專利名稱：一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體屬于用分子生物學方法獲得的基因工程生物制品，可針對性的用于雞的各種病毒性疾病的防制和早期治療。
三，
背景技術：
雞α干擾素(Interferonalpha，IFN-α)是一類具有抗病毒、抗腫瘤、抗增殖作用等功能。1994年，Sekellick等首先克隆得到雞胚成纖維細胞IFN-基α因，并進行了結構分析。1996年Sick等，Scultz等對雞α干擾素進行了克隆與表達，并對表達產(chǎn)物進行了抗病毒活性進行了研究。研究表明雞α干擾素是無內含子的多拷貝基因，編碼162個氨基酸的成熟蛋白，有4個糖基化位點，推測其大小為19000Da。現(xiàn)已證明重組雞α干擾素對新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)等都有抵抗作用。2001年華南農(nóng)業(yè)大學的曹永長等對雞的α干擾素基因進行了克隆，2000年夏春對惠陽胡須雞IFN-α基因克隆和序列分析，2000年汪明、吳志光等對肉雞IFN-alpha基因進行了克隆、序列分析以及在大腸桿菌中的表達發(fā)現(xiàn)有較好的抗病毒活性。目前國內還沒有商品化的重組雞α干擾素用于雞群病毒性疾病的防制。
由誘生劑誘導產(chǎn)生雞IFN-α，因來源少、成本高、純化工藝復雜等諸多限制而價格昂貴，極大限制了臨床和科研的應用。原核表達存在著表達蛋白的產(chǎn)量低，不易于純化以及菌株不穩(wěn)定等問題，限制了向規(guī)?；a(chǎn)的轉化。而且大腸桿菌表達的雞干擾素主要以包涵體的形式存在，包涵體在變性、復性上對人員技術及設備的要求都很高，且工序繁瑣，損失得較多，這些增加了重組雞干擾素工業(yè)產(chǎn)品的成本及生產(chǎn)難度。
三 發(fā)明內容技術問題 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中由誘生劑誘導產(chǎn)生雞IFN-α的來源少、成本高、純化工藝復雜等諸多限制臨床和科研應用的缺陷，提供一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體，達到高表達、高穩(wěn)定、高分泌的生產(chǎn)，使得其基因表達的外源蛋白的純度達到70％以上，可廣泛用于包括禽流感在內的雞的各種病毒性疾病的防制和早期治療，以及增強雞群的整體免疫力。
技術問題 一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法，包括(一)重組到畢赤酵母上的雞α干擾素的基因序列的擴增A)引物的設計引物15‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3引物25‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3B)雞全血淋巴細胞總RNA的提取取500μL培養(yǎng)以ConA刺激4～10h的雞全血分離的淋巴細胞的懸液，向其中加入800μL Tripure細胞裂解液，振蕩混勻后，置于室溫下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混勻后于室溫下靜置5min分鐘，再于12000g 4℃下離心15min；吸取上清，向其中加入0.5倍體積的異丙醇，充分混勻后于室溫下靜置15min，隨后在12000g 4℃下離心10min；排盡管內液體，向管內加入1mL70％乙醇進行洗滌，混勻后，7500g 4℃離心5min；棄去液體，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC處理的超純水溶解，即得到雞淋巴細胞總RNA；C)含有雞α干擾素基因序列cDNA第一條鏈的合成用新鮮提取的淋巴細胞的總RNA進行RT-PCR，具體加樣如下細胞總RNA 9.2μL5×反轉錄Buffer 4.0μL10mM dNTP 2.0μL25mM MgCI20.8μLRnasin 1.0μL引物1 1.0μL引物2 1.0μL將上述反應混合物于掌式離心機上稍作離心，然后于在PCR儀；上65℃15min后加入反轉錄酶M-MLV1.0μL，后42℃1h，94℃5min后結束反應；D)PCR反應體系如下ddH2O 34μL10×PCR Buffer 4.0μL25mmol/L Mg2+1.4μLRT產(chǎn)物 10μLrTaq0.6μL總體積 