成像并評(píng)估胚胎、卵母細(xì)胞和干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于確定一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力和/或一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞中的染色體異常的存在的方法、組合物和試劑盒。這些方法、組合物和試劑盒在體外確定在人類中治療不育癥中最有用的胚胎和卵母細(xì)胞中有用。
【專利說(shuō)明】成像并評(píng)估胚胎、卵母細(xì)胞和干細(xì)胞
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年8月23日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?01080047415. 4、發(fā)明名稱為 "成像并評(píng)估胚胎、卵母細(xì)胞和干細(xì)胞"的專利申請(qǐng)（國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2010/046343)的 分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2010年5月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/332,651號(hào)和2009 年8月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/236,085號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其兩者通過(guò)引用全文并 入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及來(lái)自人類和動(dòng)物兩者的合子/胚胎、卵母細(xì)胞和干細(xì)胞的生物和臨床 測(cè)試以及尤其是成像和評(píng)估的領(lǐng)域。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 不育癥是影響10-15%生育年齡的夫婦的常見(jiàn)的健康問(wèn)題。2006年僅在美國(guó)，約 進(jìn)行了 140, 000個(gè)周期的體外受精（IVF) (cdc. gov/art)。這產(chǎn)生每年超過(guò)一百萬(wàn)個(gè)用于植 入并且發(fā)育足月的具有可變并且常常不清楚的潛力的胚胎的培養(yǎng)。IVF之后的活胎率，每 個(gè)周期，僅為29%，而平均30%的活胎導(dǎo)致多胎妊娠（cdc. gov/art)。多胎妊娠對(duì)母親和 胎兒都具有證據(jù)充分的不利結(jié)果，例如流產(chǎn)、早產(chǎn)和低出生率。IVF失敗的可能原因是不同 的；然而，自從1978年引入IVF以來(lái)，主要挑戰(zhàn)之一是鑒定最適于轉(zhuǎn)移并且最可能產(chǎn)生足月 妊娠的胚胎。
[0007] 基礎(chǔ)胚胎發(fā)育領(lǐng)域中的認(rèn)知受到限制，因?yàn)閷?duì)人類胚胎生物學(xué)的研究仍然具有爭(zhēng) 議并且常常從研究資金中免除。結(jié)果，胚胎發(fā)育的現(xiàn)有知識(shí)中的大部分來(lái)源于模式生物的 研究。然而，當(dāng)來(lái)自不同物種的胚胎經(jīng)歷相似的發(fā)育時(shí)期時(shí)，時(shí)機(jī)因物種而不同。這些不 同以及許多其他不同使得其不適于直接從一個(gè)物種推知到另一個(gè)物種（Taft，R.E. (2008) Theriogenology69 (1) : 10-16)。人類發(fā)育的一般途徑，以及根本的基本分子決定因素，對(duì) 于人類胚胎發(fā)育來(lái)說(shuō)是獨(dú)一無(wú)二的。例如，在小鼠中，胚胎轉(zhuǎn)錄在受精后約12個(gè)小時(shí)被 活化，與第一次卵裂分裂同時(shí)，而在人類胚胎中，胚胎基因活化（EGA)發(fā)生在第3天，約8 細(xì)胞時(shí)期出611，(：.￡.等人（2008)]\1〇1.1111111.1?印1'〇(1.14:691-701 ;&^11(16，？.等人（1988) Nature332:459-461 ;Hamatani，T?等人（2004)Proc. Natl. Acad. Sci. 101:10326-10331; Dobson, T?等人（2004)Human Molecular Geneticsl3(14) :1461 - 1470)。此夕卜，在早 期人類發(fā)育中被調(diào)節(jié)的基因是獨(dú)一無(wú)二的（Dobson, T.等人（2004)Human Molecular Geneticsl3(14) :1461 - 1470)。而且，在其他物種例如小鼠中，超過(guò)85 %的體外培 養(yǎng)的胚胎達(dá)到胚泡期，哺乳動(dòng)物發(fā)育中的第一大界標(biāo)之一，而培養(yǎng)的人類胚胎具有約 30-50 %的平均胚泡形成率，以及鑲嵌現(xiàn)象和不正常表型例如破碎和發(fā)育停滯的高發(fā)生 率（把61^;[，1.等人（2005)1^卩1'0(1.13;[01116(1.0111;[11610:669-681;六111^11；[，]\1等人（2005) Mol.Hum.Reprod.ll:335-344;Keltz，M.D?等人（2006)Fertil.Steril.86:321-324; French，D.B.等人（2009)Fertil.Steril.)。雖然有這些不同，但是大部分的植入前胚 胎發(fā)育研究來(lái)源于模式生物并且很難與人類胚胎發(fā)育相關(guān)（Zernicka-G〇etZ，M. (2002) 06￥61〇口11161^129:815-829;恥1^，0.等人（2004)06 ￥〇611.6:133-144;8611，(：.￡.等 人（2008)M〇1. Hum. Reprod. 14:691-701 ;Zernicka_Goetz，M. (2006)Curr. Opin. Genet. Dev. 16:406-412 ;Mtango，N. R?等人（2008) Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 268:223-290)。
[0008] 傳統(tǒng)上在IVF臨床中，人類胚胎成活力通過(guò)簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)觀察例如均勻大小的、 單核的卵裂球的存在和細(xì)胞破碎的程度來(lái)測(cè)定（Rijinders PM, Jansen CAM. (1998)Hum Reprodl3:2869-73;Milki AA 等人（2002)Fertil Steril77:1191-5)。最近，另外的方法 例如胚胎的延長(zhǎng)培養(yǎng)（至第5天的胚泡期）和經(jīng)由著床前胚胎遺傳學(xué)診斷（PGD)的染色 體分析已經(jīng)被用于測(cè)定胚胎質(zhì)量（Milki A等人（2000) Fertil Steri 173:126-9 ;Fragouli E, (2009)Fertil Steril Jun21[印刷出版前的 EPub] ;El_Toukhy T 等人（2009)Hum R印rod 6:20;Vanneste E等人（2009)Nat Medl5:577-83)。然而，這些方法的潛在風(fēng)險(xiǎn) 也存在，因?yàn)樗鼈冄娱L(zhǎng)培養(yǎng)期并且破壞胚胎完整性（Manipalviratn S等人（2009)Fertil Steril91:305-15;Mastenbroek S 等人（2007)N Engl J Med. 357:9-17)。
[0009] 近來(lái)所顯示的是時(shí)差成像可以是觀察早期胚胎發(fā)育的有用的工具。一些方法已經(jīng) 使用時(shí)差成像監(jiān)測(cè)精子卵漿內(nèi)注射（ICSI)之后的人類胚胎發(fā)育（Nagy等人（1994)Human Reproduction. 9(9) :1743-1748 ;Payne 等人（1997) Human Reproduction. 12:532-541)。第 3天，分析極體排出和原核形成并且與良好的形態(tài)學(xué)相關(guān)聯(lián)。然而，沒(méi)有與胚泡形成或妊娠 結(jié)果有關(guān)的參數(shù)。其他方法已經(jīng)關(guān)注作為指示的第一次卵裂的開(kāi)始以預(yù)測(cè)人類胚胎的成 活力（Fenwick 等人（2002)Human Reproduction, 17:407-412 ;Lundin 等人（2001)Human Iteproductionl6:2652-2657)。然而，這些方法沒(méi)有認(rèn)可胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間或早期分裂之 間的時(shí)間間隔的重要性。
[0010] 其他方法已經(jīng)使用時(shí)差成像以測(cè)量早期胚胎發(fā)育期間細(xì)胞分裂的時(shí)機(jī)和程度 (W0/2007/144001)。然而，這些方法僅公開(kāi)用于牛胚胎的時(shí)差成像的基本和一般方法，其 在發(fā)育潛力、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、分子和后生程序以及轉(zhuǎn)移附近的時(shí)機(jī)和參數(shù)上基本上與人類胚 胎不同。例如，牛胚胎與人類胚胎相比花費(fèi)長(zhǎng)得多的時(shí)間來(lái)植入（分別為30天和9天）。 (Taft, (2008) Theriogenology69(l) :10-16)。而且，沒(méi)有公開(kāi)可以預(yù)計(jì)人類胚胎成活力的 特定的成像參數(shù)或時(shí)間間隔。
