專利名稱：一種基于液相芯片的多靶點(diǎn)定量核酸檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸檢測方法，尤其涉及了一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)進(jìn)行多靶點(diǎn)定量核酸檢測的方法。此方法可用于樣本基因型、DNA甲基化、拷貝數(shù)變異、染色體非整倍性異常和基因表達(dá)檢測。
背景技術(shù)：
I.基因分型基因在染色體上的位置稱為座位，每個(gè)基因都有自己特定的座位。凡是在同源染色體上占據(jù)相同座位的基因都稱為等位基因。在自然群體中往往有一種占多數(shù)的(因此常被視為正常的)等位基因，稱為野生型基因；同一座位上的其他等位基因一般都直接或間接地由野生型基因通過突變產(chǎn)生，由于DNA分子中的特點(diǎn)位點(diǎn)發(fā)生堿基對的增添、缺失或 改變，而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，相對于野生型基因，稱它們?yōu)橥蛔冃突?。在二倍體的細(xì)胞或個(gè)體內(nèi)有兩個(gè)同源染色體，所以每一個(gè)座位上有兩個(gè)等位基因。如果這兩個(gè)等位基因是相同的，那么就這個(gè)基因座位來講，這種細(xì)胞或個(gè)體稱為純合體；如果這兩個(gè)等位基因是不同的，就稱為雜合體。在雜合體中，兩個(gè)不同的等位基因往往只表現(xiàn)一個(gè)基因的性狀，這個(gè)基因稱為顯性基因，另一個(gè)基因則稱為隱性基因。由于基因突變通常發(fā)生在DNA復(fù)制時(shí)期，即細(xì)胞分裂間期，包括有絲分裂間期和減數(shù)分裂間期；同時(shí)基因突變和脫氧核糖核酸的復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、癌變和衰老都有關(guān)系，基因突變也是生物進(jìn)化的重要因素之一，通過檢測樣本的基因型，實(shí)現(xiàn)基因分型，除了本身的理論意義以外，對科學(xué)研究和生產(chǎn)活動都有廣泛的實(shí)際意義。2. DNA 甲基化DNA甲基化是表遺傳學(xué)上研究最深入的一種機(jī)制，是一種酶介導(dǎo)的化學(xué)修飾過程。DNA甲基化后核苷酸順序未變，而基因表達(dá)受影響。DNA的甲基化對維持染色體的結(jié)構(gòu)、X染色體的失活、基因印記以及許多人類基因病(如癌癥，心血管疾病，糖尿病)發(fā)生發(fā)展都起重要的作用。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，基因組CpG 二核苷酸的胞嘧啶5'碳原子共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。CpG 二核苷酸序列在基因組中出現(xiàn)的比例遠(yuǎn)低于基因組中其他二核苷酸序列。但是在基因組中有一些長度約O. 5-4kb的區(qū)域，這些區(qū)域CpG密度很高，稱其為CpG島。56%基因的鄰近啟動子區(qū)域帶有CpG島。在正常的細(xì)胞中CpG島通常是處于非甲基化狀態(tài)。但是，在癌細(xì)胞中，腫瘤相關(guān)基因啟動子的這些區(qū)域發(fā)生了超甲基化，這個(gè)現(xiàn)象被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程中最為重要的表觀遺傳學(xué)改變。啟動子的甲基化在各個(gè)類型的腫瘤的發(fā)生中都有被發(fā)現(xiàn)，并且和轉(zhuǎn)錄水平的基因異常沉默有關(guān)。有關(guān)基因啟動子異常甲基化與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系的研究，目前主要集中在以下4 類基因抑癌基因(包括 Rb、VHL、pl6INK4a、pl5INK4b、pl4AKF、p73、BRCAl、APC、FHIT, RARB22、RASSF1A)、DNA修復(fù)基因(MGMT和hMLHl)、腫瘤分子侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(E2cadherin、DAPK、TIMP3)及代謝酶基因(GSTPl)。這些基因涉及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、DNA損傷修復(fù)及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過程。幾乎所有的人類腫瘤中都存在腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化。2001年M. Esteller等人對涵蓋了肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌等15種癌癥的600個(gè)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)12個(gè)重要的腫瘤相關(guān)基因的啟動子在癌組織中發(fā)生了甲基化模式的改變[I]。