50μL在PCR儀上設置94℃5min，隨后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)，結束循環(huán)后72℃10min；對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞α干擾素基因大小為488bp；(二)含有雞α干擾素成熟蛋白基因酵母表達載體的構建與鑒定利用通過RT-PCR擴增的雞α干擾素成熟蛋白基因有ECORI和XbaI兩個酶切位點，把雞α干擾素成熟蛋白基因切下后與已經(jīng)同樣兩種限制性內切酶酶切的pPICZa-A酵母載體相連，再經(jīng)ECORI和XbaI酶切，切下大小為488bp的條帶則可以鑒定為陽性；(三)感受態(tài)酵母菌的制備挑取畢赤酵母X-33平板上的一個單菌落轉接于2mlYPD試管中，28℃250rpm恒溫搖過夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液轉接于50ml的含有無菌5mlYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28℃恒溫搖床250rpm搖蕩培養(yǎng)20h左右。待菌液OD600＝1.3-1.5時，4℃1500g離心4min收獲細胞。細胞依次用1000ml冰預冷水和1000ml冰預冷的1M山梨醇洗滌，4℃1500g離心5min，最后用0.8ml冰預冷的1M山梨醇懸浮菌體，分裝不同的ep管后，置4℃待用；(四)含有雞α干擾素成熟蛋白基因的酵母表達載體電轉化入酵母菌1)取SacI酶線性化重組載體10ul分別與80ul X-33感受態(tài)畢赤酵母細胞混勻，然后轉移到冰預冷的0.2cm的電轉移杯中，冰上放置5min；2)將電轉移杯放在電穿孔儀上用脈沖電流電擊一次，電擊條件電壓1500V，電容25uF，電阻200Ω，時間5ms，溫度0℃；3)電擊結束，立即加入1ml冰預冷的1M山梨醇，混勻，取250ul轉化物涂含有100ug/mlZeocin抗生素的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28℃恒溫培養(yǎng)2-4天，能在YPDS培養(yǎng)基上生長的菌落為陽性轉化子；(五)用來鑒定陽性重組酵母菌的鑒定的PCR引物根據(jù)酵母表達載體pPICZa-A上的一部分基因序列分別在目的基因插入的兩端設計一對引物，它們分別為5′AOX1引物5‘gactggttccaattgagaagc’33′AOX1引物5‘gcaaatggcattctgacatcc’3(六)含雞α干擾素基因的重組酵母菌株的鑒定將篩選得到的重組高拷貝菌株，取單菌落中少量菌放入Eppendof管中，加100ul的滅菌水，100℃煮10分鐘，消解酵母菌細胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，100℃煮10分鐘，120000rpm/min離心取上清液，以其中少量基因組DNA作模板，進行PCR；(七)PCR擴增鑒定以基因組DNA為模板，對整合到畢赤酵母X-33染色體DNA中的雞α干擾素成熟蛋白基因進行PCR擴增，PCR擴增體系為10×PCRbuffer 5ul20pmol/ul 5′AOX1引物 0.5ul20pmol/ul 3′AOX1引物 0.5ulTaq酶 0.5ul10mM dNTPs 1ul基因組DNA模板 5ul滅菌水補體積至50ul擴增程序94℃5mi，94℃1min、55℃1.5min、72℃2.5min、30個循環(huán)，72℃7min，擴增結束，取5ul反應液做瓊脂糖凝膠電泳觀察陽性重組酵母表達菌株通過以上的一對引物擴增的片段總長度為1068bp左右；(八)含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的篩選將YPDS培養(yǎng)基平皿中長出的最初轉化子，影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000ug/ml的YPDS培養(yǎng)基中，逐級篩選Zeocin抗性菌株即含目的基因的高拷貝菌株；(九)含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的誘導表達從含有高拷貝目的基因的酵母菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株與25ml的BMGY中，經(jīng)28℃搖床培養(yǎng)至OD600＝2-6時，室溫1500g離心5min收獲細胞，將收獲的細胞用100ml的BMMY培養(yǎng)液懸浮與1000mld的三角瓶中28℃誘導表達，每24h向培養(yǎng)基中補加0.5％的甲醇，以保持誘導的持續(xù)表達，在誘導72h時收集培養(yǎng)上清備用；(十)含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的表達產(chǎn)物的初步純化培養(yǎng)上清的處理將誘導表達培養(yǎng)液離心，收集上清液留樣后，用50mM含1mMPMSF的Tris-HCl緩沖液溶解，裝入透析袋用50mM的Tris-HCl透析除去雜質，然后用PEG20000濃縮獲得雞α干擾素成熟蛋白。
