1.一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法,包括以下步驟:
1)提取木質部組織的基因組DNA,所述木質部組織取自林木胸徑位置成熟木質部;
2)采用第一組酶和第二組酶分別對所述基因組DNA進行雙酶切,在兩組雙酶切產(chǎn)物上分別連接接頭,得到兩組酶切連接后的產(chǎn)物;
所述第一組酶包括EcoRI和HpaII,所述第二組酶包括EcoRI和MspI;
3)分別對兩組酶切連接后的產(chǎn)物依次進行預擴增和選擇性擴增,通過毛細管電泳分離所述選擇性擴增的產(chǎn)物,獲得群體基因組甲基化標記位點;
所述選擇性擴增用引物為:在預擴增用引物的3'端隨機增加3個核苷酸堿基,且5'端進行熒光標記;
4)從所述群體基因組甲基化標記位點中篩選符合孟德爾遺傳分離的群體甲基化多態(tài)性位點,構建甲基化遺傳連鎖圖譜。
2.根據(jù)權利要求1所述的構建方法,其特征在于,所述步驟2)中第一組酶EcoRI和HpaII的雙酶切產(chǎn)物用接頭的序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示;
所述步驟2)中第二組酶EcoRI和MspI的雙酶切產(chǎn)物用接頭的序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的構建方法,其特征在于,所述預擴增用引物的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的構建方法,其特征在于,所述步驟2)中的雙酶切和連接接頭在一個體系中進行,所述體系包括:2μL 10×Buffer,0.25μL12U/μL的EcoRI酶,0.4μL 10U/μL的HpaII或MspI酶,1μL 100μM的EcoRI的接頭,1μL 100μM的HpaII或MspI的接頭,0.5μL 10U/μL的T4DNA連接酶,4μL 100ng/μL的基因組DNA,ddH2O補足至20μL;
所述體系的溫度為35~37℃,酶切與連接反應總時間為10~14h。
5.根據(jù)權利要求3所述的構建方法,其特征在于,所述步驟3)中預擴增的反應體系包括:4μL 5×Buffer,1μL 10μM的SEQ ID No.5引物,1μL 10μM的SEQ ID No.6引物,0.3μL 10mM的dNTPs,0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase,任一組所述步驟2)酶切連接后的產(chǎn)物3μL,ddH2O補足至20μL;
所述預擴增的條件為:94℃預變性5min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 80s,30個循環(huán);72℃延伸5min。
6.根據(jù)權利要求1所述的構建方法,其特征在于,所述步驟3)中選擇性擴增的反應體系包括:3μL稀釋20倍后的預擴增產(chǎn)物,4μL 5×Buffer,4μL選擇性擴增的引物,0.3μL 10mM的dNTPs,0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase,ddH2O補足至20μL;
所述選擇性擴增的條件為:94℃預變性3min;首個循環(huán)擴增參數(shù)為94℃30s,65℃ 30s,72℃ 80s,將每個循環(huán)的退火溫度依次遞減0.7℃,共擴增13個循環(huán);94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 60s擴增25個循環(huán);72℃延伸5min。
7.根據(jù)權利要求1所述的構建方法,其特征在于,所述步驟5)的篩選過程中,將最小等位頻率<5%的低頻率位點和不存在多態(tài)性位點舍棄。