結(jié)果顯示，每一類型的腫瘤中都同時(shí)存在著多種腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化，而且不同部位的腫瘤組織中，各種基因的甲基化發(fā)生頻率是不同的，存在著明顯的基因一腫瘤類型相關(guān)性。胃腸道腫瘤(如結(jié)腸癌、胃癌等)*pl6INK4a、pl4AKF、MGMT、AP(^PhMLHl基因的甲基化比率較高；呼吸系統(tǒng)腫瘤(肺癌、頭頸部癌)中pl6INK4a、DAPK、MGMT基因的甲基化較常見；乳腺癌、卵巢癌中pl6INK4a、GSTPU BRCAU⑶Hl等基因啟動子異常甲基化較為頻繁；而惡性血液系統(tǒng)疾病中基因異常甲基化的情況與其它實(shí)體瘤明顯不同，這些腫瘤中p73、pl5的異常甲基化頻繁，這兩種基因的異常甲基化在其他腫瘤中則很少見。腫瘤組織中這些基因的啟動子超甲基化而關(guān)閉表達(dá)，從而導(dǎo)致了細(xì)胞中多個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控通路發(fā)生功能紊亂。因此，顯而易見的，研究腫瘤細(xì)胞異常的表觀遺傳譜和弄清遺傳圖譜一樣，能夠深化對于不同類型腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程的理解，并且能夠用作鑒別腫瘤類型和亞型的輔助手段[2]。 3.拷貝數(shù)變異拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)是指基因組上長度超過Ikb的DNA片斷，在不同個(gè)體間存在拷貝數(shù)的差異。產(chǎn)生的機(jī)制主要有非等位基因同源重組(Nonallelic homologous recombination, NAHR)和非同源末端連接(nonhomologous endjoining，NHEJ)，以NAHR更為常見。這種差異可以表現(xiàn)為拷貝數(shù)的增加(insertions和duplications)或減少(deletions 和 nullgenotypes)。在群體中頻率超過 I % 的 CNVs 被稱謂拷貝數(shù)多態(tài)性(copy number polymorp hisms)。 2004年美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室和瑞士洛桑大學(xué)的兩個(gè)研究小組在《自然》和《科學(xué)》幾乎同時(shí)發(fā)表論文，報(bào)道了人體內(nèi)拷貝數(shù)變異現(xiàn)象的存在。此后，其他研究小組的跟進(jìn)研究進(jìn)一步確認(rèn)了拷貝數(shù)變異的存在。CNVs在人類基因組中的分布非常普遍，可影響基因組中超過10 %的序列。然而受限于檢測手段，這類遺傳變異直到最近兩年才為研究者所重視，并迅速成為當(dāng)前人類遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。不少研究發(fā)現(xiàn)，CNVs與不少疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如Di George > Smi th-Mageni s >ff i 11 iams-Beuren>HIV病毒易感性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬相關(guān)、腎小球腎炎、Parkinson癥、Alzheimer癥、精神分裂癥等。2008年《科學(xué)》和《自然》雜志分別報(bào)道了美國和歐洲兩項(xiàng)大規(guī)模精神分裂癥的調(diào)查研究，研究者從拷貝數(shù)變異上找到了致病的蛛絲馬跡。前者由美國國際精神分裂癥協(xié)會主持開展，3400名分裂癥患者和3200名健康人參與了調(diào)查。結(jié)果顯示，某些特定基因的拷貝數(shù)突變導(dǎo)致神經(jīng)分裂的發(fā)病幾率提高I. 15倍。后者由冰島雷克雅未克的deCODE Genetics生物制藥公司和歐洲SGENE協(xié)會(由歐洲、美國及中國的18家研究機(jī)構(gòu)組成)共同執(zhí)行，納入研究的包括4700名精神分裂癥患者及41200名健康人，研究同樣表明拷貝數(shù)變異的決定因素。目前CNVs檢測的主要采用比較基因組雜交(comparativegenomichybridization, CGH)技術(shù)，常用的 CGH 芯片主要有 Oligo、Clone array 等。檢測過程主要如下將樣品及參照樣品基因組DNA進(jìn)行處理，并標(biāo)記上不同的熒光基團(tuán)，混合均勻后與微陣列芯片上DNA探針進(jìn)行雜交?；蚪MDNA拷貝數(shù)量即與雜交后芯片上樣品與參照樣品熒光強(qiáng)度比值有關(guān)，如果樣品的基因組某DNA片段拷貝數(shù)減少，則該序列位置處樣品熒光要弱于參照樣品的熒光，反之則強(qiáng)于后者，這樣就可以直觀地得到基因組DNA發(fā)生變異的位點(diǎn)信息及拷貝數(shù)量變化信息。