[0011] 最近，時(shí)差成像已經(jīng)被用于觀察受精之后最初24小時(shí)期間的人類胚胎發(fā)育 (Lemmen 等人（2008)Reproductive BioMedicine 0nlinel7(3) :385-391)。發(fā)現(xiàn)首次分裂 之后細(xì)胞核的同步與妊娠結(jié)果有關(guān)。然而，這一工作得出結(jié)論早期首次卵裂不是重要的預(yù) 計(jì)參數(shù)，其與之前的研究相矛盾（Fenwick等人（2002)Human Reproductionl7:407_412; Lundin 等人（2001) Human Reproductionl6:2652-2657)。
[0012] 最終，沒(méi)有研究通過(guò)與胚胎的分子程序或胚胎的染色體組合相關(guān)聯(lián)而確認(rèn)成像參 數(shù)。因此在若干方面缺少人類胚胎評(píng)估的方法并且可通過(guò)本方法改進(jìn)，其包括時(shí)差顯微術(shù) 的新應(yīng)用、圖像分析和成像參數(shù)與分子譜和染色體組合的關(guān)聯(lián)性。本發(fā)明解決這些問(wèn)題。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 提供了用于確定一個(gè)或多個(gè)胚胎或一個(gè)或多個(gè)胚胎中的多潛能細(xì)胞或多潛能細(xì) 胞的發(fā)育潛力的方法、組合物和試劑盒。這些方法、組合物和試劑盒在體外確定具有良好發(fā) 育潛力即發(fā)育成為胚泡的能力（ability)或能力（capacity)的胚胎和卵母細(xì)胞中有用，其 因此在治療人類中的不育癥的方法以及類似方法中是有用的。
[0015] 在本發(fā)明的一些方面中，提供了用于確定胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的方法。 在這些方面中，測(cè)量胚胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以取得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。 細(xì)胞參數(shù)之后被用于提供對(duì)所述胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的確定，所述確定可用于指 導(dǎo)臨床的行動(dòng)方針。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)是通過(guò)時(shí)差顯微術(shù)可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事件。 在一些實(shí)施方案中，例如，當(dāng)胚胎被測(cè)定時(shí)，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是：胞質(zhì)分裂事件例 如胞質(zhì)分裂1的持續(xù)時(shí)間；胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì) 分裂3之間的時(shí)間間隔。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞周期1的持續(xù)時(shí)間也用作細(xì)胞參數(shù)。在 一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果通過(guò)將其與來(lái)自參考胚胎的可比較的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié) 果相比較并且使用這一比較的結(jié)果來(lái)提供所述胚胎發(fā)育潛力的確定來(lái)使用。在一些實(shí)施方 案中，胚胎是人類胚胎。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)是被測(cè)量以取得基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果的 基因表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果通過(guò)將其與來(lái)自參考多潛能細(xì)胞或 胚胎或來(lái)自其的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果相比較來(lái)使用，其中這一比較的結(jié)果 被用來(lái)提供所述多潛能細(xì)胞或胚胎的發(fā)育潛力的確定。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎是人 類胚胎。
[0016] 在本發(fā)明的一些方面中，提供用于將胚胎或多潛能細(xì)胞按照它們相對(duì)于組中其他 胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力分級(jí)的方法。在這些實(shí)施方案中，測(cè)量所述組中的所述胚胎 或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以取得所述胚胎或多潛能細(xì)胞的每一個(gè)的細(xì)胞參數(shù) 測(cè)量結(jié)果。之后將所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果用于確定所述組中所述胚胎或多潛能細(xì)胞的每一 個(gè)相對(duì)于彼此的發(fā)育潛力，所述確定可用于指導(dǎo)臨床的行動(dòng)方針。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞 參數(shù)是通過(guò)時(shí)差顯微術(shù)可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事件。在一些實(shí)施方案中，例如當(dāng)胚胎被分級(jí)時(shí)，一 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是胞質(zhì)分裂事件例如胞質(zhì)分裂1的持續(xù)時(shí)間；胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2 之間的時(shí)間間隔和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞周 期1的持續(xù)時(shí)間也被測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)是一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)水平。在 一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果通過(guò)將來(lái)自所述組中的所述胚胎或多潛能 細(xì)胞中的每一個(gè)的所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果彼此比較以確定所述胚胎或多潛能細(xì)胞相對(duì)于 彼此的發(fā)育潛力。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果通過(guò)將每個(gè)細(xì)胞 參數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自參考胚胎或多潛能細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果相比較以確定來(lái)自每個(gè) 胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力并且將這些發(fā)育潛力相比較以確定所述胚胎或多潛能細(xì)胞 相對(duì)于彼此的發(fā)育潛力來(lái)使用。
[0017] 在本發(fā)明的一些方面中，提供用于為輔助生殖（IVF)提供用于向雌性動(dòng)物轉(zhuǎn)移的 具有良好發(fā)育潛力的胚胎的方法。在這些方面中，在對(duì)于胚胎發(fā)育來(lái)說(shuō)充足的條件下培養(yǎng) 一個(gè)或多個(gè)胚胎。之后在所述一個(gè)或多個(gè)胚胎中測(cè)量一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以取得細(xì)胞參數(shù) 測(cè)量結(jié)果。之后將所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果用于提供所述一個(gè)或多個(gè)胚胎的發(fā)育潛力的確 定。證實(shí)良好發(fā)育潛力的一個(gè)或多個(gè)胚胎之后被轉(zhuǎn)移至雌性動(dòng)物中。
[0018] 本申請(qǐng)還涉及以下方面：
[0019] 項(xiàng)1. 一種確定人類胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的方法，其包括：
[0020] (a)測(cè)量所述人類胚胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量 結(jié)果；和
[0021] (b)使用所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以提供對(duì)所述胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的確 定。
[0022] 項(xiàng)2.如項(xiàng)1所述的方法，其中所述細(xì)胞參數(shù)是可通過(guò)時(shí)差顯微術(shù)測(cè)量的。
[0023] 項(xiàng)3.如項(xiàng)2所述的方法，其中測(cè)定胚胎的發(fā)育潛力并且所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù) 選自由下列所組成的組：
