Cho細(xì)胞基因拷貝數(shù)的微滴數(shù)字pcr定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥領(lǐng)域，特別是設(shè)及CH0煙lineseHamsterOvary,中國倉鼠卵 巢細(xì)胞）細(xì)胞基因拷貝數(shù)的定量檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 微滴數(shù)字PCR，即化opletDigitalPCR(ddPCR)，可實(shí)現(xiàn)核酸分子的絕對(duì)定量。在 ddPCR實(shí)驗(yàn)中，PCR體系被平均分配到若干個(gè)均勻的油滴中，有的油滴不含目的基因片段， 有的油滴則含有一個(gè)或者多個(gè)目的基因片段。ddPCR-般使用巧光標(biāo)記的探針來檢測(cè)目的 基因片段的擴(kuò)增量，反應(yīng)體系類似于巧光定量PCR(qPCR)，即含有DNA聚合酶、dNTP、模板、 引物、巧光標(biāo)記的探針等。PCR體系被微滴化處理后，將進(jìn)行終點(diǎn)式PCR反應(yīng)。PCR完成后， 使用特定的微滴分析儀器檢測(cè)巧光陽性微滴和巧光陰性微滴的數(shù)目。根據(jù)陽性微滴的比 例，可使用泊松分布計(jì)算出樣品中目的基因的絕對(duì)拷貝數(shù)。
[0003] 作為第Ξ代PCR技術(shù)，ddPCR在拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因表達(dá)研究等領(lǐng)域有著 重要應(yīng)用。在進(jìn)行基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量時(shí)，ddPCR相對(duì)于qPCR有著更高的靈敏度和精確 度，并且不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線。然而，使用ddPCR檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中目的基因在染色體上 的絕對(duì)拷貝數(shù)時(shí)，仍需要選擇一個(gè)拷貝數(shù)已知的基因作為參照基因。另外，由于目的基因和 參照基因一般在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，兩者的引物和探針需要有足夠的特異性，不 能相互干擾。
[0004] 在ddPCR實(shí)驗(yàn)中，模板的上樣量至關(guān)重要。為了保證準(zhǔn)確的檢測(cè)，平均每個(gè)微滴中 目的基因的拷貝數(shù)不應(yīng)超過5個(gè)。另一方面，模板上樣量過低，也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)誤差過大。因 此，對(duì)于不同的樣品，需要對(duì)模板的上樣量進(jìn)行摸索。ddPCR實(shí)驗(yàn)的另外一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是模板 的酶切處理。如果兩個(gè)或者多個(gè)目的基因位于同一個(gè)DNA片段上（質(zhì)粒、染色體等），為了 達(dá)到精確的檢測(cè)，使用限制性內(nèi)切酶將目的基因分離開是必須的。限制性內(nèi)切酶的選擇需 要滿足W下幾個(gè)條件：（1)該酶能夠?qū)⑦B接在一起的目的基因分離開；(2)目的基因和參照 基因的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)不能含有該酶切位點(diǎn)；(3)該酶的活性不能受到DNA甲基化的影響。在 實(shí)際的檢測(cè)中，需要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的限制性內(nèi)切酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種C冊(cè)細(xì)胞基因拷貝數(shù)的微滴數(shù)字PCR定 量檢測(cè)方法，它可W提高基因拷貝數(shù)定量檢測(cè)的靈敏度和精確度。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的CK)細(xì)胞基因拷貝數(shù)的微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)方 法，步驟包括：
[0007] 1)提取C冊(cè)細(xì)胞基因組DNA;
[0008] 2)用限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟1)提取的基因組DNA進(jìn)行酶切處理；
[0009] 3)進(jìn)行微滴數(shù)字PCR反應(yīng)；
[0010] 4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定PCR反應(yīng)板每孔樣品的陽性微滴、陰性微滴數(shù)目，獲得C冊(cè) 細(xì)胞的基因拷貝數(shù)。
[0011]較佳的，上述步驟1)，使用DNeasyBlood&TissueKit提取基因組DNA。