上述重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法所構建的重組載體，為含有雞α干擾素成熟蛋白基因酵母表達載體。
本發(fā)明雞α干擾素成熟蛋白的基因序列及氨基酸序列(附錄)為去掉了全閱讀框的信號肽序列后的堿基到閱讀框后的序列。信號肽序列去掉后，雞α干擾素的分泌主要靠酵母表達載體上的分泌信號。而且去除了閱讀框后的終止密碼子，為了能和酵母載體上的序列相對應在原終止密碼子的位置上另外添加了兩個堿基，這樣保持了雞α干擾素的基因序列能正確的被翻譯出相應的蛋白質，這樣還可以是載體上的一個組氨酸的序列能被正確的翻譯，便于純化重組雞α干擾素。
本發(fā)明所用巴氏德畢赤酵母表達系統(tǒng)即巴氏德畢赤酵母X-33單菌已被國內外廣泛用來表達外源蛋白質的一種公知菌株(齊連權，人ω干擾素在巴士德畢赤酵母中的表達，2003年軍事醫(yī)學科學院院刊Cereghino等，Heterogous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastris)它能能利用甲醇作為唯一碳源大量合成蛋白質，主要有以下幾個生物特性a利用甲醇作為唯一碳源快速生長。B，畢赤酵母中存在許多微體細胞器，它們可以大量儲存蛋白質，該特點對表達外源蛋白質非常有利，可以使其面受蛋白酶的降解。C可以對表達的外源蛋白進行適度的糖基化等修飾，使外源蛋白能夠最大程度上保持其天然結構。
利用巴氏德畢赤酵母表達載體表達外源蛋白的優(yōu)點a，高表達含有醇氧化酶的強啟動子，細胞生長速度快，能夠較高的表達外源蛋白。B高穩(wěn)定該載體不是以自主復制的形式存在而是整合在酵母菌的染色體上，所以構建的重組菌株很穩(wěn)定。C高分泌1995年Romanos M.等報道含有α交配因子的分泌和先導序列，可以使外源蛋白分泌到培養(yǎng)上清，而且表達的外源蛋白的純度達到75％以上。
本發(fā)明將雞α干擾素的基因序列通過電轉化方式整合到酵母上的特定位置。這株重組菌表達的干擾素經(jīng)抗病毒活性測定具有很高的抗病毒活性和增強雞群整體抵抗力的作用。采用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達外源基因，酵母本身蛋白分泌到上清中的很少，這樣就增加了所表達外源蛋白的純度，一般純度高于75％。
畢赤氏酵母基因工程菌表達的雞α干擾素被分泌到培養(yǎng)基中，純度較高，且其在轉錄后可以受到一些真核修飾如糖基化、適當剪切與折疊等，因此最大程度上保證了天然蛋白結構和生物活性的發(fā)揮。雞α干擾素的抗病毒活性以及抗腫瘤、抗增殖的功能國內外均有報道，只是雞α干擾素的獲得比較困難，起初，人們是通過干擾素誘生劑來誘導雞體細胞來獲得干擾素，但是這種方法獲得的干擾素量很少，且一些誘生劑的運用對動物機體有許多不利的方面。而重組大腸桿菌表達的雞α干擾素產(chǎn)量低，其生產(chǎn)工序煩瑣，生產(chǎn)成本高。而本研究采用的畢赤氏酵母基因工程菌生產(chǎn)的雞α干擾素只需收集表達的上清進行透析除鹽處理后即可投入臨床使用，且酵母不會分泌向大腸桿菌那樣對雞體細胞有毒害的一些內毒素。因此重組酵母雞α干擾素的純度在70％以上便可以保證對雞群的使用。
3有益效果而研究采用的畢赤氏酵母基因工程菌生產(chǎn)的雞α干擾素與傳統(tǒng)的用誘導劑生產(chǎn)的雞α干擾素和用大腸桿菌表達的α干擾素相比有以下幾個優(yōu)點A獲得具有生物活性的重組雞α干擾素方法和程序都簡單只需收集表達的上清進行透析除鹽處理后即可投入臨床使用。
B無毒害物質酵母不會分泌向大腸桿菌表達的外源蛋白那樣附帶一些對雞體細胞有毒害的毒素。
C純度高酵母表達的雞α干擾素的SDS-PAGE結果經(jīng)薄層掃描顯示，重組酵母雞α干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的75％。
D廣譜抗病毒作用現(xiàn)國外資料表明雞干擾素對雞的各種病毒性疾病的病毒(勞氏肉瘤病毒等等)均有較好的抑制作用，尤其對一些烈性傳染性病毒性疾病如禽流感、新城疫、馬立克氏病、法氏囊病的早期治療和防制有很好的作用，能在很大程度上遏制各種雞傳染性的病毒性疾病的流行和爆發(fā)。
E抗病毒作用強本研究中研制的含有酵母雞α干擾素的培養(yǎng)基經(jīng)過65636倍稀釋發(fā)現(xiàn)能完全抑制100-1000TCID50的水皰性口炎病毒(VSV)的攻擊；256倍稀釋后可以完全抑制1000TCID50的新城疫病毒的增殖；64倍稀釋后能完全抑制1000TCID50的MDV的增殖。而雞干擾素抑制禽流感病毒的能力與抑制水皰性口炎病毒的能力是相當?shù)?，因此重組酵母雞α干擾素對禽流感病毒也必將有很高的抑制力。