[0024] (i)胞質(zhì)分裂事件的持續(xù)時(shí)間；
[0025] (ii)胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和
[0026] (iii)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
[0027] 項(xiàng)4.如項(xiàng)3所述的方法，其中所述人類胚胎的良好發(fā)育潛力由下列指示：
[0028] (i)胞質(zhì)分裂1的持續(xù)時(shí)間為約0分鐘至約30分鐘；
[0029] (ii)胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始之間的時(shí)間間隔為約8-15小時(shí)；和/ 或
[0030] (iii)胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí)間間隔為約0-5小時(shí)。
[0031] 項(xiàng)5.如項(xiàng)4所述的方法，其中所述測(cè)量步驟還包括測(cè)量細(xì)胞周期1的持續(xù)時(shí)間。
[0032] 項(xiàng)6.如項(xiàng)5所述的方法，其中所述人類胚胎的良好發(fā)育潛力由為約20-27小時(shí)的 細(xì)胞周期1的持續(xù)時(shí)間指示。
[0033] 項(xiàng)7.如項(xiàng)3所述的方法，其中所述使用步驟包括將所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自 參照人類胚胎的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果相比較并且使用所述比較的結(jié)果以提供所述人類胚胎 的發(fā)育潛力的確定。
[0034] 項(xiàng)8.如項(xiàng)7所述的方法，其中所述人類胚胎的不良發(fā)育潛力由下列指示：
[0035] (a)所述人類胚胎比所述參照人類胚胎更長(zhǎng)的胞質(zhì)分裂1 ;
[0036] (b)所述人類胚胎比所述參照人類胚胎更長(zhǎng)或更短的胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分 裂2的開(kāi)始之間的時(shí)間間隔；和/或
[0037] (C)所述人類胚胎比所述參照人類胚胎更長(zhǎng)的胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的 起始之間的時(shí)間間隔。
[0038] 項(xiàng)9.如項(xiàng)8所述的方法，其中所述測(cè)量還包括測(cè)量細(xì)胞周期1的持續(xù)時(shí)間。
[0039] 項(xiàng)10.如項(xiàng)9所述的方法，其中所述人類胚胎的不良發(fā)育潛力由所述胚胎比所述 參照人類胚胎更長(zhǎng)的細(xì)胞周期1來(lái)指示。
[0040] 項(xiàng)11.如項(xiàng)1所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是測(cè)量以獲得基因表達(dá) 測(cè)量結(jié)果的基因表達(dá)水平。
[0041] 項(xiàng)12.如項(xiàng)11所述的方法，其中確定胚胎的所述發(fā)育潛力并且所述一個(gè)或多個(gè) 基因選自由下列組成的組：Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICERl、 TARBP2、CPEBl、Symplekin/SYMPK、YBX2、ZARl、CTNNBl、DNMT3B、TERT、YYl、IFGR2/IFNGR2、 BTF3 和 NELF。
[0042] 項(xiàng)13.如項(xiàng)11所述的方法，其中所述使用步驟包括將所述基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果與來(lái) 自參照胚胎或多潛能細(xì)胞的基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果相比較并且使用所述比較的結(jié)果以提供所 述人類胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的確定。
[0043] 項(xiàng)14.如項(xiàng)13所述的方法，其中確定胚胎的所述發(fā)育潛力并且相對(duì)于所述參照胚 胎在所述胚胎中一個(gè)或多個(gè)選自由下列組成的組的基因的較低表達(dá)水平指示不良發(fā)育潛 *:Cofillin、DIAPHl、ECT2、MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICERl、TARBP2、CPEBl、Symplekin/ SYMPK、YBX2、ZARl、CTNNBl、DNMT3B、TERT、YYl、IFGR2/IFNGR2、BTF3 和 NEF。
[0044] 項(xiàng)15. -種將人類胚胎或多潛能細(xì)胞相對(duì)于彼此分級(jí)的方法，其包括下列步驟：
[0045] (a)測(cè)量每個(gè)人類胚胎或多潛能細(xì)胞的至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得每個(gè)胚胎或多潛 能細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果；和
[0046] (b)使用來(lái)自所述胚胎或多潛能細(xì)胞中的每一個(gè)的所述至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié) 果以將所述人類胚胎或多潛能細(xì)胞相對(duì)于彼此分級(jí)。
[0047] 項(xiàng)16.如項(xiàng)15所述的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)是可通過(guò)時(shí)差顯微術(shù)測(cè)量 的。
[0048] 項(xiàng)17.如項(xiàng)16所述的方法，其中胚胎被分級(jí)并且所述至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)選自由下 列組成的組：
[0049] (i)胞質(zhì)分裂事件的持續(xù)時(shí)間；
[0050] (ii)胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和
[0051] (iii)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
[0052] 項(xiàng)18.如項(xiàng)17所述的方法，其中所述測(cè)量步驟還包括測(cè)量細(xì)胞周期1的持續(xù)時(shí) 間。
[0053] 項(xiàng)19.如項(xiàng)1所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是一個(gè)或多個(gè)基因的表 達(dá)水平。
[0054] 項(xiàng)20.如項(xiàng)19所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)基因選自由下列組成的組： Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICERl、TARBP2、CPEB1、Symplekin/ SYMPK、YBX2、ZARl、CTNNBl、DNMT3B、TERT、YYl、IFGR2/IFNGR2、BTF3 和 NELF。
[0055] 項(xiàng)21.如項(xiàng)15所述的方法，其中所述使用步驟通過(guò)將來(lái)自所述胚胎或多潛能細(xì)胞 中的每一個(gè)的所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果彼此相比較以確定所述胚胎或多潛能細(xì)胞相對(duì)于彼 此的發(fā)育潛力來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0056] 項(xiàng)22.如項(xiàng)15所述的方法，其中所述使用步驟通過(guò)下列來(lái)實(shí)現(xiàn)：將來(lái)自所述胚胎 或多潛能細(xì)胞中的每一個(gè)的所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自參照胚胎或多潛能細(xì)胞的細(xì)胞 參數(shù)測(cè)量結(jié)果相比較以確定每個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力；以及將每個(gè)胚胎或多潛能 細(xì)胞的發(fā)育潛力相比較以確定所述胚胎或多潛能細(xì)胞相對(duì)于彼此的發(fā)育潛力。
[0057] 項(xiàng)23. -種向雌性提供具有良好發(fā)育潛力的人類胚胎的方法，其包括下列步驟：
[0058] (a)在足以進(jìn)行胚胎發(fā)育的條件下培養(yǎng)一個(gè)或多個(gè)胚胎；
[0059] (b)測(cè)量所述一個(gè)或多個(gè)胚胎中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié) 果；
[0060] (C)使用所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以提供所述一個(gè)或多個(gè)胚胎的發(fā)育潛力的確定；
[0061] (d)將證實(shí)良好發(fā)育潛力的所述一個(gè)或多個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至需要其的雌性中。