[0012] 較佳的，上述步驟2)，限制性內(nèi)切酶使用Msel。 陽01引較佳的，步驟2)，酶切體系為：10X酶切緩沖液10μ1，限制性內(nèi)切酶25U，25ng/μ1的基因組DM2.5μg，補(bǔ)雙蒸水至100μ1。
[0014]較佳的，步驟3)，PCR反應(yīng)體系為：2XddPCRSuperMix12. 5μ1，90μΜ目的基因 正向引物0. 5μ1，90μΜ目的基因反向引物0. 5μ1，90μΜ參照基因正向引物0. 5μ1，90μΜ 參照基因反向引物0. 5μ1，100μΜ目的基因探針0. 05μ1，100μΜ參照基因探針0. 05μ1， 基因組模板2μ1，雙蒸水8. 4μ1，總體積25μ1。其中，所述目的基因包括重鏈基因和輕鏈 基因；所述重鏈基因的正向引物的序列如SEQIDNo. 12所示，反向引物的序列如SEQID No. 13所示，探針的序列如SEQIDNo. 14所示；所述輕鏈基因的正向引物的序列如SEQID No. 15所示，反向引物的序列如SEQIDNo. 16所示，探針的序列如SEQIDNo. 17所示；所 述參照基因?yàn)锽2M基因，該參照基因的正向引物的序列如SEQIDNo. 3所示，反向引物的序 列如SEQIDNo. 4所示，探針的序列如SEQIDNo. 5所示。
[0015]較佳的，步驟 3)，PCR反應(yīng)條件為：95°C，2min;94°(：，3〇3,60°(：，1111111，共40個(gè)循 環(huán)；98°C，lOmin。
[0016] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供用于上述Cffi)細(xì)胞基因拷貝數(shù)的微滴數(shù)字 PCR定量檢測(cè)方法的引物組。該引物組包括：重鏈基因的正向引物、重鏈基因的反向引物、 輕鏈基因的正向引物、輕鏈基因的反向引物、參照基因的正向引物、參照基因的反向引物； 所述重鏈基因的正向引物的序列如SEQIDNo. 12所示，反向引物的序列如SEQIDNo. 13 所示；所述輕鏈基因的正向引物的序列如SEQIDNo. 15所示，反向引物的序列如SEQID No. 16所示；所述參照基因的正向引物的序列如SEQIDNo. 3所示，反向引物的序列如SEQ IDNo. 4 所示。
[0017] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之Ξ是提供用于上述(?Ο細(xì)胞基因拷貝數(shù)的微滴數(shù)字 PCR定量檢測(cè)方法的探針組。該探針組包括重鏈基因的探針、輕鏈基因的探針和參照基因 的探針；所述重鏈基因的探針的序列如SEQIDNo. 14所示；所述輕鏈基因的探針的序列如 SEQIDNo. 17所示；所述參照基因的探針的序列如SEQIDNo. 5所示。
[0018] 本發(fā)明通過選擇合適的參照基因、設(shè)計(jì)合適的引物和巧光標(biāo)記探針、優(yōu)化(?0細(xì) 胞基因組模板上樣量、針對(duì)目的基因和參照基因的情況選擇合適的限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組 模板進(jìn)行酶切處理、評(píng)估不同的基因組提取試劑盒對(duì)ddPCR檢測(cè)結(jié)果的影響，實(shí)現(xiàn)了 (?0細(xì) 胞基因拷貝數(shù)的微滴數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)，并保證了檢測(cè)的靈敏度和精確度。
【附圖說明】
[0019] 圖1是不同基因組模板量對(duì)基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響。圖中基因拷貝數(shù)數(shù)值為 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)樣品重復(fù)兩次。
[0020] 圖2是不同酶切方式對(duì)基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響。圖中基因拷貝數(shù)數(shù)值為平均 值+標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)樣品重復(fù)兩次。
[0021] 圖3是質(zhì)粒設(shè)計(jì)示意圖。
[0022] 圖4是不同基因組提取試劑盒對(duì)基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響。圖中基因拷貝數(shù)數(shù) 值為平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)樣品重復(fù)兩次。試劑盒1為DNeasy Blood&Tissue Kit,試劑盒 2為血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒。 陽02引圖5是實(shí)施例1的C冊(cè)細(xì)胞基因拷貝數(shù)ddPCR定量檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本 發(fā)明詳述如下： 陽〇2引實(shí)施例1
