專利名稱：一種阿托西班的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阿托西班的固相合成方法。
背景技術(shù)：
:阿托西班是子宮內(nèi)及蛻膜、胎膜上受體的環(huán)狀肽催產(chǎn)素競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑， 是產(chǎn)科藥物中的一種突破產(chǎn)品，已在奧地利、丹麥和瑞典上市，用于推遲不足月 分娩。估計(jì)不久還將在荷蘭、德國和英國上市，我國目前有進(jìn)口的上市但目前還 沒有國產(chǎn)化.阿托西班可劑量相關(guān)性地抑制宮縮，并使環(huán)狀肽催產(chǎn)素介導(dǎo)的前列 腺素分泌減少，達(dá)到保胎的目的，在中國，年出生率為2000萬，按目前臨床統(tǒng)
計(jì)數(shù)字，約5_15%的孕婦需要進(jìn)行保胎治療，按平均10%計(jì)，病人數(shù)量約為200 萬，所以該品種有較大的市場(chǎng)前景。 阿托西班的結(jié)構(gòu)如下
c[Mpr-D-Tyr(OEt)-lie-Thr-Asn-Cys]—Pro-Orn-Gly-NH2 為環(huán)狀性多肽，英名為Atosiban,根據(jù)其序列的特征，合成路線
有通過MBHA樹脂，Boc法固相合多肽，再通過溶液中碘氧化形成硫
硫鍵成環(huán)的產(chǎn)品，見專利EP0710243。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種阿托西班的固相合成工藝。本發(fā)明需要解決
的技術(shù)問題是選擇一種氧化方法，使其滿足(1)在多肽合成中具有穩(wěn)定性，
(2)可以方便的載體反應(yīng)，(3)可以避免空氣氧化中因多肽溶解性差而導(dǎo)致氧
化時(shí)間長或氧化不完全的缺陷，(4)可以縮短氧化時(shí)間大大提高效率。 本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義；
Fmoc :荷甲氧羰基
Fmoc-AA:芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸
tBu :叔丁基
HoBt: 1-羥基苯駢三唑
HBTU,苯并三氮唑-N,N，N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 DIC: N，N-二異丙基碳化二亞胺 DIEA: N,N-二異丙基乙胺 MPa:巰基丙酸D-Tyr(Et): D-型的酪氨酸鏈用乙基保護(hù)
lie :異亮氨酸
Thr:蘇氨酸
Asn:天門冬酰胺
Cys :半胱氨酸
Pro :脯氨酸
Orn:鳥氨酸
Gly :甘氨酸
Trt:三苯甲基
Et:乙基
Boc :叔丁氧羰基
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
Piperidine :六氫吡啶
Fmoc-Rink Amide Am resin :用Fmoc保護(hù)的Rink氨甲基樹月旨
TFA:三氟醋酸
TIS :三異丙基硅垸
MeOH:甲醇
CH2CL2: 二氯甲烷
Knisertest檢測(cè)試劑為茚三酮
本發(fā)明的技術(shù)方案為 一種阿托西班的固相合成方法，首先使用氨甲基樹脂 作載體，按照Fmoc/tbu固相多肽合成的方法將氨基酸逐個(gè)連上，再用樹脂上碘
氧化的方法形成硫硫鍵，最后再用三氟醋酸三異丙基硅垸水對(duì)甲酚的混合
溶液將肽從樹脂上切下，就能直接得到形成硫硫鍵的粗品，經(jīng)制備HPLC純化冷 凍得到阿托西班。
在接氨基酸過程中，用Fmoc-AA/HBTU/HOBT/DIEA(體積比為1:1:1: 2 ) ， Fmoc-AA縮合過程過量2-5倍，每一步縮合都經(jīng)過凱撒試劑(Kaiser test) 檢測(cè)，如顏色呈陽性則重復(fù)接氨基酸，然后用20M哌啶/DMF脫Fmoc，再用碘 的甲醇溶液與接上九個(gè)氨基酸的樹脂反應(yīng)30-90分鐘形成硫硫鍵，每克樹脂用