F重組酵母菌表達的雞α干擾素的臨床使用效果好重組酵母菌表達的雞α干擾素在山東濰坊進行的初步小規(guī)模的臨床實驗表明10-90U的重組雞α干擾素對發(fā)生新城疫及傳支混合感染的雞群有明顯的治療作用，采用注射，口服，滴鼻、滴眼等不同的給予重組雞α干擾素，其中采用注射方式給予途徑的雞群病情好轉的最快，治愈率達到85％左右。
G有強大的免疫調節(jié)作用 醫(yī)學臨床把干擾素用于SARS、肝炎以及各種病毒性疾病治療和預防的成功例子為重組雞α干擾素用于雞群各種病毒性疾病的治療和防制提供了可靠的依據(jù)。近年我國雞群因爆發(fā)的流行性的病毒性疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的損失數(shù)以億計，而且諸如禽流感等病毒性傳染病的局部地區(qū)的流行給養(yǎng)雞業(yè)和人群的安全帶來很大的威脅，這種損失是難以用金錢來衡量的。重組酵母雞α干擾素的研制成功以及它所具有的一些列的便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點，必將給我國雞病毒性疾病的防制帶來新的局面。
四

圖1雞α干擾素成熟蛋白基因PCR產(chǎn)物電泳分析1，DNA分子量標準；2 陰性對照；3 PCR產(chǎn)物圖2PICZa-A-chIFNα陽性克隆載體的酶切鑒定1，2000DNA分子量標準；2，3 ECORI和PSTI酶切的重組表達載體圖3轉化酵母的PCR鑒定1，陰性對照；2，未重組上的酵母3，2000DNA分子量標準；4，，，陽性重組酵母圖4陽性對照孔中的水皰性口炎病毒的嚴重病變圖5干擾素稀釋濃度高于48處理的雞胚成纖維細胞圖6陰性對照孔中的雞胚成纖維細胞圖7陽性對照孔中的NDV的嚴重病變圖8干擾素稀釋濃度為4-4處理的雞胚成纖維細胞圖9陰性對照孔中的雞胚成纖維細胞圖10陽性對照孔中的MDV的嚴重病變圖11干擾素稀釋濃度為4-3處理的雞胚成纖維細胞圖12陰性對照孔中的雞胚成纖維細胞五具體實施方式
1重組到畢赤酵母上的雞α干擾素的基因序列的擴增A引物的設計引物15‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3引物25‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3B雞全血淋巴細胞總RNA的提取取500μL培養(yǎng)以ConA刺激的不同時間段(4、5、6、7、8、9、10h)的雞全血分離的淋巴細胞的懸液，向其中加入800μL Tripure細胞裂解液，振蕩混勻后，置于室溫下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混勻后于室溫下靜置5min分鐘，再于12000g 4℃下離心15min。吸取上清，向其中加入0.5倍體積的異丙醇，充分混勻后于室溫下靜置15min，隨后在12000g4℃下離心10min。排盡管內液體，向管內加入1mL70％乙醇進行洗滌，混勻后，7500g4℃離心5min。棄去液體，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC處理的超純水溶解，即得到雞淋巴細胞總RNA。
C含有雞α干擾素基因序列cDNA第一條鏈的合成用新鮮提取的淋巴細胞的總RNA進行RT-PCR，具體加樣如下細胞總RNA9.2μL
5×反轉錄Buffer4.0μL10mM dNTP 2.0μL25mM MgCI20.8μLRnasin 1.0μL引物1 1.0μL引物2 1.0μL將上述反應混合物于掌式離心機上稍作離心，然后于在PCR儀(Ampgene公司)上65℃15min后加入反轉錄酶M-MLV1.0μL(總體系為20μL)，后42℃1h，94℃5min后結束反應。
D PCR反應體系如下ddH2O 34μL10×PCR Buffer 4.0μL25mmol/L Mg2+1.4μLRT產(chǎn)物 10μLrTaq 0.6μL總體積 50μL在PCR儀(Ampgene公司)上設置94℃5min，隨后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)，結束循環(huán)后72℃10min。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞α干擾素基因大小為488bp，見圖1。
2含有雞α干擾素成熟蛋白基因酵母表達載體的構建與鑒定利用通過RT-PCR擴增的雞α干擾素成熟蛋白基因有ECORI和XbaI兩個酶切位點，把雞α干擾素成熟蛋白基因切下后與已經(jīng)同樣兩種限制性內切酶酶切的pPICZa-A酵母載體相連，再經(jīng)ECORI和XbaI酶切，如能切下大小為488bp的條帶則可以鑒定為陽性，見圖2。