[00%] -、基因拷貝數(shù)ddPCR檢測(cè)條件優(yōu)化
[0027] 1.基因組上樣量優(yōu)化 W28]待檢測(cè)細(xì)胞株名稱為A01，該細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)dsRFP基因。使用DNeasy Blood&Tissue Kit (QIAGEN，貨號(hào)：69506)提取基因組DNA，不進(jìn)行酶切處理，使用NonaDrop 2000燈hermo scientific)進(jìn)行定量，分別稀釋至25、12. 5、6. 25、3. 125和1. 5625ng/y 1， 然后各取2 μ 1，分別檢測(cè)目的基因dsRFP的拷貝數(shù)。
[0029] 目的基因拷貝數(shù)的ddPCR檢測(cè)步驟如下：
[0030] 1)配制PCR反應(yīng)體系
[0031] PCR反應(yīng)體系如下：2XddPCR SuperMix 12. 5 μ 1，90 μΜ目的基因正向引物 0. 5μ1，90μΜ目的基因反向引物0. 5μ1，90μΜ參照基因正向引物0. 5μ1，90μΜ參照基因 反向引物0. 5 μ 1，100 μΜ目的基因探針0. 05 μ 1，100 μΜ參照基因探針0. 05 μ 1，基因組模 板2 μ 1，雙蒸水8.4 μ 1，總體積25 μ 1。
[0032] 其中，目的基因dsRFP的引物和探針序列為：
[0033]正向引物：CTGGACATCACCTCCCACAAC (沈Q ID No. 1)
[0034]反向引物：CTCGGCGCGCTCGTACT (沈Q ID No. 2)
[0035]探針序列：CTCGGCGCGCTCGTACT (沈Q ID No. 2)
[0036] 內(nèi)參基因B2M的引物和探針序列為：
[0037]正向引物：TTGGGCCCTTGGTGCTT (沈Q ID No. 3)
[0038]反向引物：AAACCGAAAGTAGATGCTTGGAA (沈Q ID No. 4)
[0039]探針序列：CTTCCTTGTTGGCCCGCTGCC (沈Q ID No. 5) W40] 目的基因的探針用FAM/MGB進(jìn)行標(biāo)記，參照基因的探針用VIC/TAMRA進(jìn)行標(biāo)記。所 有的探針均在Invitrogen公司合成。
[0041] 2)微滴生成
[00創(chuàng)將配制完成的PCR體系，分裝至96孔PCR板中，每孔22 μ 1，注意加樣時(shí)需避免產(chǎn) 生氣泡。在封膜儀器上加好錫錐紙，注意標(biāo)記好96孔PCR板的方向，Α1孔的位置。使用離 屯、機(jī)將96孔PCR板的樣品，輕甩至板底，一般1000Xg，lmin即可。利用Bio-Rad自動(dòng)生成 微滴的儀器，獲得生成好的微滴樣品。將已經(jīng)生成微滴的樣品進(jìn)行封膜。 柳創(chuàng)3)PCR反應(yīng)
[0044] PCR體系在微滴化處理后，按照表1所示條件進(jìn)行PCR反應(yīng)： W45]表1 PCR反應(yīng)條件[0046]
[0047] 4)微滴分析
[0048] 待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔的PCR板放入QX200化opletreader0i〇-Rad)中。 點(diǎn)擊Set按鈕后，選擇CNVl模式，選擇Targetl作為目的基因檢測(cè)通道，Targets作為內(nèi)參 基因檢測(cè)通道。Supermix-欄，選擇ddPCRSupermixforProbes(no加TP)。對(duì)各個(gè)孔的 樣品進(jìn)行命名，命名結(jié)束后，需再次檢查確認(rèn)無誤。點(diǎn)擊Run按鈕，此時(shí)還需選擇好detect system, -般為FAM/VIC，之后進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)讀取，獲得每孔樣品的陽性微滴、陰性微滴數(shù) 目。 W例檢測(cè)結(jié)果參見圖1所示。從圖1中可W看出，20μ1樣品中基因組模板的上樣量 從50ng逐漸降低到3. 125ng時(shí)，檢測(cè)結(jié)果基本保持一致（在實(shí)際檢測(cè)中，為了保證準(zhǔn)確的 檢測(cè)，平均每個(gè)微滴中目的基因的拷貝數(shù)不應(yīng)超過5個(gè)；另一方面，模板上樣量過低，也會(huì) 造成實(shí)驗(yàn)誤差過大，因此需根據(jù)基因的拷貝數(shù)對(duì)上樣量進(jìn)行調(diào)整）。
[0050] 2.限制性內(nèi)切酶的選擇優(yōu)化
[0051] 待檢測(cè)細(xì)胞株名稱為A01和A02,兩個(gè)細(xì)胞株均穩(wěn)定表達(dá)dsRFP基因。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN，貨號(hào)：69506)提取基因組DNA，分別使用不同的酶度amHI、 BamHlAlindIII、MseI)進(jìn)行酶切處理。酶切體系中基因組DM的理論濃度為25ng/μ1。 陽05引其中， 陽化引單酶切的酶切體系為：1〇Χ酶切緩沖液1〇μ1，限制性內(nèi)切酶25U，基因組DNA 2. 5