其它用于CNVs檢測的技術(shù)還有熒光定量PCR技術(shù)(一個(gè)反應(yīng)只能測定一個(gè)CNVs,需要多個(gè)重復(fù))、突光原位雜交(fluorescence in situhybridization, FISH)、直接測序(可以檢測 insertions、Rearrangement breakpoint)、配對端點(diǎn)測序(pairedend sequencing)等。目前，CNVs檢測的技術(shù)平臺都有一定的局限性①采用SNP芯片用于CNVs檢測時(shí)應(yīng)注意，常見的CNVs會導(dǎo)致SNPs不符合H-W平衡及Mendelian遺傳，為了保證SNPs數(shù)據(jù)的質(zhì)量，商業(yè)化的SNP芯片就會避開這些位于CNVs的SNPs，這樣就不能覆蓋部分CNVRs ;另外，SNP芯片利于區(qū)分等位基因，而不利于拷貝數(shù)目的檢測。②對多等位基因型的CNVs檢測結(jié)果不理想，因?yàn)殡S著等位基因型的增加，不同拷貝數(shù)之間的信號差異變得越來越小。如攜帶I個(gè)拷貝的個(gè)體與攜帶2個(gè)拷貝的個(gè)體相比，其信號比為I : 2，而攜帶5個(gè)拷貝和6個(gè)拷貝的個(gè)體，其信號間的比值為5 6。③Oligo array若要準(zhǔn)確測定CNVs的片段大小，則需要有密度足夠高的探針，Clone array則易于高估CNVs的片段大小[3]。④現(xiàn)有技術(shù)多不能 檢測平衡重組(balanced rearrangement),如倒位(inversion)和易位(translocation)等，無法確定重排斷裂位點(diǎn)(rearrangement breakpoints),這不利于對CNVs的功能分析、進(jìn)化和群體遺傳學(xué)研究。⑤CNVs的鑒定是通過比較CNVs和標(biāo)準(zhǔn)參照基因之間檢測信號的相對比值而實(shí)現(xiàn)的，但目前仍沒有理想的標(biāo)準(zhǔn)參照基因。缺乏標(biāo)準(zhǔn)參照DNA往往使低拷貝數(shù)CNVs的鑒定復(fù)雜化，很難通過簡單的實(shí)驗(yàn)鑒別出究竟是檢測樣品中出現(xiàn)了缺失CNVs或是參照樣品中存在重復(fù)CNVs。4.染色體非整倍性異常染色體疾病是人類遺傳性疾病中的一大類，是由于整條染色體或部分染色體的增加或缺失引起染色體異常所致。因?yàn)槿旧w是基因的載體，一條染色體上可以有成千上萬個(gè)遺傳基因，所以失去或獲得整條染色體一般難以存活，是自然流產(chǎn)或夭折的主要原因。同時(shí)染色體異常不僅導(dǎo)致胎兒自發(fā)流產(chǎn)和兒童夭折頻率明顯升高，而且發(fā)生染色體異常最常見的臨床后果還表現(xiàn)為患者出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩、大多為嚴(yán)重的智力低下以及身體先天性畸形等異常特征。染色體異常(Chromosome Abnormalities)可分成染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)異常兩類。染色體數(shù)目異常是指正常細(xì)胞內(nèi)整個(gè)染色體組或整條染色體的增多或減少。而染色體結(jié)構(gòu)異常是指部分染色體重復(fù)或缺失、染色體內(nèi)倒位、環(huán)狀染色體或等臂染色體形成以及染色體間插入、易位或交換等引起的染色體變異。其中，染色體數(shù)目異常比染色體結(jié)構(gòu)異常更為常見。染色體數(shù)目異常又分為染色體整倍體異常和染色體非整倍體異常。染色體數(shù)目若以正常單倍體配子中所含染色體數(shù)(n，23條染色體)的整數(shù)倍形式增加或減少，則發(fā)生染色體整倍體異常。染色體數(shù)目若因?yàn)槟骋粭l染色體數(shù)目增加或減少一條或數(shù)條而變得不是整倍體，則發(fā)生染色體非整倍體異常。在人類染色體整倍體異常中只有三倍體(3n，69條染色體)和四倍體(4n，92條染色體)有過報(bào)道，但是大都發(fā)現(xiàn)于自發(fā)性流產(chǎn)的胎兒。絕大多數(shù)的多倍體是無法存活的，即使出生后仍能存活的也通常為與二倍體形成的嵌合體。而人類染色體非整倍體異常是胎兒最常見的一類染色體異常。因染色體非整倍體異常引起的流產(chǎn)大約占總數(shù)的1/3，至少1/50的胎兒以及大約1/300的新生兒患有染色體非整倍體異常.根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，主要的臨床表現(xiàn)較嚴(yán)重的染色體非整倍體異常類型如表I.表I常見的染色體非整倍體異常
__主要核型出生率[4，5]
唐氏綜合癥(Down Syndrome)47,+211/650
愛德華氏綜合征(EdwardSyndrome)47, + 181/3000
帕陶氏綜合征(PatauSyndrome)47,+131/5000
克林費(fèi)特氏綜合征(KlinefelterSyndrome)47,XXY1/500
