專利名稱：基于梯狀回收的基因拷貝數(shù)鑒定和各拷貝序列獲得的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于梯狀回收的基因拷貝數(shù)鑒定和各拷貝序列獲得的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前判斷基因拷貝數(shù)的方法有Southern雜交、競爭性PCR、實時定量PCR，尤以Southern雜交和實時定量PCR使用廣泛。對于Southern雜交，該方法通過基因組酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交等步驟，可判斷拷貝數(shù)；對于競爭性PCR，該方法通過同時擴增目標(biāo)基因和參考基因、在瓊脂糖上比較兩者相對亮度，可判斷基因拷貝數(shù)；對于實時定量PCR，該方法通過監(jiān)測PCR過程中產(chǎn)物的實時變化，可判斷基因拷貝數(shù)。這三種方法僅能判斷基因拷貝數(shù)，但不能確定每個拷貝的核苷酸序列。同時，對于Southern雜交和實時定量PCR，實施起來復(fù)雜且成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種基于梯狀回收的基因拷貝數(shù)鑒定和各拷貝序列獲得的方法，是以較低的成本判斷基因拷貝數(shù)以及獲得每個拷貝的核苷酸序列。
本發(fā)明的技術(shù)方案是基因組DNA充分酶切→酶切產(chǎn)物電泳→梯狀回收→PCR擴增→判斷基因拷貝數(shù)→PCR產(chǎn)物克隆測序→獲得每個拷貝的核苷酸序列。
本發(fā)明可成功的判斷脫水素基因在無核白葡萄中的拷貝數(shù)，結(jié)果與Southern雜交結(jié)果相同，并且獲得了不同拷貝脫水素基因的部分核苷酸序列。
具體實施例方式
本發(fā)明的具體操作步驟如下a.基因組DNA充分酶切a.1將10-20μg基因組DNA用限制性內(nèi)切酶充分酶切；b.酶切產(chǎn)物電泳b.1將酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳b.1.1使用標(biāo)準(zhǔn)的TAE電泳緩沖液b.1.2瓊脂糖濃度為0.8％-1.0％b.1.3電泳電壓為1.0V/cm-1.5V/cmb.1.4電泳時間為10h-14hb.2不同拷貝將在泳道上被分開；c.梯狀回收c.1將膠條切下，其寬度比點樣孔左右各寬1mm-2mmc.2將膠條沿泳道垂直方向切成寬度為2.0mm-2.5mm的膠塊c.3分別回收每個膠塊里的酶切DNAc.4這樣不同的拷貝就被回收進(jìn)不同的樣品中c.5膠條切割后呈梯狀；d.PCR擴增
d.1用基因特異性引物對所回收樣品PCR擴增；e.判斷基因拷貝數(shù)e.1將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳e.1.1使用標(biāo)準(zhǔn)的TAE電泳緩沖液e.1.2瓊脂糖濃度為1.0％-1.5％e.1.3電泳電壓為4V/cm-6V/cme.2待電泳合適時用凝膠成像儀照相e.3含有目標(biāo)基因的樣品PCR將呈陽性e.4基此便可判斷拷貝數(shù)量；f.PCR產(chǎn)物克隆測序；g.獲得每個拷貝的核苷酸序列。
有時不同拷貝因為電泳后彼此距離較近以至于不能通過梯狀回收將不同拷貝回收到不同的膠塊中，可通過以下措施嘗試解決在瓊脂糖凝膠上電泳分離更長的時間；更換限制性內(nèi)切酶；減少PCR循環(huán)數(shù)。
使用本發(fā)明需注意兩點一是在連續(xù)切膠時務(wù)必防止膠塊之間的交叉污染，在切膠寬度為2.5mm時，每個拷貝可能被回收進(jìn)連續(xù)的2-3塊膠里，故PCR時若連續(xù)的2-3個樣品均為陽性時，應(yīng)視為一個拷貝；二是用于PCR的引物應(yīng)該位于所檢測基因的保守區(qū)域，特別是引物3’端所對應(yīng)的區(qū)域應(yīng)是100％保守。
本發(fā)明可用于判斷內(nèi)源和外源基因的拷貝數(shù)，其原理及操作簡單，成本低廉，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.基于梯狀回收的基因拷貝數(shù)鑒定和各拷貝序列獲得的方法，其特征是采取如下技術(shù)方案基因組DNA充分酶切→酶切產(chǎn)物電泳→梯狀回收→PCR擴增→判斷基因拷貝數(shù)→PCR產(chǎn)物克隆測序→獲得每個拷貝的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于梯狀回收的基因拷貝數(shù)鑒定和各拷貝序列獲得的方法，其特征是具體操作步驟如下2.a基因組DNA充分酶切2.a.1將10-20μg基因組DNA用限制性內(nèi)切酶充分酶切；2.b酶切產(chǎn)物電泳2.b.1將酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳2.b.1.1使用標(biāo)準(zhǔn)的TAE電泳緩沖液2.b.1.2瓊脂糖濃度為0.8％-1.0％2.b.1.3電泳電壓為1.0V/cm-1.5V/cm2.b.1.4電泳時間為10h-14h2.b.2不同拷貝將在泳道上被分開；2.c梯狀回收2.c.1將膠條切下，其寬度比點樣孔左右各寬1mm-2mm2.c.2將膠條沿泳道垂直方向切成寬度為2.0mm-2.5mm的膠塊2.c.3分別回收每個膠塊里的酶切DNA2.c.4這樣不同的拷貝就被回收進(jìn)不同的樣品中2.c.5膠條切割后呈梯狀；2.d PCR擴增2.d.1用基因特異性引物對所回收樣品PCR擴增；2.e判斷基因拷貝數(shù)2.e.1將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳2.e.1.1使用標(biāo)準(zhǔn)的TAE電泳緩沖液2.e.1.2瓊脂糖濃度為1.0％-1.5％2.e.1.3電泳電壓為4V/cm-6V/cm2.e.2待電泳合適時用凝膠成像儀照相2.e.3含有目標(biāo)基因的樣品PCR將呈陽性2.e.4基此便可判斷拷貝數(shù)量；2.f PCR產(chǎn)物克隆測序；2.g獲得每個拷貝的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于梯狀回收的基因拷貝數(shù)鑒定和各拷貝序列獲得的方法，克服了目前判斷基因拷貝數(shù)所采用的Southern雜交、競爭性PCR、實時定量PCR均不能確定每個拷貝的核苷酸序列的缺陷。其技術(shù)方案是基因組DNA充分酶切→酶切產(chǎn)物電泳→梯狀回收→PCR擴增→判斷基因拷貝數(shù)→PCR產(chǎn)物克隆測序→獲得每個拷貝的核苷酸序列。本發(fā)明可成功的判斷脫水素基因在無核白葡萄中的拷貝數(shù)，結(jié)果與Southern雜交結(jié)果相同，并且獲得了不同拷貝脫水素基因的部分核苷酸序列?？捎糜谂袛鄡?nèi)源和外源基因的拷貝數(shù)，是以較低的成本判斷基因拷貝數(shù)以及獲得每個拷貝的核苷酸序列。其原理及操作簡單，成本低廉，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101024851SQ200710017579
公開日2007年8月29日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者王躍進(jìn), 吳康, 楊亞州, 郭翠英 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)