與固相載體連接；(3)脫除C端氨基酸的氨基保護(hù)基；(4)縮合C端第二個(gè)氨基酸與C端第一個(gè)氨基酸；(5)按照多肽或其衍生物C端到N端的順序，循環(huán)(3)和(4)的操作，合成所需的多肽或其衍生物肽鏈e；(6)加入切割試劑切割肽樹脂，經(jīng)制備高效液相色譜純化得到目標(biāo)產(chǎn)物f。本發(fā)明適合低成本、高效制備C端乙胺化多肽或其衍生物。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101279998SQ20081004336
公開日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者徐紅巖, 王衛(wèi)國 申請(qǐng)人:吉爾生化(上海)有限公司