特納氏綜合征(TurnerSyndrome)45,X1/2500染色體疾病的主要影響發(fā)生在出生前，所以染色體異常的一大臨床后果為大約50%或更多的自發(fā)性流產(chǎn)胎兒有嚴(yán)重的染色體異常。另外，盡管不同的染色體異常在臨床上的表現(xiàn)不盡相同，染色體異常的另一大臨床后果還表現(xiàn)為出生缺陷。迄今為止，針對已經(jīng)出生的患有染色體異常疾病的患者尚無有效的治療方法。因此檢查胎兒是否患有染色體異常是許多孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷或產(chǎn)前篩查的一個(gè)主要原因。染色體核型分析(Karyotyping)是診斷染色體異常最為常規(guī)的方法、也是檢測染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)。它能夠準(zhǔn)確檢測出所有染色體數(shù)目異常以及染色體大片段重排和染色體大片段的插入或缺失，但是必須經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后才能檢測分析的該方法需要兩周至三周的時(shí)間，而且檢測不出染色體小片斷的異常。因此這種細(xì)胞生物學(xué)方法既耗時(shí)又耗力。盡管三十多年來一直是染色體異常產(chǎn)前診斷的常規(guī)方法，卻有明顯的不足之處。熒光原位雜交技術(shù)則利用熒光標(biāo)記的特異性探針雜交觀察分裂中期染色體或間期細(xì)胞核以判斷染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常。雖然不需要培養(yǎng)細(xì)胞，但是需要制備的探針費(fèi)用昂貴，并且操作過程仍然繁瑣耗時(shí)以及需要專門的技術(shù)人員，很難用于大規(guī)模的產(chǎn)前診斷。另外，基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)診斷方法因其快速簡便、易自動化等特點(diǎn)而迅速發(fā)展起來。熒光定量PCR是通過選取特定染色體上的短串聯(lián)重復(fù)序列(sTR)標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳，根據(jù)所得的產(chǎn)物峰的數(shù)目和面積比例區(qū)分出染色體異?；颊?。不過因?yàn)樵摲椒ū旧泶嬖诘娜毕?，即使選用兩個(gè)或多個(gè)高度多態(tài)性的STR位點(diǎn)檢測，該方法仍然存在理論上準(zhǔn)確率不能達(dá)到100%和判讀結(jié)果出現(xiàn)假陰性的情況。同時(shí)該方法不適合檢測于染色體拷貝數(shù)缺失，因此單體型染色體非整倍體異常不適合使用熒光定量PCR檢測。5.多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)多重寡核苷酸連接檢測技術(shù)于2002年由Schouten等首先報(bào)道[6]，是近幾年發(fā)展起來的一種針對待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)高效、特異，在一次反應(yīng)中可以檢測眾多靶基因，目前已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究，如染色體數(shù)目異常、遺傳性疾病基因缺失重復(fù)、基因甲基化檢測等。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)最大的特點(diǎn)是以雜交探針代替基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。其中，雜交探針由兩段寡核苷酸序列組成，分別稱作左側(cè)雜交探針和右側(cè)雜交探針。如同其它類型的探針一樣，左側(cè)和右側(cè)雜交探針均有一段序列與樣本DNA完全互補(bǔ)以保證特異性雜交。但不同的是，左側(cè)和右側(cè)雜交探針分別還有一段與樣本DNA無關(guān)的引物結(jié)合序列，因而只需要一對擴(kuò)增引物即可同時(shí)擴(kuò)增幾十個(gè)雜交探針。這樣不僅極大地減少引物二聚體產(chǎn)生，而且可以消除不同引物擴(kuò)增引起的效率差異問題，從而能夠高效率地同時(shí)獲得40 50個(gè)靶序列信息。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)以其準(zhǔn)確度高和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)被迅速地廣泛使用，而且國際上和國內(nèi)的一些醫(yī)院已經(jīng)開始陸續(xù)使用該技術(shù)作為常規(guī)檢測方法的輔助檢測技術(shù)。但MLPA技術(shù)存在兩個(gè)缺點(diǎn)(1).必須通過繁瑣耗時(shí)的M13噬菌體克隆才能夠得到反應(yīng)所需的雜交探針。(2).多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)中擴(kuò)增所得的幾十個(gè)PCR產(chǎn)物需要通過毛細(xì)管電泳，依據(jù)PCR產(chǎn)物長度的不同從而在電泳結(jié)果中相對應(yīng)的位置進(jìn)行分辨。