3感受態(tài)酵母菌的制備挑取畢赤酵母X-33平板上的一個單菌落轉接于2mlYPD試管中，28℃250rpm恒溫搖過夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液轉接于50ml的含有無菌5mlYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28℃恒溫搖床250rpm搖蕩培養(yǎng)20h左右。待菌液OD600＝1.3-1.5時，4℃1500g離心4min收獲細胞。細胞依次用1000ml冰預冷水和1000ml冰預冷的1M山梨醇洗滌，4℃1500g離心5min，最后用0.8ml冰預冷的1M山梨醇懸浮菌體，分裝不同的ep管后，置4℃待用。
4含有雞α干擾素成熟蛋白基因的酵母表達載體電轉化入酵母菌1)取BstXI酶線性化重組載體10ul(10ug)分別與80ul X-33感受態(tài)畢赤酵母細胞混勻，然后轉移到冰預冷的0.2cm的電轉移杯中，冰上放置5min。
2)將電轉移杯放在電穿孔儀上用脈沖電流電擊一次，電擊條件電壓1500V，電容25uF，電阻200Ω，時間5ms，溫度0℃。
3)電擊結束，立即加入1ml冰預冷的1M山梨醇，混勻，取250ul轉化物涂含有100ug/mlZeocin抗生素的YPDS(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，1M山梨醇)培養(yǎng)基平皿上，置28℃恒溫培養(yǎng)2-4天，能在YPDS培養(yǎng)基上生長的菌落為陽性轉化子。
5用來鑒定陽性重組酵母菌的鑒定的PCR引物根據(jù)酵母表達載體pPICZa-A上的一部分基因序列分別在目的基因插入的兩端設計一對引物，它們分別為5′AOX1引物5‘gactggttccaattgagaagc’33′AOX1引物5‘gcaaatggcattctgacatcc’36含雞α干擾素基因的重組酵母菌株的鑒定將篩選得到的重組高拷貝菌株，取單菌落中少量菌放入Eppendof管中，加100ul的滅菌水，100℃煮10分鐘，消解酵母菌細胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，100℃煮10分鐘，12000rpm/min離心取上清液，以其中少量基因組DNA作模板，進行PCR。
7PCR擴增鑒定以基因組DNA為模板，對整合到畢赤酵母X-33染色體DNA中的雞α干擾素成熟蛋白基因進行PCR擴增，PCR擴增體系為10×PCRbuffer 5ul5′AOX1引物(20pmol/ul) 0.5ul3′AOX1引物(20pmol/ul) 0.5ulTaq酶 0.5uldNTPs(10mM) 1ul模板(基因組DNA) 5ul滅菌水補體積至50ul擴增程序94℃5mi，94℃1min、55℃1.5min、72℃2.5min、30個循環(huán)，72℃7min。擴增結束，取5ul反應液做瓊脂糖凝膠電泳觀察未重組任何目的基因的PPICZa-A酵母的染色體通過以上一對引物可擴增出大小為580bp左右的片段，如果是陽性重組酵母表達菌株通過以上的一對引物擴增的片段應包含雞α干擾素成熟蛋白基因(約488bp)，那么總長度應為1068bp左右。見圖3。
8含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的篩選將YPDS培養(yǎng)基平皿中長出的最初轉化子，影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000ug/ml的YPDS培養(yǎng)基中，逐級篩選Zeocin抗性菌株即含目的基因的高拷貝菌株。
9含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的誘導表達從含有高拷貝目的基因的酵母菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株與25ml的BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甘油、100mM磷酸鉀緩沖液，PH6.0)中，經(jīng)28℃搖床培養(yǎng)至OD600＝2-6時，室溫1500g離心5min收獲細胞，將收獲的細胞用100ml的BMMY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、4×10-5％生物素、0.5％甲醇、100mM磷酸鉀緩沖液，PH6.0)培養(yǎng)液懸浮與1000mld的三角瓶中28℃誘導表達，每24h向培養(yǎng)基中補加0.5％的甲醇，以保持誘導的持續(xù)表達。在誘導72h時收集培養(yǎng)上清備用。