[0062] 項(xiàng)24.如項(xiàng)23所述的方法，其中所述胚胎通過(guò)卵母細(xì)胞的體外受精來(lái)產(chǎn)生。
[0063] 項(xiàng)25.如項(xiàng)23所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體外成熟。
[0064] 項(xiàng)26.如項(xiàng)23所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟。
[0065] 項(xiàng)27.如項(xiàng)25所述的方法，其中體外成熟的卵母細(xì)胞用生長(zhǎng)因子補(bǔ)充。
[0066] 項(xiàng)28. -種用于將培養(yǎng)中的細(xì)胞自動(dòng)成像的設(shè)備，其包括：
[0067] (a)放置在孵育器內(nèi)部的多個(gè)顯微鏡；
[0068] (b)安排以聚焦在固定在臺(tái)上的培養(yǎng)皿上的每個(gè)顯微鏡；
[0069] (C)具有用于照明所述培養(yǎng)皿中的細(xì)胞的光源的每個(gè)顯微鏡；
[0070] (d)具有成像照相機(jī)的每個(gè)顯微鏡；
[0071] (e)用于隨時(shí)間儲(chǔ)存來(lái)自一個(gè)或多個(gè)照相機(jī)的圖像并且設(shè)置程序用于分析連續(xù)圖 像的計(jì)算機(jī)。
[0072] 項(xiàng)29.如項(xiàng)28所述的設(shè)備，其中所述光源提供暗視野照明。
[0073] 項(xiàng)30.如項(xiàng)28所述的設(shè)備，其中所述光源是紅色或近紅外的。
[0074] 項(xiàng)31. -種用于細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備，其包括：
[0075] (a)具有微孔的有蓋培養(yǎng)皿；
[0076] (b)有具有光學(xué)品質(zhì)光潔度的底表面的每個(gè)微孔；
[0077] (C)將微孔緊密安排在一起以致它們可共用一個(gè)培養(yǎng)基滴頭。
[0078] 項(xiàng)32.如項(xiàng)31所述的設(shè)備，其中外壁被設(shè)置在微孔周?chē)员闳菁{培養(yǎng)基滴頭。
[0079] 項(xiàng)33.如項(xiàng)31所述的設(shè)備，其中置信標(biāo)記被放置在所述微孔附近。
[0080] 項(xiàng)34?-種用于確定生長(zhǎng)的胚胎細(xì)胞或干細(xì)胞的發(fā)育潛力的系統(tǒng)，其包括：
[0081] (a)顯微鏡；
[0082] (b)從所述顯微鏡獲取圖像的成像照相機(jī)；
[0083] (C)用于儲(chǔ)存來(lái)自所述照相機(jī)的圖像的計(jì)算機(jī)；
[0084] (d)用于產(chǎn)生細(xì)胞的模型以便測(cè)量下列中的至少一個(gè)的軟件：（i)胞質(zhì)分裂的持 續(xù)時(shí)間，（ii)有絲分裂事件之間的時(shí)間。
[0085] 項(xiàng)35. -種用于將培養(yǎng)基中可運(yùn)動(dòng)的分裂細(xì)胞用顯微鏡成像的自動(dòng)方法，其中所 述分裂細(xì)胞被采樣為一系列具有像素的數(shù)碼圖像，其包括下列步驟：
[0086] (a)將像素的集合表示為所計(jì)算的形狀；
[0087] (b)通過(guò)擾動(dòng)所述所計(jì)算的形狀的值來(lái)預(yù)測(cè)歸因于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分裂的所述像素的 集合變化；
[0088] (C)從所預(yù)測(cè)的形狀產(chǎn)生模擬的圖像的集合；
[0089] (d)將所述模擬的圖像與所述真實(shí)的圖像比較；
[0090] (e)使用所述比較以確定所預(yù)測(cè)的形狀的準(zhǔn)確度。
[0091] 項(xiàng)36.如項(xiàng)35所述的方法，其中所述圖像模擬包括模擬一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞膜的輪 廓。
[0092] 項(xiàng)37.如項(xiàng)2所述的方法，其中所述多潛能細(xì)胞是卵母細(xì)胞并且所述一個(gè)或多個(gè) 細(xì)胞參數(shù)選自由下列組成的組：
[0093] (i)產(chǎn)生極體的胞質(zhì)分裂事件的持續(xù)時(shí)間；和
[0094] (i i)減數(shù)分裂細(xì)胞周期之間的時(shí)間間隔。
[0095] 附圖簡(jiǎn)述
[0096] 當(dāng)結(jié)合所附附圖閱讀時(shí)，從下列詳細(xì)描述最好地理解本發(fā)明。強(qiáng)調(diào)的是，根據(jù)慣 例，附圖的不同特征是不按比例的。相反，為了清楚不同特征的直徑是任意放大或縮小的。 附圖包括下列各圖。
[0097] 圖1是顯示用于評(píng)估胚胎的流程圖。
[0098] 圖2顯示6天的時(shí)間段的細(xì)胞卵裂和分裂的一系列照片。圖像被標(biāo)明第1天至第 6天。比例尺代表50 ym。
[0099] 圖3是顯示從1細(xì)胞胚胎（合子）成功發(fā)育為胚泡的百分比的柱狀圖。4個(gè)不同 實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，通過(guò)時(shí)差顯微術(shù)觀察總共100個(gè)胚胎直到第5天或第6天。顯示了達(dá)到每 個(gè)標(biāo)明的階段（8細(xì)胞、4至7細(xì)胞、2至3細(xì)胞和1細(xì)胞）的細(xì)胞的百分比。
[0100] 圖4是為了標(biāo)明的時(shí)期而關(guān)注的一系列三個(gè)不同的胚胎（頂部、中部和底部箭 頭）。
[0101] 圖5是顯示用于本評(píng)估的階段之間的時(shí)差的圖表，包括第一次胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí) 間，第一次和第二次分裂之間的時(shí)間（測(cè)量為胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始之間 的時(shí)間間隔）以及第二次和第三次有絲分裂之間的時(shí)間（測(cè)量為胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì) 分裂3的起始之間的時(shí)間間隔）。
[0102] 圖6是顯示一大組胚胎的三個(gè)事件的測(cè)量的3-D點(diǎn)圖，包括第一次胞質(zhì)分裂的持 續(xù)時(shí)間，第一次和第二次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間間隔（測(cè)量為胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂 2的開(kāi)始之間的時(shí)間間隔）以及第二次細(xì)胞和第三次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間間隔（測(cè)量為胞 質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí)間間隔）。達(dá)到胚泡階段的胚胎（用圓環(huán)標(biāo) 記）顯示在3-D圖上聚集在一起，而在達(dá)到胚泡前停滯的胚胎（用X標(biāo)記）分散各處。
[0103] 圖7是顯示用于使用3維形態(tài)學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)胚泡形成的接受者操作表征（ROC)曲線 的圖表。
[0104] 圖8是顯示來(lái)自6個(gè)停滯的1至2細(xì)胞胚胎和5個(gè)正常的1至2細(xì)胞胚胎的52 個(gè)基因的基因表達(dá)水平的雷達(dá)圖表。如通過(guò)曼-惠特尼檢驗(yàn)所確定的，正常和不正常胚胎 之間的表達(dá)水平上的差異對(duì)于以黃色加亮并且用星號(hào)指示的那些基因來(lái)說(shuō)是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯 著的。
[0105] 圖9是顯示停滯的2細(xì)胞胚胎和正常的2細(xì)胞胚胎中不同基因的表達(dá)水平的柱狀 圖。頂部顯示停滯的2細(xì)胞胚胎的選擇數(shù)量的時(shí)差圖像。
[0106] 圖10是顯示圖9中在停滯的4細(xì)胞胚胎和正常的4細(xì)胞胚胎中存在的相同基因 的比較的柱狀圖。頂部顯示停滯的4細(xì)胞胚胎的選擇數(shù)量的時(shí)差圖像。
[0107] 圖11是顯示具有4個(gè)不同模式的基因表達(dá)模式（ESSP)的一系列柱狀圖。標(biāo)明的 是胚胎基因活化（第2天）和第3天的典型表達(dá)之前的早期轉(zhuǎn)移的時(shí)機(jī)。
[0108] 圖12a_b顯示來(lái)自不同階段的單個(gè)卵裂球的基因的基因表達(dá)。a.來(lái)自標(biāo)繪在不 同細(xì)胞時(shí)期的單個(gè)卵裂球的兩個(gè)基因CTNNBl和CDX2的基因表達(dá)以及在不同階段例如2細(xì) 胞、3細(xì)胞、桑椹胚和胚泡這些基因表達(dá)水平上的變化。b.柱狀的基因表達(dá)標(biāo)記代表與來(lái)自 合子程序的基因表達(dá)比較的母體程序中的基因表達(dá)。
[0109] 圖13是用于使用時(shí)差圖像分析和有關(guān)的分子分析測(cè)定胚胎成活力的模型的圖。
[0110] 圖14是顯示體外卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)育的三個(gè)階段的一系列照片。
[0111] 圖15A-F是顯示體外卵母細(xì)胞成熟后胚胎發(fā)育的過(guò)程的一系列照片。
[0112] 圖16是顯示用于測(cè)定卵母細(xì)胞的程序的流程圖。
[0113] 圖17是顯示用于測(cè)定干細(xì)胞和多潛能干細(xì)胞的程序的流程圖。