由于依賴PCR產(chǎn)物長度的不同才能區(qū)分，因此雜交探針的設(shè)計(jì)變得相對復(fù)雜，而且同時(shí)檢測靶序列的最大重?cái)?shù)也受到限制。6.液相芯片技術(shù)液相芯片是新一代的生物芯片診斷技術(shù)平臺。該技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，在微球制造過程中，摻入不同比例的染色劑，從而形成不同的熒光色。然后再把針對不同檢測物的核酸探針分別以共價(jià)方式吸附到不同熒光色的微球上。應(yīng)用時(shí)，先把針對不同檢測物的不同熒光色的微球混合，在加入被檢測物。在懸液中偶聯(lián)有特異性探針的 微球與待測核酸樣本特異性雜交，雜交僅需幾十分鐘，并加上熒光標(biāo)記。然后，微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列通過兩束激光，一束判定顆粒的顏色從而決定被測物的特異性(定性)；另一束測定微粒上的熒光標(biāo)記強(qiáng)度從而給被測物定量，所得的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷結(jié)果。該技術(shù)具有高通量，高速度、敏感性高等特點(diǎn)。本發(fā)明對經(jīng)典多重寡核苷酸連接檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，用特異性標(biāo)簽序列(Tag)代替M13噬菌體片段，通過化學(xué)合成法制備探針，簡化了探針的設(shè)計(jì)和制備步驟。用液相芯片檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，提高了檢測分辨率，單管反應(yīng)減少污染，并真正實(shí)現(xiàn)了檢測的自動化與高通量，為科研和臨床應(yīng)用提供廣闊前景。參考文獻(xiàn)[ I] Estel Ier, M. , Corn, P. G. , Bay I in, S. B. , and Herman, J. G. (2001) A
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測(MultiplexOligonucleotide Ligation Detection MOLD)反應(yīng)多祀點(diǎn)定量檢測核酸的方法。此方法的靈敏度高，速度快，可用于多重檢測樣本基因型、DNA甲基化、拷貝數(shù)變異、染色體非整倍性異常和基因表達(dá)。本發(fā)明所述的基于液相芯片技術(shù)的MOLD反應(yīng)的多靶點(diǎn)定量核酸檢測方法，包括如下步驟，其檢測流程如圖I所示I)選取待測核酸樣本，其中包含一段或多段的已知核苷酸序列作為檢測的靶序列，每段靶序列長度至少為40bp。本發(fā)明用于基因分型或DNA甲基化檢測時(shí)，靶序列須包含用于基因分型的特定突變位點(diǎn)或DNA甲基化位點(diǎn)。2)針對待測核酸樣本中每段靶序列，設(shè)計(jì)并制備一組特異性MOLD探針。MOLD探針的組數(shù)與待測核酸片段中靶序列個(gè)數(shù)一致。i)每組MOLD探針包含左側(cè)探針和右側(cè)探針，其中左探針5’端包含一段上游通用 弓I物序列，3’端包含一段與靶序列特異性雜交的序列，上游通用弓I物序列與靶序列雜交序列之間插入一段標(biāo)簽(Tag)序列。用于樣本基因型或DNA甲基化檢測時(shí)，左探針與靶序列特異性雜交的序列3’末端與待測的堿基突變位點(diǎn)或甲基化位點(diǎn)配對。其中右探針5’端包含一段與靶序列特異性雜交的序列，3’端包含一段下游通用引物序列。右探針5’末端帶有磷酸基團(tuán)修飾。ii)同組MOLD探針的左探針3’末端和右探針5’末端與靶序列結(jié)合的位點(diǎn)相鄰。iii)不同組的MOLD探針，左探針5’端上游通用引物序列相同，右探針3’端下游通用引物序列相同。上游通用引物序列和下游通用引物序列和待測核酸樣本不發(fā)生雜交。iv)不同組的MOLD探針，左探針的標(biāo)簽(tag)序列長度基本相同，都在20_30個(gè)堿基左右，但核苷酸序列特異，作為區(qū)分不同組的MOLD探針的標(biāo)識。標(biāo)簽(tag)序列與待測核酸樣本不發(fā)生雜交。3)在單一反應(yīng)管中，待測樣品與步驟I所得一組或多組MOLD探針雜交。一組左右探針，兩段與靶序列特異性雜交的序列相鄰地與待測序列完全互補(bǔ)雜交時(shí)，左探針的靶序列雜交序列的3’末端游離羥基同右探針的靶序列雜交序列的5’末端磷酸基團(tuán)在連接酶的催化作用下形成磷酸二酯鍵，連接酶將與靶序列完全互補(bǔ)的一組左、右探針連接成一條完整的雜交探針。特定位點(diǎn)發(fā)生基因突變和DNA甲基化的待測樣本，左探針3’末端與靶序列不能互補(bǔ)配對，連接酶無法完成連接。4)制備一對通用引物X和Y，其中通用引物X與所有左探針5’端上游通用引物序列互補(bǔ)，通用引物Y與所有右探針3’端下游通用引物序列互補(bǔ)，通用引物Y的5’端用生物素標(biāo)記。使用通用引物對X、Y，以步驟3中完成連接的探針序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。