10含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的表達產(chǎn)物的初步純化培養(yǎng)上清的處理將誘導表達培養(yǎng)液離心，收集上清液留樣后，用50mM的Tris-HCl(含1mMPMSF)緩沖液溶解，裝入透析袋用50mM的Tris-HCl透析除去一些雜質，獲得用PEG20000濃縮獲得α干擾素蛋白。
上述重組酵母雞α干擾素的SDS-PAGE結果經(jīng)薄層掃描顯示，重組酵母雞γ干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的75％，即純度達到了70％以上。
同時通過不同時段取樣的電泳分析，發(fā)現(xiàn)在誘導了72h時的上清濃縮10倍后的電泳圖上在14千道爾頓與20千道爾頓之間有一條大約16千道爾頓的明顯的蛋白電泳條帶。
11酵母表達的雞α干擾素的生物活性的測定取孵化9-10d的SPF雞胚，去頭、四肢及內臟，無菌狀態(tài)下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成單個細胞后上96孔板，生長約12h使細胞全部貼壁生長后，去除生長液，每孔加入4倍倍比稀釋的干擾素，用1000TCID50的劑量的口泡炎病毒(VSV)進行攻毒，細胞對照則加無病毒的營養(yǎng)液，同時設立陰性對照(只加41稀釋的干擾素，不加病毒)、陽性對照(不加干擾素，只加病毒)，空白對照(不加干擾素，不加病毒)，在倒置顯微鏡下觀察待對照孔出現(xiàn)50％以上病變的時候，在倒置顯微鏡下觀察待對照孔出現(xiàn)50％以上病變的時候，判斷結果。
A重組酵母菌表達的雞α干擾素抗水皰性口炎病毒的結果24小時后觀察可見陽性對照孔完全出現(xiàn)100％嚴重病變(圖4)，而酵母表達的干擾素進行410，49，48稀釋后所加入的細胞孔分別有70％，40％，0％的病變，在加入高于4-8濃度干擾素的細胞孔，細胞狀態(tài)良好(圖5)。陰性對照孔中是正常的雞胚成纖維細胞(圖6)。從上述結果得出重組酵母雞α干擾素的生物學活性為48U/ml。
B重組酵母表達的雞α干擾素抗MDV和NDV的結果接MDV毒后，大約2天陽性對照孔開始出現(xiàn)病變，到第四天，陽性對照孔已出現(xiàn)完全病變見圖7，而在44稀釋的重組雞α干擾素孔中細胞沒有任何病變圖8。陰性對照孔中細胞正常圖9。
接NDV病毒后，大約50h天陽性對照孔開始出現(xiàn)病變，到第72-96h，陽性對照孔已出現(xiàn)明顯病變見圖10，而在43稀釋的重組雞α干擾素孔中細胞沒有任何病變圖11。陰性對照孔中細胞正常圖12。
根據(jù)以上實驗可以說明重組酵母雞α干擾素已被成功研制出來，其256倍稀釋便可完全抑制住1000 TCID50水皰性口炎病毒的增殖。陰性對照孔中的細胞生長良好，說明酵母干擾素上清對雞體細胞沒有明顯毒害。而且重組酵母雞α干擾素對MDV和NDV等都具有較強的抑制能力。
12重組酵母菌表達的雞α干擾素的臨床使用效果重組酵母菌表達的雞α干擾素在山東濰坊進行的小規(guī)模(50只雞)應用，結果表明10-50U的重組雞α干擾素對發(fā)生新城疫、傳支及大腸桿菌混合感染的雞群有明顯的輔助治療作用，采用注射，口服，滴鼻、滴眼等不同的給予重組雞γ干擾素，發(fā)病雞群病情明顯好轉，其中以注射方式給予途徑的雞群，在給予重組酵母菌干擾素后的20-96小時，雞群病情改善最快，且采食量恢復正常，逐漸恢復健康，治愈率達到85％；而對照組雞群仍維持病狀，食欲不振、精神萎靡、對照組雞群體重在4天內平均下降了20％，死亡率達到了30％。
附錄雞α干擾素成熟蛋白的基因序列及氨基酸序列TGC AAC CAC CTT CGC CCC CAG GAT GCC ACC TTC TCT CAC GAC AGC CTC CAGC N H L R P Q D A T F S H D S L QCTC CTC CGG GAC ATG GCT CCC ACA CTA CCC CAG CTG TGC CCA CAG CAC AACL L R D M A P T L P Q L C P Q H NGCG TCT TGC TCC TTC AAC GAC ACC ATC CTG GAC ACC AGC AAC ACC CGG CAAA S C S F N D T I L D T S N T R QGCC GAC AAA ACC ACC CAC GAC ATC CTT CAG CAC CTC TTC AAA ATC CTC AGCA D K T T H D I L Q H L F K I L SAGC CCC AGC ACT CCA GCC CAC TGG AAC GAC AGC CAA CGC CAA AGC CTC CTCS P S