尼羅羅非魚性別鑒定用引物及pcr鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測鑒定技術(shù)，具體的說涉及對(duì)尼羅羅非魚性別進(jìn)行PCR鑒定的弓丨物及使用該引物的PCR鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]尼羅羅非魚屬于鱸形目，麗魚科，羅非魚屬，原產(chǎn)于約旦的坦噶尼喀湖，我國于1978年從泰國引進(jìn)并推廣養(yǎng)殖，現(xiàn)在我國已是世界上最大的羅非魚生產(chǎn)國和出口國。我國主要養(yǎng)殖的羅非魚品種有尼羅羅非魚，奧利亞羅非魚和奧尼雜交羅非魚等。由于不同品種的羅非魚有很大的形態(tài)特征重疊，這使僅從形態(tài)上鑒別不同羅非魚品種非常困難。另外，羅非魚品種間很容易雜交，且雜交種可育，雜交種形態(tài)又與親本性狀很相似，因此，很容易造成羅非魚種質(zhì)混雜，導(dǎo)致優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀退化，這也是目前制約我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的突出問題。在養(yǎng)殖過程中雌雄羅非魚生長差異明顯，雄魚比雌魚生長快，常常導(dǎo)致出池規(guī)格相差懸殊，從而降低了商品魚的質(zhì)量，減少了經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]解決的技術(shù)問題:為了快速、準(zhǔn)確鑒定尼羅羅非魚性別，防止在養(yǎng)殖過程中因雌雄魚生長差異明顯導(dǎo)致出池規(guī)格相差懸殊，從而降低商品魚的質(zhì)量，本發(fā)明提供一種尼羅羅非魚性別鑒定用引物及PCR鑒定方法。
[0004]技術(shù)方案:一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定用引物，所述引物能夠?qū)δ崃_羅非魚的AMH基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，雄性個(gè)體生成2條特異性擴(kuò)增片段，長度分別為:179bp和412bp，雌性個(gè)體生成1條長度為412bp的特異性擴(kuò)增片段。
[0005]AMH基因是抗繆勒氏管激素基因anti Mullerian hormone的縮寫，其在Gene bank數(shù)據(jù)庫中的序列號(hào)為:EF512167。
[0006]優(yōu)選的，所述尼羅羅非魚性別PCR鑒定用引物的核苷酸序列為:
[0007]正向:5，-CAGGAGGGAGTCAGTTCCGTG-3’
[0008]反向:5，-CTCTAGCGGCATCCACACTCC-3，。
[0009]一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定方法，該方法以尼羅羅非魚血液樣品中提取的基因組DNA為模板，采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
[0010]優(yōu)選的，所述鑒定方法的PCR反應(yīng)體系為:10X反應(yīng)MIX液5yL，正反向引物各
0.25 μ L，濃度為50ng/ μ L?lOOng/ μ L的DNA模板1 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μ L。[0011 ] 優(yōu)選的，所述鑒定方法的PCR的反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性94 °C、2min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0012]—種尼羅羅非魚性別PCR鑒定用試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述的引物。
[0013]有益效果:(1)使用本發(fā)明所述的引物對(duì)尼羅羅非魚的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，雄性個(gè)體生成2條特異性擴(kuò)增片段，長度分別為:179bp和412bp，雌性個(gè)體生成1條長度為412bp的特異性擴(kuò)增片段，能夠明顯區(qū)分，因而可以簡單、精確地對(duì)尼羅羅非魚的性別進(jìn)行鑒定；(2)本發(fā)明所述引物特異性強(qiáng)，不會(huì)對(duì)目標(biāo)片段以外的其它片段擴(kuò)增；(3)本發(fā)明公開了使用所述引物的PCR鑒定方法，該方法操作快捷、結(jié)果準(zhǔn)確，避免了采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定不同性別的尼羅羅非魚帶來的結(jié)果不穩(wěn)定的缺陷。
【附圖說明】
[0014]圖1是純種尼羅羅非魚PCR性別鑒定電泳檢測結(jié)果；
[0015]其中，Μ為DL1000 ;1_5、11-17為尼羅羅非雄魚；6_10、18-23為尼羅羅非雌魚。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0017]實(shí)施例1
[0018]第1步、引物設(shè)計(jì)
[0019]根據(jù)尼羅羅非魚的ΑΜΗ基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列為:
[0020]正向:5，-CAGGAGGGAGTCAGTTCCGTG-3’
[0021]反向:5’ -CTCTAGCGGCATCCACACTCC-3 ’。
[0022]第2步、基因組DNA提取
[0023](1)取待檢樣品19尾，樣品均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場米得;