5)設(shè)計(jì)一系列與MOLD探針的特異性標(biāo)簽(Tag)序列特異性結(jié)合的檢測(Anti-tag)序列與xTAG微球表面偶聯(lián)，同時(shí)為減少空間位阻效應(yīng)的影響在5’端氨基和檢測探針之間插入適當(dāng)長度的間隔序列如圖2所示。將步驟4所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與液相芯片中的xTAG微球進(jìn)行雜交,雜交反應(yīng)后加入鏈霉素親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)，然后通過液相芯片設(shè)備檢測熒光信號。利用能識別不同組MOLD探針的Tag序列的標(biāo)簽(anti-tag)序列，達(dá)到多重檢測的目的。其中，步驟2所述的左側(cè)探針的上游通用引物序列和右側(cè)探針的下游通用引物序列是與目的基因無關(guān)的。故所有的雜交探針能夠共有相同的一對上下游引物序列，從而避免多對引物之間容易出現(xiàn)的非特異性結(jié)合以及不同引物擴(kuò)增引起的擴(kuò)增效率差異，有助于核酸的多重反應(yīng)和定量。其中，步驟3同時(shí)加入連接反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的各種試劑，包括DNA連接酶、氯化鎂溶液、DNA聚合酶緩沖液、DNA聚合酶、四種脫氧核糖核酸混合溶液、輔酶I (NAD+)溶液。其中DNA連接酶的最適溫度為55°C，DNA聚合酶的最適溫度為72°C。因此可通過調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度，先激活DNA連接酶進(jìn)行探針連接反應(yīng)，再激活DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可保證先進(jìn)行連接反應(yīng)后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的目的，也做到了反應(yīng)全程閉管操作，有效避免污染。其中，步驟5所述的間隔臂可以減少空間位阻，提高雜交效率及雜交特異性，常用的間隔臂序列包括多聚 dT(poly dT)、(CH2) 12、(CH2)6、(CH2) 18 等。本發(fā)明將多重寡核苷酸連接檢測技術(shù)與液相芯片技術(shù)結(jié)合，并對經(jīng)典多重寡核苷酸連接檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，其特點(diǎn)在于，將經(jīng)典多重寡核苷酸連接檢測的長(左)探針?biāo)琈13噬菌體片段用一段特異性標(biāo)簽(tag)序列代替，每個(gè)特異性標(biāo)簽序列的長度基本相同，都在20-30個(gè)堿基左右，這種特異性標(biāo)簽序列可以與液相芯片的xTAG微球上所攜帶的檢 測探針互補(bǔ)配對，我們將探針上的特異性標(biāo)簽稱為Tag，而微球上攜帶的互補(bǔ)雜交探針稱為Anti-Tag。首先左、右探針與靶序列雜交互補(bǔ)，在連接酶的作用下，連接成一條完整的寡核苷酸探針序列，然后以連接的探針為模板又一對通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后與液相芯片的微球雜交，每個(gè)探針的擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶的Tag都是唯一的，與之互補(bǔ)雜交的xTAG微球也是唯一的，隨后通過液相芯片平臺進(jìn)行檢測，得出結(jié)論。本發(fā)明用于樣本基因型和DNA甲基化檢測時(shí)如圖3所示，由于左探針3’末端堿基只能與靶序列特定突變位點(diǎn)的野生型完全回補(bǔ)，當(dāng)該位點(diǎn)發(fā)生堿基突變和甲基化，左、右探針就無法連接成完整的探針，也不能通過通用引物X、Y進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增，也就不能通過液相芯片平臺檢測到對應(yīng)的熒光信號，因此根據(jù)熒光信號的有無就可判斷靶序列是否有特定位點(diǎn)突變存在，通過熒光信號強(qiáng)弱變化定量判斷基因突變情況。本方面用于樣本拷貝數(shù)變異、染色體非整倍性異常和基因表達(dá)檢測時(shí)如圖4所示，當(dāng)樣本的待測序列拷貝數(shù)發(fā)生異常時(shí)，直接影響對應(yīng)的MOLD探針的PCR擴(kuò)展產(chǎn)物的含量，因此通過液相芯片平臺檢測到對應(yīng)的熒光信號強(qiáng)度的變化就可以定量判斷待測基因拷貝數(shù)變異、染色體非整倍性異常和基因表達(dá)異常。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于I)本發(fā)明的檢測方法在擴(kuò)增產(chǎn)物與微球雜交之前的連接、擴(kuò)增反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)閉管操作，可有效避免實(shí)驗(yàn)室污染。2)本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，因而避免了復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定引物，提高了檢測準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性。3)本發(fā)明所提供的檢測方法可以多靶點(diǎn)定量檢測核酸，而所需時(shí)間大大少于測序技術(shù)，更符合臨床檢測要求。