6-i0mi體積比三氟醋酸三異丙基硅垸水對(duì)甲酚=88 :2:5:5的混合液將肽從樹脂上切下。得到的粗品產(chǎn)率為92.3%左右，HPLC為78.2%。需要注意 的是，樹脂上碘氧化已形成硫硫鍵，所以選擇切割液切割樹脂時(shí)不能用含有二硫 醇的切割液。從上可以看出用此方法合成阿托西班，產(chǎn)率及純度都比較理想。另 外，此法對(duì)合成其它氨基酸類的硫硫鍵環(huán)化肽也具有一定的意義。
本發(fā)明的有益效果是我們選擇樹脂上碘氧化的方法形成硫硫鍵， 一方面， 它的反應(yīng)選擇條件是穩(wěn)定的，可以運(yùn)用到固相Fmoc/tbu的方法中去，另一方面 避免了空氣氧化法中因溶解性差而導(dǎo)致粗品損失，氧化時(shí)間長和氧化不完全等缺 點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l: 1，合成帶保護(hù)的九肽樹脂
多肽序列(c[mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2) 序列中各氨基酸投料量及一些試劑的投料量的計(jì)算 K=2.5 X m樹脂X Loading=2.5 X lgX 0.52mmol/g=l.3謹(jǐn)o1 活化劑:m(HoBt)=M(HoBt) X K=0.135g/mmol X 1.3mmol=0.176g 縮合劑:V(DIC"M(DIC) XK/0.81=0.126g/mmolX 1.3mmol/0.81g/ml=0.2ml 堿試齊U V(collidine)=2 X M(collidine) X K/0.80g/ml=2 X 0.124g/mmol X 1.3mmol/0.80g/ml=0.40ml
m(Gly)=M(Gly) X K=0.2973g/mmol X1.3mmol=0.386g m(orn)=M(orn) X K=0.4545g/mmol X 1.3mmol=0.591g m(pro)=M(pro) X K=0.3374g//mmol X 1.3mmol=0.439g m(cys)=M(cys) X K=0.5857g/mmol X 1.3mmol=0.761g m(Asn)=M(Asn) X K=0.5967g/mmol X 1.3mmol=0.776g m(Thr)=M(Thr) XK=0.3974g/mmolX 1.3mmol=0.517g m(Ile)=M(Ile) X K=0.3534g/mmol X 1.3mmol=0.459g m(D-Tyr)=M(D-Tyr) XK=0.4315X 1.3mmol=0.561g m(Mpa)=M(Mpa) X K=0.3480 X 1.3mmol=0.452g ①脫Fmoc保護(hù)基團(tuán)
取5g Fmoc-Rink Amide Am resin放入接肽瓶中，該樹脂的取代度為0.52mmol/g， 加入30~40ml 20% piperidine/DMF溶液振蕩5min，抽干，再加入30~40ml 20%piperidine/DMF溶液振蕩15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次， CH2CL2洗3次，抽干，取10-20顆樹脂作Kaiser test檢測(cè)顯藍(lán)色呈陽性，假若 是呈陰性，則重復(fù)以上脫帽步驟。 ②，F(xiàn)moc-Gly-OH的縮合
稱取Fmoc-Gly-OH 1.93 g， HoBt0.88g加入上面接肽瓶中。加入適量DMF， 2ml DIEA， 2.87gHBTU，密封后放入振蕩器中反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后的洗漆，將 反應(yīng)液抽干，用DMF洗樹脂3次，MeOH洗3次，CH2CLdA 3次，抽干，取 10-20顆樹脂作Kaiser test顯陰性，假若程陽性則重復(fù)上面縮合反應(yīng)操作直到反 應(yīng)完全Kaiser test顯陰性通過。
再依次接Fmoc隱orn(Boc)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Asn(Trt)-OH ， Fmoc-Thr(tBn)-OH ， Fmoc-Ile-OH ， Fmoc-D-Tyr(OEt)-(OH) ， Mpa(Trt)方法同 Fmoc-Gly-OH
實(shí)施例2,