T P A H W N D S Q R Q S L LAAC CGG ATC CAC CGC TAC ACC CAG CAC CTC GAG CAA TGC TTG GAC AGC AGCN R I H R Y T Q H L E Q C L D S SGAC ACG CGC TCC CGG ACG CGA TGG CCT CGC AAC CTT CAC CTC ACC ATC AAAD T R S R T R W P R N L H L T I KAAA CAC TTC AGC TGC CTC CAC ACC TTC CTC CAA GAC AAC GAT TAC AGC GCCK H F S C L H T F L Q D N D Y S ATGC GCC TGG GAA CAC GTC CGC CTG CAA GCT CGT GCC TGG TTC CTG CAC ATCC A W E H V R L Q A R A W F L H ICAC AAC CTC ACA GGC AAC ACG CGC ACTH N L T G N T R T
權利要求
1.一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法，包括(一)重組到畢赤酵母上的雞α干擾素的基因序列的擴增A)引物的設計引物15‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3引物25‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3B)雞全血淋巴細胞總RNA的提取取500μL培養(yǎng)以ConA刺激4～10h的雞全血分離的淋巴細胞的懸液，向其中加入800μL Tripure細胞裂解液，振蕩混勻后，置于室溫下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混勻后于室溫下靜置5min分鐘，再于12000g 4℃下離心15min；吸取上清，向其中加入0.5倍體積的異丙醇，充分混勻后于室溫下靜置15min，隨后在12000g 4℃下離心10min；排盡管內液體，向管內加入1mL70％乙醇進行洗滌，混勻后，7500g 4℃離心5min；棄去液體，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC處理的超純水溶解，即得到雞淋巴細胞總RNA；C)含有雞α干擾素基因序列cDNA第一條鏈的合成用新鮮提取的淋巴細胞的總RNA進行RT-PCR，具體加樣如下細胞總RNA 9.2μL5×反轉錄Buffer 4.0μL10mM dNTP 2.0μL25mM MgCI20.8μLRnasin 1.0μL引物1 1.0μL引物2 1.0μL將上述反應混合物于掌式離心機上稍作離心，然后于在PCR儀；上65℃ 15min后加入反轉錄酶M-MLV1.0μL，后42℃ 1h，94℃ 5min后結束反應；D)PCR反應體系如下ddH2O 34μL10×PCR Buffer 4.0μL25mmol/L Mg2+1.4μLRT產(chǎn)物 10μLrTaq0.6μL總體積 50μL在PCR儀上設置94℃ 5min，隨后94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，共30個循環(huán)，結束循環(huán)后72℃ 10min；對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞α干擾素基因大小為488bp；(二)含有雞α干擾素成熟蛋白基因酵母表達載體的構建與鑒定利用通過RT-PCR擴增的雞α干擾素成熟蛋白基因有ECOR I和XbaI兩個酶切位點，把雞α干擾素成熟蛋白基因切下后與已經(jīng)同樣兩種限制性內切酶酶切的pPICZa-A酵母載體相連，再經(jīng)ECOR I和XbaI酶切，切下大小為488bp的條帶則可以鑒定為陽性；(三)感受態(tài)酵母菌的制備挑取畢赤酵母X-33平板上的一個單菌落轉接于2mlYPD試管中，28℃250rpm恒溫搖過夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液轉接于50ml的含有無菌5mlYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28℃恒溫搖床250rpm搖蕩培養(yǎng)20h左右。待菌液OD600＝1.3-1.5時，4℃1500g離心4min收獲細胞。