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一種天然脫落酸的提取方法

文檔序號(hào):456388閱讀:1518來源:國知局
專利名稱:一種天然脫落酸的提取方法
一、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域,具體涉及天然物質(zhì)的提取分離領(lǐng)域。
背景技術(shù)
脫落酸是五大植物激素之一,是植物重要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,能促進(jìn)果實(shí)類、谷類、豆類等的成熟發(fā)育,能大幅度提高其產(chǎn)量和質(zhì)量,又能大大增強(qiáng)其耐寒、抗旱和抗鹽堿能力,因而其有廣闊的應(yīng)用前景。
存在于植物體內(nèi)的天然脫落酸光學(xué)構(gòu)型為(s)-(+)-脫落酸,其結(jié)構(gòu)式為 2-順式-(+)-脫落酸現(xiàn)已經(jīng)建立了將植物細(xì)胞磨碎,用有機(jī)溶劑抽提,碳酸氫鈉水溶液萃取,提取液濃縮,再進(jìn)行柱層析,直接從植物中分離和精制天然脫落酸的方法。由于每1kg干植物僅含1-0.5mg天然脫落酸,其植物中的天然脫落酸含量很低,該方法難以得到大量的天然脫落酸。
而據(jù)報(bào)道人工合成脫落酸得到的是外消旋體,生物活性較低。
為了解決和滿足脫落酸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。近二十年來,微生物學(xué)專家一直在研究利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然脫落酸,現(xiàn)已有通過用微生物進(jìn)行液體發(fā)酵和固體發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的報(bào)道,主要采用了固體發(fā)酵、液體批次發(fā)酵和連續(xù)流加補(bǔ)料出料工藝等多種發(fā)酵方法,但這些方法中天然脫落酸的發(fā)酵產(chǎn)量一直比較低,成本高,如微生物發(fā)酵15天然脫落酸的濃度為63mg/升發(fā)酵液(JP-A-3-6139);最高的產(chǎn)量達(dá)300mg/升發(fā)酵液(如J P-A-6-247927、J P-A-6-197775);J P-A-63-296697公開的固體培養(yǎng)法的含量為82mg/100g培養(yǎng)基。由于迄今為止所報(bào)道天然脫落酸的發(fā)酵水平離工業(yè)化都還有一定的距離,因此,有關(guān)從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中分離提取天然脫落酸的工作開展較少,尤其從微生物發(fā)酵液中提取天然脫落酸的方法報(bào)道更少,而且收得率都比較低。例如,JP-A-60-6629公開的用大量溶劑萃取天然脫落酸,其產(chǎn)品收率約54%。JP-A-3-6139公開的產(chǎn)品收率為73%,都不適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
針對(duì)現(xiàn)有微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸方法中存在的發(fā)酵產(chǎn)率低,收率低,生產(chǎn)成本高等不足,本發(fā)明人通過研究,首先突破了發(fā)酵技術(shù)這一關(guān)(見CN1182798),天然脫落酸的最高產(chǎn)量達(dá)到1.2克/升發(fā)酵液,該發(fā)酵水平已接近或達(dá)到了工業(yè)化開發(fā)的要求,并實(shí)現(xiàn)了20噸規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn),產(chǎn)品收率為80%。
雖然通過發(fā)明人的努力,微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的產(chǎn)量和規(guī)模在原有基礎(chǔ)上都取得了顯著的進(jìn)步,但是,如何盡可能多的將發(fā)酵液中的天然脫落酸提取出來是急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上問題,發(fā)明人對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的發(fā)酵產(chǎn)物的提取進(jìn)行了深入的研究,得到了一種工藝簡(jiǎn)單,成本低,產(chǎn)品收率高的從微生物發(fā)酵液中提取天然脫落酸新方法,使天然脫落酸通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)成為了可能,從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明公開了一種從微生物發(fā)酵液中分離提取天然脫落酸的方法。
本發(fā)明所述的天然脫落酸提取方法指的就是從液體發(fā)酵液中將天然脫落酸分離、濃縮、純化的過程。
本發(fā)明可以通過以下方式得以實(shí)現(xiàn)取能發(fā)酵產(chǎn)生天然脫落酸的微生物定向培養(yǎng)得到的發(fā)酵液酸化后過濾,濾液用大孔吸附樹脂吸附后用有機(jī)溶劑洗脫,洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行萃取,萃取液濃縮得到結(jié)晶粗品;結(jié)晶粗品在乙酸乙酯中溶解后,用硅膠吸附雜質(zhì),加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑,減壓濃縮,冷卻結(jié)晶,洗滌、真空干燥,制得95%以上天然脫落酸結(jié)晶體。