圖1M0LD探針結(jié)合液相芯片技術(shù)多靶點(diǎn)定量檢測核酸樣本的流程2用于識別不同組MOLD探針的xTAG微球結(jié)構(gòu)示意3本發(fā)明用于檢測樣本基因型、甲基化時(shí)探針雜交連接示意圖
圖4本發(fā)明用于檢測樣本拷貝數(shù)變異、染色體非整倍性異常和基因表達(dá)時(shí)探針雜交連接示意圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一檢測樣本基因型、甲基化I)用常規(guī)方法從組織及各類體液提取獲得DNA樣本；2)根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)多重寡核苷酸探針；每組多重寡核苷酸探針由左側(cè)探針和右側(cè)探針組成。按照從5’端到3’端的方向，左側(cè)探針依次包含上游通用引物序列、標(biāo)簽(Tag)序列和靶序列雜交序列；右側(cè)探針依次包含靶序列雜交序列和下游通用引物結(jié)合序列。其中，左探針的靶序列雜交序列的3’末 端與野生型待測樣本的突變位點(diǎn)互補(bǔ)配對，右探針的5’端帶有磷酸基團(tuán)修飾。3)多重寡核苷酸探針的雜交連接和PCR擴(kuò)增；將適量的DNA連接酶、寡核苷酸探針對(包括左側(cè)探針和右側(cè)探針)、氯化鎂溶液、DNA聚合酶、DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核酸混合溶液、輔酶I (NAD+)溶液、正向通用引物和生物素標(biāo)記的反向通用引物混合均勻,加入適量的樣本DNA，加水至10-20微升。連接-PCR反應(yīng)條件如下94°C反應(yīng)1_3分鐘，連接反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)50°C反應(yīng)20-40秒，94°C反應(yīng)20-30秒；隨后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增94°C反應(yīng)10-30秒，適當(dāng)?shù)耐素洔囟确磻?yīng)10-30秒，72°C延伸20秒。反應(yīng)結(jié)束后維持在4°C條件下。4) PCR產(chǎn)物與雜交xTAG微球，液相芯片檢測；帶有檢測(Anti-Tag)序列的微球充分混勻后，將微球溶液稀釋，稀釋液包含了一定量的微球和雜交緩沖液，適量微球溶液與步驟2中的PCR產(chǎn)物混合均勻，進(jìn)行如下雜交反應(yīng)94°C反應(yīng)I分鐘，隨后緩慢降溫至25°C，降溫速率保持在5°C /分鐘。反應(yīng)結(jié)束后保持在4°C環(huán)境。用液相芯片儀檢測雜交后的微球。如果檢測的靶序列發(fā)生點(diǎn)突變，那么長、短探針就無法連接，也不能通過通用引物進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增，也就不能通過液相芯片平臺檢測到對應(yīng)的熒光信號，因此根據(jù)熒光信號的改變就可判斷靶序列是否有突變，并據(jù)區(qū)分樣本的基因型(包括野生型、雜合突變型和純合突變型)。實(shí)施例二 檢測樣本拷貝數(shù)變異、染色體非整倍性異常和基因表達(dá)I)用常規(guī)方法從組織及各類體液提取獲得DNA樣本；2)根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)多重寡核苷酸探針；每組多重寡核苷酸探針由左側(cè)探針和右側(cè)探針組成。按照從5’端到3’端的方向，左側(cè)探針依次包含上游通用引物序列、標(biāo)簽(Tag)序列和靶序列雜交序列；右側(cè)探針依次包含靶序列雜交序列和下游通用弓I物結(jié)合序列。其中，左、右探針的靶序列雜交序列與特定的待測靶序列雜交，右側(cè)探針的5’端帶有磷酸基團(tuán)修飾。3)多重寡核苷酸探針的雜交連接和PCR擴(kuò)增；將適量的DNA連接酶、寡核苷酸探針對(包括左側(cè)探針和右側(cè)探針)、氯化鎂溶液、DNA聚合酶、DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核酸混合溶液、輔酶I (NAD+)溶液、正向通用引物和生物素標(biāo)記的反向通用引物混合均勻,加入適量的樣本DNA，加水至10-20微升。