[0024](2)尾靜脈采血，使用Axygen生產(chǎn)的AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒，并按照說明書步驟抽提基因組DNA。
[0025]第3步、PCR鑒定方法建立
[0026](l)PCR的反應(yīng)體系為:10X反應(yīng)MIX液5 μ L，正反向引物各0.25 μ L，DNA模板1 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μ L ;
[0027](2)PCR的反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性94°C、2min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存；
[0028](3)PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，采用凝膠成像儀拍照記錄電泳結(jié)果。
[0029]如圖1所示，電泳檢測發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非雌魚都只有1條長度為412bp的特異性擴(kuò)增條帶，尼羅羅非雄魚有2條特異性的擴(kuò)增條帶，長度分別為179bp和412bp，由電泳圖譜可將尼羅羅非魚的雌雄個(gè)體區(qū)別開來。
[0030]從圖中可知，采用本發(fā)明所述的尼羅羅非魚性別PCR鑒定用引物擴(kuò)增基因組DNA時(shí)，無其他雜帶出現(xiàn)，因此本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能夠特異性的擴(kuò)增目標(biāo)序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定用引物，其特征在于，所述引物能夠?qū)δ崃_羅非魚的AMH基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，雄性個(gè)體生成2條特異性擴(kuò)增片段，長度分別為:179bp和412bp，雌性個(gè)體生成1條長度為412bp的特異性擴(kuò)增片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定用引物，其特征在于，引物的核苷酸序列為:正向:5’ -CAGGAGGGAGTCAGTTCCGTG-3，反向:5’ -CTCTAGCGGCATCCACACTCC-3’。3.權(quán)利要求1或2所述的一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定方法，其特征在于，該方法以尼羅羅非魚血液樣品中提取的基因組DNA為模板，采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定方法，其特征在于，PCR的反應(yīng)體系為:10X反應(yīng)MIX液5yL，正反向引物各0.25 μ L，濃度為50ng/μ L?lOOng/μ L的DNA模板1 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μ Lo5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定方法，其特征在于，PCR的反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性94°C、2min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C 延伸 5min，4°C 保存。6.一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定用試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的引物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種尼羅羅非魚性別PCR鑒定用引物及PCR鑒定方法，所述引物能夠?qū)δ崃_羅非魚的AMH基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，雄性個(gè)體生成2條特異性擴(kuò)增片段，長度分別為:179bp和412bp，雌性個(gè)體生成1條長度為412bp的特異性擴(kuò)增片段。使用本發(fā)明所述的引物對(duì)尼羅羅非魚的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，雄性個(gè)體生成2條特異性擴(kuò)增片段，長度分別為:179bp和412bp，雌性個(gè)體生成1條長度為412bp的特異性擴(kuò)增片段，能夠明顯區(qū)分，因而可以簡單、精確地對(duì)尼羅羅非魚的性別進(jìn)行鑒定；所述引物特異性強(qiáng)，不會(huì)對(duì)目標(biāo)片段以外的其它片段擴(kuò)增；本發(fā)明公開了使用所述引物的PCR鑒定方法，該方法操作快捷、結(jié)果準(zhǔn)確，避免了采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定不同性別的尼羅羅非魚帶來的結(jié)果不穩(wěn)定的缺陷。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105368948
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510855662
【發(fā)明人】李紅霞, 俞菊華, 李建林, 唐永凱, 于凡, 何杰
【申請(qǐng)人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
【公開日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日