本發(fā)明中的發(fā)酵液是用能生產(chǎn)天然脫落酸的微生物(如,葡萄飽霉屬、尾飽霉屬等)通過液體發(fā)酵得到的。
發(fā)酵液的酸化是加入硫酸或鹽酸處理0-10小時(shí),最優(yōu)處理時(shí)間范圍為0.5-5小時(shí),控制發(fā)酵液的Ph值范圍在1.5-5.0。
發(fā)酵液酸化后過濾除去雜質(zhì),利用101大孔陽離子交換吸附樹脂吸附發(fā)酵液中的天然脫落酸組分,再用有機(jī)溶媒如40-85%的甲醇或50-95%的乙醇水溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫。
洗脫液在真空度小于0.08Mpa下,經(jīng)減壓濃縮得到含天然脫落酸的濃縮液,以乙酸乙酯為溶劑多次萃取,減壓濃縮,冷卻結(jié)晶,制得結(jié)晶粗品。
在結(jié)晶粗品中加入乙酸丁酯或乙酸乙酯類低級(jí)乙酸酯溶劑,以適量的硅膠吸附雜質(zhì),加入己烷、苯、石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑,減壓濃縮,冷卻結(jié)晶,洗滌、真空干燥,制得95%以上天然脫落酸結(jié)晶體。
由于天然脫落酸是光敏化合物,整個(gè)操作過程都在避光條件下進(jìn)行,減少或避免天然脫落酸的異構(gòu)及分解,提高天然脫落酸的回收率。
新方法與現(xiàn)有報(bào)道的提取方法相比,本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、工藝方法簡(jiǎn)單合理、可行、投資??;
2、新方法采用的101大孔陽離子吸附樹脂是對(duì)以前提取方法的一個(gè)重要改進(jìn),新選擇的101大孔陽離子吸附樹脂對(duì)天然脫落酸具有非常強(qiáng)的富集能力,該步方法能富集發(fā)酵液中99%以上的天然脫落酸。而報(bào)道(JP-A-7-165702)的溶媒法多次萃取,該步工藝萃取率只有90%左右;3、新方法第一步是提取結(jié)晶粗品,改變了現(xiàn)有直接提取脫落酸精品的方法,使產(chǎn)品收得率達(dá)到90%以上,比現(xiàn)有的提取方法提高10個(gè)百分點(diǎn)以上;4、本發(fā)明方法的三廢排放量比溶媒法低得多。


下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明方法發(fā)酵液經(jīng)酸化后過濾,濾液用大孔吸附樹脂吸附后用有機(jī)溶劑如甲醇洗脫,洗脫液經(jīng)濃縮后以乙酸乙酯為溶劑進(jìn)行萃取,萃取液經(jīng)減壓濃縮后結(jié)晶得到結(jié)晶粗品;結(jié)晶粗品用低級(jí)乙酸酯類溶劑溶解后,用硅膠吸附雜質(zhì),過濾,再加入己烷、苯、石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑,減壓濃縮,冷卻結(jié)晶,過濾、洗滌、真空干燥,制得95%以上天然脫落酸結(jié)晶體。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例16000mL發(fā)酵培養(yǎng)基成分糊精5.0%,麥麩0.3%,乙二醇0.02%,葡萄糖2.0%,蔗糖3.0%,豆餅粉1.0%,,磷酸氫二鉀0.01%,硫酸鎂0.05%,將以上培養(yǎng)基分裝20個(gè)1000mL三角瓶,每瓶裝300mL,于120℃滅菌30分鐘,冷卻后接種活化后的脫落酸高產(chǎn)菌株灰葡萄孢TBI-9孢子懸液,于23-29℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。振蕩速度150rpm,振幅20cm。發(fā)酵時(shí)間8-9天,天然脫落酸濃度達(dá)到0.12%。
取5000克發(fā)酵液(天然脫落酸含量為6.025克),加入3N硫酸溶液調(diào)節(jié)Ph至1.5-5.0,進(jìn)行酸化處理30分鐘。在室溫下濾紙過濾,濾除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)后,利用1000克101大孔陽離子交換樹脂接觸富集酸化液體中的天然脫落酸1小時(shí)后,再用2500mL 40-85%甲醇洗樹脂30分鐘,收集含天然脫落酸的甲醇液,甲醇液的天然脫落酸含量是5.905克。
洗脫甲醇液在Buchi R-3000型旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾,真空度保持在小于0.08Mpa,水浴溫度40-60℃,蒸餾速度控制在12mL/min,濃縮成原體積五分之一左右的水溶液,用與濃縮液等體積的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取,當(dāng)水相中的天然脫落酸濃度低于0.05克/升時(shí)停止操作。合并酯相,在旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾,真空度保持在小于0.075Mpa,水浴溫度40-50℃,冷卻結(jié)晶得結(jié)晶粗品。本步操作收率達(dá)95%。
在結(jié)晶粗品中加入100mL乙酸丁酯或乙酸乙酯溶劑,以及20克硅膠吸附雜質(zhì),過濾。在濾液中加入10-100mL四氯化碳或石油醚結(jié)晶助劑,減壓濃縮,真空度保持在小于0.075Mpa,水浴溫度40-50℃,冷卻結(jié)晶,過濾、洗滌、真空干燥,即制得5.590克純度為98.3%的天然脫落酸產(chǎn)品,產(chǎn)品收率為91.2%。