連接-PCR反應(yīng)條件如下94°C反應(yīng)1_3分鐘，連接反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)50°C反應(yīng)20-40秒，94°C反應(yīng)20-30秒；隨后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增94°C反應(yīng)10-30秒，適當(dāng)?shù)耐素洔囟确磻?yīng)10-30秒，72°C延伸20秒。反應(yīng)結(jié)束后維持在4°C條件下。4) PCR產(chǎn)物與雜交xTAG微球，液相芯片檢測；帶有檢測(Anti-Tag)序列的微球充分混勻后，將微球溶液稀釋，稀釋液包含了一定量的微球和雜交緩沖液，適量微球溶液與步驟2中的PCR產(chǎn)物混合均勻，進(jìn)行如下雜交反應(yīng)94°C反應(yīng)I分鐘，隨后緩慢降溫至25°C，降溫速率保持在5°C /分鐘。反應(yīng)結(jié)束后保持在4°C環(huán)境。用液相芯片儀檢測雜交后的微球。如果檢測的靶序列拷貝數(shù)發(fā)生，連接形成的雜交探針和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量也會發(fā)生對應(yīng)變化，通過液相芯片平臺就能檢測到對應(yīng)的熒光信號的變化，因此根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱變化就可判斷樣本的基因拷貝數(shù)是否發(fā)生變化， 并對拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
權(quán)利要求
1.一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)多靶點(diǎn)定量檢測核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)選取待測核酸樣本； 2)根據(jù)待測核酸樣本中的靶序列，設(shè)計(jì)并制備一組或多組特異性MOLD探針； 3)待測核酸樣本與MOLD探針雜交，連接酶將與靶序列完全互補(bǔ)的一組左探針和右探針連接成一條完整的雜交探針； 4)用一對通用引物X、Y，聚合酶以完成連接的雜交探針序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 5)用液相芯片中的xTAG微球與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交后加入鏈霉素親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)，然后通過液相芯片設(shè)備檢測熒光信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)多靶點(diǎn)定量檢測核酸的方法，其特征在于所述的MOLD探針的組數(shù)與待測核酸樣本中靶序列個(gè)數(shù)一致，每組MOLD探針包含左探針和右探針，其左探針5 ’端包含一段上游通用弓I物序列，3’端包含一段與靶序列特異性雜交的序列，上游通用引物序列與靶序列雜交序列之間插入一段標(biāo)簽序列。其右探針5’端包含一段與靶序列特異性雜交的序列，3’端包含一段下游通用引物序列。右探針5’末端帶有磷酸基團(tuán)修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)多靶點(diǎn)定量檢測核酸的方法，其特征在于所述的一組MOLD探針左探針3’末端和右探針5’末端與靶序列結(jié)合的位點(diǎn)相鄰。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)多靶點(diǎn)定量檢測核酸的方法，其特征在于所述的MOLD探針，其左探針包含一段標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列長度基本相同，都在20-30個(gè)堿基左右，不同組的MOLD探針的標(biāo)簽序列特異。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)多靶點(diǎn)定量檢測核酸的方法，其特征在于連接酶在低溫下就具有催化活性的，而聚合酶需要高溫才可發(fā)揮催化活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)多靶點(diǎn)定量檢測核酸的方法，其特征在于用于PCR擴(kuò)增的通用引物X與左探針5’端上游通用引物序列互補(bǔ)，通用引物Y與右探針3’端下游通用引物序列互補(bǔ)，通用引物Y的5’端用生物素標(biāo)記
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種基于液相芯片技術(shù)的多重寡核苷酸連接檢測反應(yīng)進(jìn)行多靶點(diǎn)定量核酸檢測的方法，具體步驟包括1)選取待測核酸樣本，2)設(shè)計(jì)MOLD探針，3)MOLD探針的雜交連接，4)PCR擴(kuò)增，5)液相芯片檢測。此方法的靈敏度高，速度快，可用于多重檢測樣本基因型、DNA甲基化、拷貝數(shù)變異、染色體非整倍性異常和基因表達(dá)。
文檔編號C12Q1/68GK102676642SQ201110064169
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者姬云 申請人:姬云