專利名稱：一種用dna標(biāo)記快速提高邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種用DNA標(biāo)記快速提高邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)對(duì)數(shù)量性狀遺傳機(jī)制的理解建立在抽象的微效多基因假設(shè)基礎(chǔ)上，將影響一個(gè)數(shù)量性狀的所有基因當(dāng)作一個(gè)整體來(lái)處理，而不考慮其中的各個(gè)基因是如何作用的。這一假說(shuō)在多年的動(dòng)植物育種中發(fā)揮了重要作用，推動(dòng)了動(dòng)植物育種工作的進(jìn)展，在當(dāng)時(shí)的理論和技術(shù)條件下不失為一個(gè)很好的基礎(chǔ)。但這一假說(shuō)不了解數(shù)量性狀的遺傳背景，不了解控制數(shù)量性狀的基因在染色體上的位置及其傳遞規(guī)律，無(wú)法對(duì)其效應(yīng)作出準(zhǔn)確的估計(jì)，更不能從分子水平分離和定位該類基因。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，遺傳學(xué)家和育種學(xué)家認(rèn)識(shí)到控制數(shù)量性狀的基因并非在基因組中隨機(jī)分布，且存在影響數(shù)量性狀的主效基因。目前，在育種中對(duì)雞產(chǎn)蛋數(shù)的篩選方法主要是通過(guò)數(shù)量遺傳學(xué)方法，而數(shù)量遺傳學(xué)方法進(jìn)展緩慢，尋找到合適的DNA標(biāo)記用于輔助選擇能增強(qiáng)選擇的準(zhǔn)確性、縮短世代間隔，加快遺傳進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用DNA標(biāo)記快速提高邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的方法，該方法利用雞m^i酶切圖譜對(duì)邊雞產(chǎn)蛋數(shù)進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，不受環(huán)境影響。本發(fā)明的原理是DNA池測(cè)序發(fā)現(xiàn)邊雞MSTN基因外顯子1的234bp處存在一個(gè) G-A突變，DNAMAN 5. 22軟件分析表明該位點(diǎn)為KdvI識(shí)別位點(diǎn)。針對(duì)該酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增邊雞基因組DNA，引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)m^vl酶切產(chǎn)生3種基因型(GG、GA和AA)。 該單核苷酸突變能穩(wěn)定遺傳，選擇的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，且不受外界環(huán)境的影響，可以用于邊雞產(chǎn)蛋數(shù)選擇的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明所說(shuō)的方法是提取待測(cè)樣本的雞基因組DNA，經(jīng)特異性引物(SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2)擴(kuò)增得到162bp的目的片段，目的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶^vI酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對(duì)待測(cè)樣本產(chǎn)蛋數(shù)的多少進(jìn)行判斷。所述根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對(duì)待測(cè)樣本產(chǎn)蛋數(shù)的多少進(jìn)行判斷的方法是 僅有162bp條帶的為產(chǎn)蛋數(shù)的多的純合型樣本，僅有127bp條帶的為產(chǎn)蛋數(shù)的少的純合型樣本；同時(shí)含有162bp和127bp條帶的為產(chǎn)蛋數(shù)的多的雜合型樣本。本發(fā)明是提供了邊雞MSTN基因在邊雞育種篩選中作為產(chǎn)蛋數(shù)選擇的分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。所述分子遺傳標(biāo)記在應(yīng)用于育種篩選時(shí)，選擇MSTN基因中不含m^vl酶切位點(diǎn)的個(gè)體，即產(chǎn)蛋數(shù)多的純合型樣本(AA型)。


圖1是PCR產(chǎn)物圖，Marker為GM331。( 1_8泳道為8個(gè)不同邊雞個(gè)體的PCR產(chǎn)物) 圖2是BbvI酶切產(chǎn)物圖，Marker為GM331。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1.試驗(yàn)材料
118只一世代的邊雞母雞血樣采自山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所。采取的邊雞群體來(lái)自同一批次，單籠飼養(yǎng)，管理和營(yíng)養(yǎng)水平一致。用肝素鈉作為抗凝劑，從翅靜脈采集血樣0. 5 mL,采用常規(guī)苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，測(cè)定DNA的濃度后備用。2.引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 2.1酶切引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank中雞MSTN基因序列(GenBank登錄號(hào)為AF346599)針對(duì)外顯子1的KdvI 位點(diǎn)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為162 bp。引物序列如下 Pl :F: 5，-GCATTAGCAGGGACGTTAT-3，； (SEQ ID NO 1) R:5，-ACTCCGTAGGCATTGTGAT-3，(SEQ ID NO :2)
2.2 PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增反應(yīng)為25 PL體系，包括上、下游引物(10 Mmol/L)2 μ ；dNTPs (2 mmol/L) 2.5 μ ；Taq DNA 聚合酶(5 U/^L)0. 2 PL;DNA 模板(50 ng/^L)2 μ ；Mg2+ (25 mmol/L)l. 5 μ ； 10 XPCR緩沖液2. 5 μ ；超純水14. 3 μ 。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序94°C變性6 min ；94°C變性30 s，56°C復(fù)性30 s，72°C延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10 min ;10°C保存。PCR反應(yīng)完成后，用交聯(lián)度為(Acr:BiS)39:l的10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果(圖1)，硝酸銀染色，UV凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像。2. 3 PCR-RFLP 檢測(cè)