[0114] 圖18a_e是顯示誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞分化為神經(jīng)元玫瑰花狀簇（rosette)的過(guò)程 的一系列照片。
[0115] 圖19是測(cè)定表達(dá)水平的基因可被分類的類別的表，包括每類別基因的數(shù)目。
[0116] 圖20是在141個(gè)正常發(fā)育的胚胎和單個(gè)卵裂球的基因表達(dá)分析中確定的四個(gè)胚 胎期特異模式（ESSP)和將所述基因分類至這些類別中的每一個(gè)的表。
[0117] 圖21a_e顯示證明成像參數(shù)預(yù)測(cè)胚泡形成的能力的自動(dòng)圖像分析。a顯示單個(gè)胚 胎的跟蹤算法的結(jié)果。b顯示被分析的一組14個(gè)胚胎。c顯示對(duì)胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間以及 第一次和第二次有絲分裂之間的時(shí)間的手動(dòng)圖像分析與自動(dòng)分析的比較。d顯示良好胚泡 形態(tài)學(xué)和不良胚泡形態(tài)學(xué)的比較。
[0118] 圖22是根據(jù)本發(fā)明的暗視野顯微鏡的概要圖；左邊的插圖顯示激光加工的暗視 野片裝置。
[0119] 圖23A-B是如圖22中所描述的三個(gè)顯微鏡的陣列的照片，裝載在支架上以便安裝 在孵育器中并用與電腦連接。圖23A顯示顯微鏡而圖23B顯示顯微鏡內(nèi)部孵育器。
[0120] 圖24是在本操作中使用的圖像捕獲軟件的屏幕截圖，顯示從3個(gè)通道成像的胚 胎。
[0121] 圖25(a)_(d)是顯示來(lái)自實(shí)驗(yàn)2,位置2的所選擇的時(shí)差圖像的一系列四張照片。 圖25(a)和25(b)是在培養(yǎng)基更換前捕獲的圖像而圖25(c)和25(d)是在培養(yǎng)基更換后捕 獲的圖像。
[0122] 圖26(a)_(d) (a)和（b)是顯示正常和不正常胚胎的細(xì)胞活性的圖表（左）和照 片（右）。圖26 (a)和26 (b) -起顯示在第3天胚胎具有相似的形態(tài)學(xué)但是它們的細(xì)胞活 性曲線圖卻完全不同并且它們中僅一個(gè)發(fā)育為胚泡。
[0123] 圖27A-B是具有微孔的定制有蓋培養(yǎng)皿的圖。圖27A顯示具有不同維數(shù)的培養(yǎng)皿 的圖而圖27B顯示微孔的3-D視圖。
[0124] 圖28(a)_(b)是顯示具有和不具有前期圖像配準(zhǔn)的細(xì)胞活性的圖表。圖28(a)和 28(b) -起顯示配準(zhǔn)凈化了結(jié)果并且除去歸因于胚胎移位或旋轉(zhuǎn)的峰。
[0125] 圖29(a)_(b)是顯示正常和不正常胚胎的細(xì)胞活性的圖表（左）和細(xì)胞照片 (右）。圖29(a)和圖29(b) -起顯示在第三天胚胎具有相似的形態(tài)學(xué)但是它們的細(xì)胞活 性曲線圖卻完全不同并且它們中僅一個(gè)發(fā)育為胚泡。
[0126] 圖30是顯示胚胎發(fā)育期間連續(xù)成對(duì)圖像之間的像素強(qiáng)度的差異的圖表。這可被 獨(dú)立使用以測(cè)定胚胎成活力或作為通過(guò)確定應(yīng)當(dāng)使用多少粒子（預(yù)測(cè)的胚胎模型）改善其 他算法例如粒子濾波器的方法。
[0127] 圖31A-G是顯示不同細(xì)胞階段的來(lái)自2D跟蹤的結(jié)果的一系列七張照片。細(xì)胞過(guò) 程通過(guò)與每個(gè)照片對(duì)相關(guān)聯(lián)的幀序號(hào)標(biāo)明：15幀（圖31A)、45 (B)、48 (C)、189 (D)、190 (E)、 196(F)和234(G)。底部箭頭顯示所覆蓋的模擬圖像。輪廓是可見(jiàn)的細(xì)胞膜而白色虛線是 閉塞的膜。每5分鐘捕獲圖像幀并且僅展示了一些。
[0128] 圖32A-B是顯示3D細(xì)胞跟蹤的兩個(gè)成功實(shí)例的一系列照片和圖。在胚胎的每張 照片下的說(shuō)明顯示3D模型的俯視圖，除了幀314和幀228,其分別在幀314和幀228中顯示 模型的側(cè)視圖。每5分鐘捕獲圖像幀。
[0129] 圖33是1細(xì)胞至2細(xì)胞分裂的粒子濾波器結(jié)果的圖解表示。數(shù)據(jù)點(diǎn)是細(xì)胞中心 的3D定位。點(diǎn)顯示1細(xì)胞模型、2細(xì)胞模型、3細(xì)胞模型和4細(xì)胞模型。頂部箭頭顯示預(yù)測(cè) 之后的粒子而底部箭頭顯示重采樣之后的粒子。
[0130] 圖34A-B是顯示對(duì)一組14個(gè)胚胎的自動(dòng)與手動(dòng)分析的對(duì)比的圖表。圖34A顯示 第一次胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間的對(duì)比而圖34B顯示第一次和第二次有絲分裂之間的時(shí)間的 對(duì)比。
[0131] 圖35是顯示圖像分析如何被用于模型胚胎并且測(cè)量某些形態(tài)學(xué)參數(shù)的流程圖。
[0132] 發(fā)明詳述
[0133] 在描述本方法和組合物之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體方法和 組合物，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，在本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施 方案的目的，而不意為限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求限定
[0134] 當(dāng)提供數(shù)值的范圍時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，在所述范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間 值（自到所述下限的單位的十分之一，除上下文以其他方式明確地說(shuō)明以外）也被特別地 公開(kāi)。在指定的范圍內(nèi)的任何指定的值或中間值與在該指定的范圍內(nèi)任何其它指定的值或 中間值之間的每個(gè)更小的范圍包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些更小的范圍的上限和下限可 以獨(dú)立地包括或排除在所述更小的范圍之內(nèi)，任一、無(wú)一或兩個(gè)限值包括在所述更小的范 圍之內(nèi)時(shí)的每個(gè)范圍也包含本發(fā)明的范圍內(nèi)，并受在所指定的范圍內(nèi)特別排除任何值的限 制。當(dāng)指定的范圍包括兩個(gè)限值之一或兩者時(shí)，排除了所包括的限值之一或兩者的范圍也 包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0135] 除另外定義以外，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】普 通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。盡管類似于或等同于在本文描述的那些的任何方法和 材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但現(xiàn)在描述了一些可能的和優(yōu)選的方法和材料。在本 文中提及的所有出版物通過(guò)引用并入本文以公開(kāi)和描述與所述出版物所引用的相關(guān)的方 法和/或材料。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)存在矛盾時(shí)，本公開(kāi)內(nèi)容替代所并入的出版物的任何公 開(kāi)。
[0136] 必須注意的是，如在本文和在附隨的權(quán)利要求中使用的，除上下文中以其他方式 明確說(shuō)明以外，單數(shù)形式"一（a)"、"一（an)"和"該（the)"，包括復(fù)數(shù)的指稱對(duì)象。因此， 例如，提及"一個(gè)細(xì)胞"包括多個(gè)這樣的細(xì)胞，提及"該肽"包括提及一種或多種肽和本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的其等價(jià)物，例如多肽，等等。
[0137] 本文討論的出版物僅為了其在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩暗墓_(kāi)而提供。此處不應(yīng)解釋為 承認(rèn)本發(fā)明沒(méi)有權(quán)利憑借在先發(fā)明而先于上述出版物。此外，所提供的出版物的日期可能 不同于實(shí)際的出版日期，其可能需要被各自確認(rèn)。
[0138] 定義
[0139] 提供了用于確定一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力和/或一個(gè)或多個(gè)胚 胎或多潛能細(xì)胞中染色體異常的存在的方法、組合物和試劑盒。這些方法、組合物和試劑盒 在體外確定在治療人類中的不育癥中最有用的胚胎和卵母細(xì)胞中有用。本發(fā)明的這些和其 他的對(duì)象、優(yōu)點(diǎn)和特征對(duì)本領(lǐng)域那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在閱讀如下文更加全面地描述的主題方 法和組合物的細(xì)節(jié)時(shí)變得顯而易見(jiàn)。
[0140] 術(shù)語(yǔ)"發(fā)育潛力"和"發(fā)育感受態(tài)"被用于本文意指健康胚胎或多潛能細(xì)胞生長(zhǎng)或 發(fā)育的能力（ability)或能力（capacity)。