以上操作過程都在避光條件下進(jìn)行。
實(shí)施例2發(fā)酵液的制備方法同實(shí)施例1,取5000克發(fā)酵液(天然脫落酸含量為6.010克),加入4.5升水,使液體中天然脫落酸的濃度為0.012%,用此溶液代替原始發(fā)酵液進(jìn)行提取分離。加入3N鹽酸溶液調(diào)節(jié)Ph至1.5-5.0,在室溫下9000rpm離心10分鐘,收集上清液。離心后的上清液與1000克101大孔陽離子交換樹脂接觸1小時(shí)后,再用2500mL 40-85%甲醇洗樹脂30分鐘,收集含天然脫落酸的甲醇液,甲醇液的天然脫落酸含量是5.920克。
洗脫甲醇液在Buchi R-3000型旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾,真空度保持在小于0.08Mpa,水浴溫度40-60℃,蒸餾速度控制在12mL/min,濃縮成原體積五分之一左右的水溶液,用與濃縮液等體積的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取,當(dāng)水相中的天然脫落酸濃度低于0.05克/升時(shí)停止操作。合并酯相,在旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾,真空度保持在小于0.075Mpa,水浴溫度40-50℃,冷卻結(jié)晶得結(jié)晶粗品。本步操作收率達(dá)95%。
在結(jié)晶粗品中加入100ml醋酸丁酯或醋酸乙酯溶劑,以及20克硅膠吸附雜質(zhì),過濾。在濾液中加入10-100mL四氯化碳或石油醚結(jié)晶助劑,減壓濃縮,真空度保持在小于0.075Mpa,水浴溫度40-50℃,冷卻結(jié)晶,過濾、洗滌、真空干燥,制得5.621克純度為98.5%的天然脫落酸產(chǎn)品,產(chǎn)品收率為92.1%。
以上操作過程都在避光條件下進(jìn)行。
實(shí)施例3發(fā)酵液的制備方法同實(shí)施例1,取5000克發(fā)酵液(天然脫落酸含量為6.110克)。提取分離操作中除了101大孔陽離子交換樹脂接觸富集酸化液體中的天然脫落酸后,用乙醇代替甲醇作為洗脫劑對(duì)樹脂吸附的天然脫落酸進(jìn)行洗脫外,其它操作基本同實(shí)施例1。最后制得5.589克純度為98.5%的天然脫落酸產(chǎn)品,產(chǎn)品收率為90.1%。
權(quán)利要求
1.一種天然脫落酸的提取方法,包括以下步驟取能發(fā)酵產(chǎn)生天然脫落酸的微生物定向培養(yǎng)得到的發(fā)酵液酸化后過濾,濾液用大孔吸附樹脂吸附后用有機(jī)溶劑洗脫,洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行萃取,萃取液濃縮得到結(jié)晶粗品;結(jié)晶粗品溶解后,用硅膠吸附雜質(zhì),加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑,減壓濃縮,冷卻結(jié)晶,洗滌、真空干燥,制得95%以上天然脫落酸結(jié)晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法,其特征是發(fā)酵液的酸化是加入硫酸或鹽酸處理0-10小時(shí),最優(yōu)處理時(shí)間范圍為0.5-5小時(shí),控制發(fā)酵液的Ph值范圍在1.5-5.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法,其特征是吸附用大孔樹脂優(yōu)選為101大孔陽離子交換吸附樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法,其特征是洗脫用的有機(jī)溶媒優(yōu)選為40-85%的甲醇或50-95%的乙醇水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法,其特征是整個(gè)操作過程都在避光條件下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法,其特征是粗品溶解采用乙酸乙酯作為溶劑,加入的結(jié)晶助劑與乙酸乙酯的體積比例為0.1-1.0比1.0。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。針對(duì)目前天然脫落酸提取率和純度不高的問題,本發(fā)明公開了一種天然脫落酸的提取方法,通過發(fā)酵液酸化后過濾,大孔吸附樹脂吸附后洗脫,洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行萃取,萃取液濃縮得到結(jié)晶粗品;結(jié)晶粗品溶解后,用硅膠吸附雜質(zhì),加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑,減壓濃縮,冷卻結(jié)晶,洗滌、真空干燥,制得95%以上天然脫落酸結(jié)晶體,本方法具有提取率高、提取得到脫落酸純度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/40GK1749401SQ20041004068
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者周金燕, 譚紅, 楊杰, 李志東 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院成都生物研究所
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