稱取0.67g碘(此碘量為過量5倍)溶于10ml甲醇，與實(shí)施例1①的樹脂反 應(yīng)30min，溫度控制在0。C，反應(yīng)結(jié)束用DMF反復(fù)洗漆樹脂后用乙醚抽干樹脂。
將得到的樹脂加入到iomi的體積比三氟醋酸三異丙基硅烷水對(duì)甲酚
=88:2:5:5的混合液中，室溫振蕩1.5小時(shí)，過濾，用三氟醋酸洗樹脂2次， 濾液濃縮，加無水乙醚得白色團(tuán)體，反復(fù)用無水乙醚洗滌，得阿托西班粗品0.48g。 ESI: 994.87 HPLC: 53.2%最后分離純化冷凍干燥得成品阿托西班。 實(shí)施例3，
稱取0.67g碘(此碘量為過量5倍)溶于10ml甲醇，與實(shí)施例1①的樹脂反應(yīng) 75min，溫度控制在0t:，反應(yīng)結(jié)束用DMF反復(fù)洗滌樹脂后用乙醚抽干樹脂。后 處理同實(shí)例2，得阿托西班粗品0.45g。 ESI: 994.45 HPLC: 78.2%最后分離 純化冷凍干燥得成品阿托西班。 實(shí)施例4,
稱取0.67g碘(此碘量為過量5倍)溶于10ml甲醇，與實(shí)施例1①的樹脂反應(yīng) 90min，溫度控制在0。C，反應(yīng)結(jié)束用DMF反復(fù)洗滌樹脂后用乙醚抽干樹脂。后 處理同實(shí)例2，得阿托西班粗品0.39g。 ESI: 995.03 HPLC: 63.2%最后分離 純化冷凍干燥得成品阿托西班。
權(quán)利要求
1、一種阿托西班的固相合成方法，其特征是包括以下步驟首先使用氨甲基樹脂作載體，按照芴甲氧羰基/叔丁基固相多肽合成的方法將氨基酸逐個(gè)連上，再用樹脂上碘氧化的方法形成硫硫鍵，最后再用三氟醋酸∶三異丙基硅烷∶水∶對(duì)甲酚的混合溶液將肽從樹脂上切下，就能直接得到形成硫硫鍵的粗品，經(jīng)高效液相色譜純化冷凍得到阿托西班。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種阿托西班的固相合成方法，其特征是在接氨基酸過程中，用體積比芴甲氧羰基保護(hù)氨基酸/苯并三氮唑-N，N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/i-羥基苯駢三唑/ N,N-二異丙基乙胺二i :i:i:2，芴甲氧羰基 保護(hù)的氨基酸縮合過程過量2-5倍。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿托西班的固相合成方法，其特征是在接氨基酸過程中每一步驟縮合都經(jīng)過凱撒檢測(cè)，顏色呈陽性則重復(fù)接氨基酸。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿托西班的固相合成方法，其特征是所述 的碘氧化為將碘溶解在甲醇溶液中與接上九個(gè)氨基酸的樹脂反應(yīng)30-卯分鐘，溫度控制在(TC。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿托西班的固相合成方法，其特征是所述的將肽從樹脂上切下，每克樹脂用6-i0mi體積比三氟醋酸三異丙基硅垸 水對(duì)甲酚=88 :2:5:5的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種阿托西班的合成工藝，解決現(xiàn)有空氣液相氧化中溶解性差反應(yīng)時(shí)間長的技術(shù)問題，其合成工藝步驟如下使用氨甲基樹脂作載體，按照Fmoc/tbu固相多肽合成的方法將氨基酸逐個(gè)連上，再用樹脂上碘氧化的方法形成硫硫鍵，最后再用三氟醋酸∶三異丙基硅烷∶水∶對(duì)甲酚的混合溶液將肽從樹脂上切下，就能直接得到形成硫硫鍵的粗品，經(jīng)制備HPLC純化冷凍得到阿托西班。本發(fā)明提供了一種簡單易行可規(guī)模合成阿托西班的工藝。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101314613SQ20081004334
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者徐紅巖, 強(qiáng) 戴, 薛志娟, 金健林 申請(qǐng)人:吉爾生化(上海)有限公司