細胞依次用1000ml冰預冷水和1000ml冰預冷的1M山梨醇洗滌，4℃1500g離心5min，最后用0.8ml冰預冷的1M山梨醇懸浮菌體，分裝不同的ep管后，置4℃待用；(四)含有雞α干擾素成熟蛋白基因的酵母表達載體電轉化入酵母菌1)取SacI酶線性化重組載體10ul分別與80ul X-33感受態(tài)畢赤酵母細胞混勻，然后轉移到冰預冷的0.2cm的電轉移杯中，冰上放置5min；2)將電轉移杯放在電穿孔儀上用脈沖電流電擊一次，電擊條件電壓1500V，電容25uF，電阻200Ω，時間5ms，溫度0℃；3)電擊結束，立即加入1ml冰預冷的1M山梨醇，混勻，取250ul轉化物涂含有100ug/mlZeocin抗生素的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28℃恒溫培養(yǎng)2-4天，能在YPDS培養(yǎng)基上生長的菌落為陽性轉化子；(五)用來鑒定陽性重組酵母菌的鑒定的PCR引物根據(jù)酵母表達載體pPICZa-A上的一部分基因序列分別在目的基因插入的兩端設計一對引物，它們分別為5′AOX1引物5‘gactggttccaattgagaagc’33′AOX1引物5‘gcaaatggcattctgacatcc’3(六)含雞α干擾素基因的重組酵母菌株的鑒定將篩選得到的重組高拷貝菌株，取單菌落中少量菌放入Eppendof管中，加100ul的滅菌水，100℃煮10分鐘，消解酵母菌細胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，100℃煮10分鐘，120000rpm/min離心取上清液，以其中少量基因組DNA作模板，進行PCR；(七)PCR擴增鑒定以基因組DNA為模板，對整合到畢赤酵母X-33染色體DNA中的雞α干擾素成熟蛋白基因進行PCR擴增，PCR擴增體系為10×PCRbuffer 5ul20pmol/ul 5′AOX1引物 0.5ul20pmol/ul 3′AOX1引物 0.5ulTaq酶 0.5ul10mM dNTPs 1ul基因組DNA模板5ul滅菌水補體積至 50ul擴增程序94℃ 5mi，94℃ 1min、55℃ 1.5min、72℃ 2.5min、30個循環(huán)，72℃ 7min，擴增結束，取5ul反應液做瓊脂糖凝膠電泳觀察陽性重組酵母表達菌株通過以上的一對引物擴增的片段總長度為1068bp左右；(八)含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的篩選將YPDS培養(yǎng)基平皿中長出的最初轉化子，影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000ug/ml的YPDS培養(yǎng)基中，逐級篩選Zeocin抗性菌株即含目的基因的高拷貝菌株；(九)含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的誘導表達從含有高拷貝目的基因的酵母菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株與25ml的BMGY中，經(jīng)28℃搖床培養(yǎng)至OD600＝2-6時，室溫1500g離心5min收獲細胞，將收獲的細胞用100ml的BMMY培養(yǎng)液懸浮與1000mld的三角瓶中28℃誘導表達，每24h向培養(yǎng)基中補加0.5％的甲醇，以保持誘導的持續(xù)表達，在誘導72h時收集培養(yǎng)上清備用；(十)含雞α干擾素成熟蛋白基因高表達酵母菌株的表達產(chǎn)物的初步純化培養(yǎng)上清的處理將誘導表達培養(yǎng)液離心，收集上清液留樣后，用50mM含1mMPMSF的Tris-HCl緩沖液溶解，裝入透析袋用50mM的Tris-HCl透析除去雜質，然后用PEG20000濃縮獲得雞α干擾素成熟蛋白。
2.權利要求1所述重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法所構建的重組載體，為含有雞α干擾素成熟蛋白基因的酵母表達載體。
全文摘要
本發(fā)明一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體屬于用分子生物學方法獲得的基因工程生物制品。將雞α干擾素的基因序列通過電轉化方式整合到酵母上的特定位置。采用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達外源基因，表達外源蛋白的純度高于70％，經(jīng)過65636倍稀釋發(fā)現(xiàn)能完全抑制100－1000TCID
文檔編號C12N15/81GK1594568SQ20041004107
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月24日 優(yōu)先權日2004年6月24日
發(fā)明者陳溥言, 蔡梅紅 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學