PCR產(chǎn)物用m^vl酶切，以檢測(cè)多態(tài)性。酶切反應(yīng)總體積為20 yL，超純水16.5 μ L, BbvI 酶(10 u/μ L) 0.5 μ L,10Xbuffer 2 yL，37° C 酶切 2 h，酶切產(chǎn)物用交聯(lián)度為 (Acr:Bii029:l的10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，200V電泳5 h，硝酸銀染色。酶切圖譜如圖2所示，顯示3種基因型，僅有162bp目的片段的樣本不含rn^vl酶切位點(diǎn)，命名為AA 型；僅有127bp的為含有rn^vl酶切位點(diǎn)的純合型，命名為GG型；同時(shí)含有162bp和127bp 的為含有KdvI酶切位點(diǎn)的雜合型樣本，命名為GA型。GG和AA相比在外顯子1編碼區(qū)的 234 bp (C. 234 bp)處有一個(gè)G — A的突變。當(dāng)C. 234 bp處為G時(shí)，BbvI酶切產(chǎn)生127 bp 和35 bp的片段；當(dāng)C. 234 bp處為A時(shí)，無(wú)KdvI酶切位點(diǎn)。在凝膠檢測(cè)時(shí)，有酶切位點(diǎn)的樣本產(chǎn)生的35bp的片段由于長(zhǎng)度太小，跑出了凝膠，所以在凝膠中未顯示出條帶。根據(jù)酶切圖譜中條帶的數(shù)量和大小辨別引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有m^i酶切位點(diǎn)。2. 4 MSTN基因KdvI位點(diǎn)不同基因型與邊雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析
運(yùn)用下列模型比較邊雞繁殖性狀在MSTN各基因型之間的差異yijk = μ+ Gi +Sj+ e 模型中yijk為性狀的測(cè)定值；μ為群體平均值^為基因型效應(yīng)而為家系效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差。不同基因型對(duì)邊雞母雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析見(jiàn)表1。由表可見(jiàn)，GG基因型個(gè)體的開產(chǎn)日齡極顯著的高于GA和AA基因型個(gè)體(P<0. 01);AA基因型個(gè)體的300日齡產(chǎn)蛋數(shù)極顯著的高于GG基因型個(gè)體(P<0.01)，GA基因型個(gè)體的300日齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著的高于GG基因型個(gè)體(P<0.01)。在育種篩選中只選擇AA型(即不含m^vl酶切位點(diǎn)的MSTN基因)可以在群體中固定該基因型。所以PCR產(chǎn)物能否被rn^vi酶切開可作為篩選邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的方法。
表1不同基因型對(duì)邊雞母雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
1.邊雞MSTN基因在邊雞育種篩選中作為產(chǎn)蛋數(shù)選擇的分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述分子遺傳標(biāo)記在應(yīng)用于育種篩選時(shí)， 選擇MSTN基因中不含rn^vi酶切位點(diǎn)的個(gè)體，即產(chǎn)蛋數(shù)多的純合型樣本。
3.—種用DNA標(biāo)記快速提高邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的方法，其特征在于提取待測(cè)樣本的雞基因組DNA JSSEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的特異性引物擴(kuò)增得到162bp目的片段，目的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶rn^vl酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對(duì)待測(cè)樣本產(chǎn)蛋數(shù)的多少進(jìn)行判斷。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述用DNA標(biāo)記快速提高邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的方法，其特征在于所述根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對(duì)待測(cè)樣本產(chǎn)蛋數(shù)的多少進(jìn)行判斷的方法是僅有162bp條帶的為產(chǎn)蛋數(shù)的純合型樣本，僅有127bp條帶的為產(chǎn)蛋數(shù)的少的純合型樣本；同時(shí)含有162bp和 127bp條帶的為產(chǎn)蛋數(shù)多的雜合型樣本。
全文摘要
本發(fā)明涉及家禽育種領(lǐng)域，具體涉及一種用DNA分子標(biāo)記篩選邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的方法。所述方法是提取待測(cè)樣本的雞基因組DNA，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增得到MSTN基因目的片段，目的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BbvI酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據(jù)圖譜中條帶的數(shù)量和大小對(duì)待測(cè)樣本產(chǎn)蛋數(shù)進(jìn)行判斷。本發(fā)明選擇的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，且不受外界環(huán)境的影響，可以用于邊雞產(chǎn)蛋數(shù)的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102352410SQ201110293169
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月7日
發(fā)明者丁馥香, 張麗, 張李俊, 張跟喜, 戴國(guó)俊, 王金玉, 謝愷舟, 趙秀華 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)