[0141] 術(shù)語(yǔ)"胚胎"本文被用于意指當(dāng)兩個(gè)單倍體配子細(xì)胞例如未受精的次級(jí)卵母細(xì)胞 和精子結(jié)合以形成二倍體全能細(xì)胞例如合子時(shí)形成的合子和由緊接隨后的直到桑椹胚即 16細(xì)胞階段和胚泡階段的細(xì)胞分裂例如胚胎卵裂（分化的滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）產(chǎn)生的 胚胎兩者。
[0142] 術(shù)語(yǔ)"多潛能細(xì)胞"本文被用于意指具有分化為生物體中多種類型的細(xì)胞的能力 的任何細(xì)胞。多潛能細(xì)胞的實(shí)例包括干細(xì)胞卵母細(xì)胞和1細(xì)胞胚胎（即合子）。
[0143] 術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞"本文被用于意指細(xì)胞或細(xì)胞群，其：(a)具有自我更新的能力和（b) 具有產(chǎn)生不同的分化的細(xì)胞類型的潛力。通常，干細(xì)胞具有產(chǎn)生多重譜系的細(xì)胞的潛力。 如本文所用的，干細(xì)胞可以是全能干細(xì)胞，例如受精的卵母細(xì)胞，其產(chǎn)生生物體的所有的胚 胎和胚外組織；多潛能干細(xì)胞，例如胚胎干（ES)細(xì)胞，胚胎胚（EG)細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干 (iPS)細(xì)胞，其產(chǎn)生生物體的所有胚胎組織，即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層譜系；多能干細(xì)胞， 例如間質(zhì)干細(xì)胞，其產(chǎn)生生物體的胚胎組織中的至少兩種，即，內(nèi)胚層、中胚層和外胚層譜 系中的至少兩種或其可以是組織特異性干細(xì)胞，其產(chǎn)生特定組織的多種類型的分化細(xì)胞。 組織特異性干細(xì)胞包括產(chǎn)生特定組織的細(xì)胞的組織特異性胚胎細(xì)胞和位于成年組織中并 且可產(chǎn)生這一組織的細(xì)胞的體干細(xì)胞，例如產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞、 產(chǎn)生骨骼肌的衛(wèi)星細(xì)胞和產(chǎn)生造血系統(tǒng)的所有細(xì)胞的造血干細(xì)胞。
[0144] 術(shù)語(yǔ)"卵母細(xì)胞"本文被用于意指未受精的雌性卵母細(xì)胞或配子。本申請(qǐng)的卵母 細(xì)胞可以是初級(jí)卵母細(xì)胞，在這種情況下它們被放置通過(guò)或正在通過(guò)減數(shù)分裂I，或次級(jí)卵 母細(xì)胞，在這種情況下它們被放置通過(guò)或正在通過(guò)減數(shù)分裂II。
[0145] "減數(shù)分裂"意指導(dǎo)致配子產(chǎn)生的細(xì)胞周期事件。在第一次減數(shù)分裂細(xì)胞周期或 減數(shù)分裂I中，細(xì)胞的染色體被復(fù)制并且分至兩個(gè)子細(xì)胞中。之后這些子細(xì)胞在并未伴隨 DNA合成的第二次減數(shù)分裂細(xì)胞周期或減數(shù)分裂II中分離，產(chǎn)生具有單倍體數(shù)的染色體的 配子。
[0146] "生發(fā)泡"階段意指與減數(shù)分裂I細(xì)胞周期的前期I有關(guān)的初級(jí)卵母細(xì)胞的成熟的 階段，即在核質(zhì)的第一次分裂之前。這一時(shí)期的卵母細(xì)胞也稱為"生發(fā)泡卵母細(xì)胞"，因?yàn)樘?有地巨大細(xì)胞核，稱為生發(fā)泡。在體外培養(yǎng)的正常的人類卵母細(xì)胞中，生發(fā)泡在成熟開(kāi)始后 約6-24小時(shí)發(fā)生。
[0147] "中期I"階段意指與減數(shù)分裂I細(xì)胞周期的中期I有關(guān)的初級(jí)卵母細(xì)胞的成熟的 階段。與生發(fā)泡卵母細(xì)胞相比，中期I卵母細(xì)胞沒(méi)有大的，清楚界定的細(xì)胞核。在體外培養(yǎng) 的正常的人類卵母細(xì)胞中，中期I在成熟開(kāi)始后約12-36小時(shí)發(fā)生。
[0148] "中期II"階段意指與減數(shù)分裂II細(xì)胞周期的中期II有關(guān)的次級(jí)卵母細(xì)胞的成 熟的階段。中期II是可通過(guò)第一極體的排出辨別的。在體外培養(yǎng)的正常的人類卵母細(xì)胞 中，中期II在成熟開(kāi)始后約24-48小時(shí)發(fā)生。
[0149] "有絲分裂細(xì)胞周期"意指細(xì)胞中導(dǎo)致細(xì)胞的染色體的復(fù)制以及將這些染色體和 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)分至兩個(gè)子細(xì)胞中的事件。有絲分裂細(xì)胞周期分為兩個(gè)時(shí)期：分裂間期和有 絲分裂。在分裂間期，細(xì)胞生長(zhǎng)并且復(fù)制其DNA。在有絲分裂中，細(xì)胞起始并且完成細(xì)胞分 裂，首先分隔其核質(zhì)并且之后將其胞質(zhì)和其分隔的核質(zhì)（胞質(zhì)分裂）分到兩個(gè)分離的細(xì)胞 中。
[0150] "第一次有絲分裂細(xì)胞周期"或"細(xì)胞周期1"意指從受精至第一次胞質(zhì)分裂事件 即受精的卵母細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的時(shí)間間隔。在卵母細(xì)胞被體外受精的實(shí)例中，注射 人絨毛膜促性腺激素（HCG)(通常在卵母細(xì)胞提取前施用）至第一次胞質(zhì)分裂時(shí)間完成之 間的時(shí)間間隔可用作替代的時(shí)間間隔。
[0151] "第二次有絲分裂細(xì)胞周期"或"細(xì)胞周期2"意指在胚胎中觀察到的第二次細(xì)胞 周期事件，通過(guò)有絲分裂從受精的卵母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞和通過(guò)有絲分裂從這些子細(xì)胞中的 一個(gè)（"前導(dǎo)子細(xì)胞"或子細(xì)胞A)的產(chǎn)生第一組第三代細(xì)胞（granddaughter cell)之間 的時(shí)間間隔，當(dāng)完成細(xì)胞周期2時(shí)，胚胎由3個(gè)細(xì)胞組成。換句話說(shuō)，細(xì)胞周期2可以直觀 地確定為包含2細(xì)胞的胚胎和包含3細(xì)胞的胚胎之間的時(shí)間。
[0152] "第三次有絲分裂細(xì)胞周期"或"細(xì)胞周期3"意指在胚胎中觀察到的第三次細(xì)胞 周期事件，通常是通過(guò)有絲分裂從受精的卵母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞至通過(guò)有絲分裂從第二子細(xì) 胞中的一個(gè)（"延遲子細(xì)胞"或子細(xì)胞B)產(chǎn)生第二組第三代細(xì)胞時(shí)間間隔，當(dāng)完成細(xì)胞周 期3時(shí)，胚胎由4個(gè)細(xì)胞組成。換句話說(shuō)，細(xì)胞周期3可以直觀地確定為包含3細(xì)胞的胚胎 和包含4細(xì)胞的胚胎之間的時(shí)間。
[0153] "第一次卵裂事件"意指第一次分裂，S卩，卵母細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞，即細(xì)胞周期 1。當(dāng)?shù)谝淮温蚜咽录瓿蓵r(shí)，胚胎由2細(xì)胞組成。
[0154] "第二次卵裂事件"意指第二組分裂，S卩，前導(dǎo)子細(xì)胞分裂為兩個(gè)第三代子細(xì)胞和 延遲子細(xì)胞分裂為兩個(gè)第三代子細(xì)胞。換句話說(shuō)，第二次卵裂事件由細(xì)胞周期2和細(xì)胞周 期3兩者組成。當(dāng)?shù)诙温蚜咽录瓿蓵r(shí)，胚胎由4細(xì)胞組成。
[0155] "第三次卵裂事件"意指第三組分裂，即，所有第三代子細(xì)胞的分裂。當(dāng)?shù)谌温蚜?事件完成時(shí)，胚胎由8細(xì)胞組成。
[0156] "胞質(zhì)分裂"或"細(xì)胞分裂"意指細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞分裂的有絲分裂的時(shí)期。換句話說(shuō)， 其是細(xì)胞的分隔的核質(zhì)和其胞質(zhì)被分開(kāi)以產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞的有絲分裂的階段。胞質(zhì)分裂的 時(shí)間段可被確定為當(dāng)細(xì)胞膜的收縮（"卵裂溝"）被首次觀察到時(shí)和這一收縮事件的結(jié)束即 兩個(gè)子細(xì)胞產(chǎn)生之間的時(shí)間段或窗口。卵裂溝的起始可以直觀地確定為細(xì)胞膜的曲率從凸 的（向外的圓形的）變?yōu)榘嫉模ㄏ蚶飶澢哂邪己刍虬既耄┑狞c(diǎn)。這通過(guò)點(diǎn)在2個(gè)卵裂溝 處的白色箭頭描述于圖4頂部組。細(xì)胞延長(zhǎng)的起始同樣可用于標(biāo)記胞質(zhì)分裂的起始，在這 種情況下胞質(zhì)分裂的時(shí)間段被定義為細(xì)胞延長(zhǎng)的起始和細(xì)胞分裂的結(jié)束之間的時(shí)間段。
[0157] "第一次胞質(zhì)分裂"或"胞質(zhì)分裂1"意指受精之后的第一次細(xì)胞分裂事件，即受精 的卵母細(xì)胞分裂以產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞。第一次細(xì)胞分裂通常發(fā)生在受精后一天。
[0158] "第二次胞質(zhì)分裂"或"胞質(zhì)分裂2"意指在胚胎中觀察到的第二次細(xì)胞分裂事件， 即受精的卵母細(xì)胞分裂的一個(gè)子細(xì)胞（"前導(dǎo)子細(xì)胞"或子代A)分裂為第一組兩個(gè)第三代。
[0159] "第三次胞質(zhì)分裂"或"胞質(zhì)分裂3"意指在胚胎中觀察到的第三次細(xì)胞分裂事件， 即受精的卵母細(xì)胞分裂的另一個(gè)子細(xì)胞（"延遲子細(xì)胞"或子代B)分裂為第二組兩個(gè)第三 代。
[0160] 術(shù)語(yǔ)"基信標(biāo)記（fiduciary marker)"或"基準(zhǔn)標(biāo)記"在成像系統(tǒng)的視野領(lǐng)域中使 用的物品，其出現(xiàn)在所產(chǎn)生的圖像中，被用作參考的點(diǎn)或度量。其可以是被放置在成像對(duì)象 中或之上的某物或在光學(xué)儀器的十字線中的一個(gè)或一組標(biāo)記物。
[0161] 術(shù)語(yǔ)"微孔"是指細(xì)胞水平大小的容器，優(yōu)選地提供用于接納單個(gè)真核細(xì)胞。
[0162] 感興趣的多潛能細(xì)朐和杯胎
[0163] 在本發(fā)明的方法中，通過(guò)測(cè)量一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參 數(shù)并將這些測(cè)量用于確定所述胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力來(lái)測(cè)定所述胚胎或多潛能細(xì) 胞的發(fā)育潛力。由此產(chǎn)生的信息可被用于指導(dǎo)臨床決策，例如是否轉(zhuǎn)移受精的胚胎，是否植 入培養(yǎng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。
[0164] 可通過(guò)本發(fā)明的方法測(cè)定的胚胎的實(shí)例包括1細(xì)胞胚胎（也稱為合子）、2細(xì)胞胚 胎、3細(xì)胞胚胎、4細(xì)胞胚胎、5細(xì)胞胚胎、6細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞胚胎等等，通常高達(dá)16細(xì)胞胚胎 并且包括16細(xì)胞胚胎，其中的任一種可通過(guò)任何方便的方式從例如已經(jīng)體內(nèi)成熟的卵母 細(xì)胞或已經(jīng)體外成熟的卵母細(xì)胞產(chǎn)生。
[0165] 可通過(guò)本發(fā)明的方法測(cè)定的多潛能細(xì)胞的實(shí)例包括全能干細(xì)胞例如卵母細(xì)胞諸 如初級(jí)卵母細(xì)胞和次級(jí)卵母細(xì)胞；多潛能干細(xì)胞例如ES細(xì)胞、EG細(xì)胞、iPS細(xì)胞和類似細(xì) 胞；多能細(xì)胞，例如間質(zhì)干細(xì)胞和組織特異性干細(xì)胞。它們可以來(lái)自生命的任何階段，例如 胚胎的、新生期的、少年的、成年的和任何性別，即XX或XY。
[0166] 胚胎和多潛能細(xì)胞可來(lái)源于任何生物體，例如任何哺乳細(xì)胞種類例如人類、靈長(zhǎng) 類動(dòng)物、馬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物、豬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物等。優(yōu)選地，它們來(lái)源于人類。 它們可以是之前被冷凍的，例如，1細(xì)胞階段的冷凍保存并且之后解凍的胚胎或冷凍并解凍 的卵母細(xì)胞和干細(xì)胞?？蛇x擇地，它們可以是新鮮制備的，例如，通過(guò)體外受精技術(shù)從卵母 細(xì)胞新鮮制備的胚胎；通過(guò)體外成熟技術(shù)新鮮采集和/或新鮮成熟或者來(lái)源于體外分化為 生殖細(xì)胞并且成熟為卵母細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞的卵母細(xì)胞；通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從組織 的解離和培養(yǎng)新鮮制備的干細(xì)胞以及類似細(xì)胞。它們可在本領(lǐng)域中已知的任何適合的條 件下培養(yǎng)以促進(jìn)有待被測(cè)定的樣品的存活、生長(zhǎng)和/或發(fā)育，例如對(duì)于胚胎，在例如體外受 精領(lǐng)域中所用的那些的條件下；參見(jiàn)例如美國(guó)專利第6, 610, 543號(hào)、美國(guó)專利第6, 130, 086 號(hào)、美國(guó)專利第5, 837, 543號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文；對(duì)于卵母細(xì)胞，在例如本領(lǐng) 域中所用的以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的那些的條件下；參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5, 882, 928號(hào)和美 國(guó)專利第6, 281，013號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文；對(duì)于干細(xì)胞，在例如本領(lǐng)域中所用 的以促進(jìn)增殖的那些的條件下；參見(jiàn)例如美國(guó)專利第6, 777, 233號(hào)、美國(guó)專利第7037892 號(hào)、美國(guó)專利第7, 029, 913號(hào)、美國(guó)專利第5, 843, 780號(hào)和美國(guó)專利第6, 200, 806號(hào)、美國(guó) 專利申請(qǐng)第2009/0047263號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)第2009/0068742號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入 本文。通常，胚胎/多潛能細(xì)胞在配合所測(cè)定的特定胚胎/多潛能細(xì)胞的需要已經(jīng)補(bǔ)充了 血清或血清物質(zhì)、氨基酸和生長(zhǎng)因子的商業(yè)上可得的培養(yǎng)基例如KnockOut DMEM、DMEM-F12 或Iscoves改良杜爾貝可培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0167] 時(shí)差成像分析
[0168] 在一些實(shí)施方案中，胚胎/多潛能細(xì)胞通過(guò)經(jīng)由時(shí)差成像測(cè)量細(xì)胞參數(shù)來(lái)測(cè)定。 胚胎/多潛能細(xì)胞可在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。可選擇地胚胎/多潛能細(xì)胞可在定制培養(yǎng)皿例 如具有如本文描述的光學(xué)品質(zhì)的微孔的定制培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在這些定制培養(yǎng)皿中，每個(gè)微 孔裝有一個(gè)單個(gè)的胚胎/多潛能細(xì)胞并且每個(gè)微孔的底部表面具有光學(xué)品質(zhì)光潔度以致 單個(gè)皿中的整組胚胎可通過(guò)具有足夠分辨率的單個(gè)小型顯微鏡同時(shí)成像以跟隨細(xì)胞有絲 分裂過(guò)程。整組的微孔共享培養(yǎng)皿中同一個(gè)培養(yǎng)基滴頭（drop)并且還可包括放置在微孔 周?chē)挠糜诜€(wěn)定培養(yǎng)基滴頭的外部孔以及鄰近微孔放置的基準(zhǔn)標(biāo)記物。可用等離子刻蝕或 另一種處理調(diào)整表面的疏水性以防止用培養(yǎng)基充滿時(shí)微孔中形成氣泡。無(wú)論使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 皿還是定制培養(yǎng)皿，培養(yǎng)期間，可在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)或多個(gè)發(fā)育的胚胎，例如每皿可 培養(yǎng)1個(gè)至30個(gè)之間的胚胎。
[0169] 隨時(shí)間獲取圖像并且之后分析圖像以取得一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量?？捎醚b配 用于數(shù)字圖像存儲(chǔ)和分析的任何計(jì)算機(jī)控制的顯微鏡例如裝配加熱臺(tái)和培養(yǎng)箱的倒置顯 微鏡或適于常規(guī)孵育器內(nèi)部的定制微型顯微鏡陣列進(jìn)行時(shí)差成像。微型顯微鏡的陣列使得 在同一孵育器中的多個(gè)皿的樣品能夠同時(shí)培養(yǎng)并且大小可調(diào)節(jié)以適應(yīng)多個(gè)通道而對(duì)連續(xù) 圖像捕獲之間的最小時(shí)間間隔沒(méi)有限制。使用多個(gè)顯微鏡消除了移動(dòng)樣品的需要，其增加 了系統(tǒng)準(zhǔn)確度和整個(gè)系統(tǒng)的可靠性。孵育器中的單個(gè)顯微鏡可以是部分或全部分離的，為 每個(gè)培養(yǎng)皿提供自身的控制的環(huán)境。這允許皿被轉(zhuǎn)移至成像位置或從成像位置轉(zhuǎn)移而不影 響其他樣品的環(huán)境。
[0170] 用于時(shí)差成像的成像系統(tǒng)可使用亮視野照明、暗視野照明、相位對(duì)比、霍夫曼調(diào)制 相襯（Hoffman modulation contrast)、微差干涉對(duì)比或突光。在一些實(shí)施方案中，暗視野 照明可被用來(lái)為隨后的特征提取和圖像分析提供增強(qiáng)的圖像對(duì)比。此外，紅色或近紅外光 源可被用來(lái)減少光毒性并且提高細(xì)胞膜和細(xì)胞的內(nèi)部部分之間的對(duì)比度。
[0171] 所獲取的圖像可在連續(xù)基底上儲(chǔ)存在活動(dòng)視頻中或在間斷基底上（如在時(shí)差照 相術(shù)中），其中對(duì)象被反復(fù)成像在靜止的照片上。優(yōu)選地，圖像之間的時(shí)間間隔應(yīng)在1至30 分鐘之間以便捕獲如下文所描述的重要的形態(tài)學(xué)事件。在可選擇的實(shí)施方案中，圖像之間 的時(shí)間間隔可取決于細(xì)胞活性的量而變化。例如，在活性期間，可以每幾秒或每分鐘這么頻 繁地獲取圖像，而在非活性期間，可以每10或15分鐘或更久地獲取圖像。對(duì)所捕獲的圖像 的實(shí)時(shí)圖像分析可被用于檢測(cè)什么時(shí)候和如何變化時(shí)間間隔。在我們的方法中，樣品接收 的光的總量估計(jì)等于5天成像大約24分鐘的連續(xù)低水平曝光。用于時(shí)差成像系統(tǒng)的光強(qiáng) 度比通常用于輔助生殖顯微鏡的光強(qiáng)度低得多，歸因于LED的低功率（例如使用相比于通 常100W鹵素?zé)襞莸腎W LED)和照相機(jī)傳感器的高敏感度。因此，使用時(shí)差成像系統(tǒng)由胚胎 接收到的光能量的總量能夠與IVF臨床的常規(guī)操作期間接收到的能量的量差不多或更少。 此外，曝光時(shí)間可顯著縮短以減少對(duì)胚胎/多潛能細(xì)胞的曝光的總量。對(duì)于2天的成像，在 每5分鐘以0. 5秒曝光/圖像捕獲圖像的情況下，低水平曝光的總量小于5分鐘。
[0172] 圖像采集之后，提取并分析圖像的不同的細(xì)胞參數(shù)例如大小，透明帶的厚度、破碎 的程度，從細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞的對(duì)稱性、前幾次有絲分裂之間的時(shí)間間隔和胞質(zhì)分裂 的持續(xù)時(shí)間。
[0173] 可通過(guò)時(shí)差成像測(cè)量的細(xì)胞參數(shù)通常是形態(tài)學(xué)事件。例如，在測(cè)定胚胎時(shí)，時(shí)差成 像可被用于測(cè)量胞質(zhì)分裂事件例如胞質(zhì)分裂1、胞質(zhì)分裂2、胞質(zhì)分裂3、胞質(zhì)分裂4的持續(xù) 時(shí)間，其中胞質(zhì)分裂事件的持續(xù)時(shí)間定義為首次觀察到卵裂溝（胞質(zhì)分裂的起始）和卵裂 溝分離為兩個(gè)子細(xì)胞（即兩個(gè)子細(xì)胞的產(chǎn)生）之間的時(shí)間間隔。感興趣的另一個(gè)參數(shù)是細(xì) 胞周期事件例如細(xì)胞周期1、細(xì)胞周期2、細(xì)胞周期3或細(xì)胞周期4的持續(xù)時(shí)間，其中細(xì)胞周 期事件的持續(xù)時(shí)間被定義為一個(gè)細(xì)胞（對(duì)于細(xì)胞周期1來(lái)說(shuō)，卵子的受精；對(duì)于之后的細(xì)胞 周期來(lái)說(shuō)，在胞質(zhì)分裂結(jié)束時(shí)）的產(chǎn)生和來(lái)自這一細(xì)胞的兩個(gè)子細(xì)胞的產(chǎn)生之間的時(shí)間間 隔。可通過(guò)時(shí)差成像測(cè)量的感興趣的其他細(xì)胞參數(shù)包括由這些細(xì)胞事件定義的時(shí)間間隔， 例如（a)胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔，可定義為胞質(zhì)分裂1的起始和胞質(zhì)分 裂2的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的 起始和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的起始之間的間隔 的任一個(gè)；或者（b)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔，可定義為胞質(zhì)分裂2的起始 和胞質(zhì)分裂3的起始之間的間隔、或胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束之間的間隔、或 胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞質(zhì)分裂3的起 始之間的間隔的任一個(gè)。
[0174] 為了體外受精的目的，被認(rèn)為是有利的發(fā)育中早期例如第2天或第3天即直到8 細(xì)胞階段將胚胎轉(zhuǎn)移至子宮以減少胚胎損失（歸因于培養(yǎng)條件相對(duì)于體外環(huán)境的缺點(diǎn)）并 減少與可在培養(yǎng)期間發(fā)生的后生錯(cuò)誤有關(guān)的可能的不良后果（Katari等人（2009)Hum Mol Genet. 18(20):3769-78 ;Septilveda等人（2009)Fertil Steril. 91 (5): 1765-70)。因此，優(yōu) 選的是，盡管分析的時(shí)間較長(zhǎng)，例如約36小時(shí)、約54小時(shí)、約60小時(shí)、約72小時(shí)、約84小 時(shí)、約96小時(shí)或更長(zhǎng)，本方法同樣預(yù)期在受精的2天中發(fā)生的細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量。
[0175] 可通過(guò)時(shí)差成像測(cè)定的正在成熟的卵母細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)的實(shí)例包括但不限于卵 母細(xì)胞細(xì)胞膜的形態(tài)學(xué)上的變化，例如從透明帶分離的速度和程度；卵母細(xì)胞細(xì)胞核的形 態(tài)學(xué)上的變化，例如胚泡破裂（GVBD)的起始、完成和速度；細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中顆粒的運(yùn)動(dòng) 速度和方向；卵母細(xì)胞和第一極體的胞質(zhì)分裂以及第一極體的排出的運(yùn)動(dòng)和/或持續(xù)時(shí) 間。其他的參數(shù)包括成熟次級(jí)卵母細(xì)胞和第二極體的胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間。
[0176] 可通過(guò)時(shí)差成像測(cè)定的干細(xì)胞或干細(xì)胞群中的細(xì)胞參數(shù)的實(shí)例包括但不限于胞 質(zhì)分裂事件的持續(xù)時(shí)間，胞質(zhì)分裂事件之間的時(shí)間，胞質(zhì)分裂事件之前和過(guò)程中干細(xì)胞的 大小和形狀、由胞質(zhì)分裂事件產(chǎn)生的子細(xì)胞的數(shù)目、卵裂溝的空間定向、所觀察到的非對(duì)稱 分裂的速度和/或數(shù)目（即其中一個(gè)子細(xì)胞保持干細(xì)胞而其他的分化）、所觀察到的對(duì)稱分 裂的速度和/或數(shù)目（即其中兩個(gè)子細(xì)胞都保持干細(xì)胞或都分化）以及胞質(zhì)分裂事件的結(jié) 束和當(dāng)干細(xì)胞開(kāi)始分化之間的時(shí)間間隔。
[0177] 參數(shù)可手動(dòng)測(cè)量或者它們可被自動(dòng)測(cè)量，例如通過(guò)圖像分析軟件。當(dāng)使用圖像分 析軟件時(shí)，可以使用利用以序貫蒙特卡羅方法為基礎(chǔ)的隨機(jī)模型估算技術(shù)的圖像分析算 法，例如產(chǎn)生假定的胚胎/多潛能細(xì)胞模型的分布，以簡(jiǎn)單的光學(xué)模型為基礎(chǔ)模擬圖像并 將這些模擬與觀察到的圖像數(shù)據(jù)比較。當(dāng)使用這樣的隨機(jī)模型估算時(shí)，細(xì)胞可以被建模為 任何適合的形狀，例如2D空間中的橢圓的集合，3D空間中的橢圓體的集合以及類似形狀。 為了處理遮擋和深度不確定性，方法可實(shí)行相應(yīng)于所期望的實(shí)體行為的幾何約束。為了提 高魯棒性，可在一個(gè)或多個(gè)焦平面上捕獲圖像。
[0178] 某因表汰分析
[0179] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量基因表達(dá)測(cè)定胚胎或多潛能細(xì)胞。在這些實(shí)施方案 中，細(xì)胞參數(shù)是基因表達(dá)水平或基因表達(dá)譜。測(cè)定一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，即獲得表達(dá)譜或 表達(dá)評(píng)估，可通過(guò)測(cè)量感興趣的一個(gè)或多個(gè)基因的核酸轉(zhuǎn)錄物（例如mRNA)例如核酸表達(dá) 譜進(jìn)行；或通過(guò)測(cè)量為感興趣的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)不同蛋白/多肽 的水平即蛋白組表達(dá)譜來(lái)進(jìn)行。換句話說(shuō)，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)譜"和"表達(dá)評(píng)估"被寬泛使用以包 括RNA水平或蛋白水平的基因表達(dá)譜。
[0180] 在一些實(shí)施方案中，基因的表達(dá)可通過(guò)獲得核酸表達(dá)譜來(lái)估計(jì)，其中確定樣品中 的一種或多種核酸的量或水平，例如感興趣的一種或多種基因的核酸轉(zhuǎn)錄物。在這些實(shí)施 方案中，被測(cè)定以產(chǎn)生表達(dá)譜的樣品是核酸樣品。核酸樣品包括多個(gè)或一群不同核酸，其包 括正被評(píng)估的胚胎或細(xì)胞的感興趣的基因的表達(dá)信息。核酸可包括RNA或DNA核酸，例如 mRNA、 CRNA、cDNA等，只要樣品保留其所獲得自的宿主細(xì)胞或組織的表達(dá)信息。樣品可以許 多不同方式制備，如本領(lǐng)域中已知的，例如通過(guò)從細(xì)胞分離mRNA，其中所分離的mRNA如在 差異表達(dá)領(lǐng)域中已知的被用來(lái)擴(kuò)增、使用以制備cDNA、cRNA等。使用標(biāo)準(zhǔn)程序，樣品可從單 個(gè)細(xì)胞制備，例如感興趣的多潛能細(xì)胞的培養(yǎng)基的多潛能細(xì)胞或來(lái)自感興趣的胚胎的單個(gè) 細(xì)胞（卵裂球）；或來(lái)自幾個(gè)細(xì)胞，例如多潛能細(xì)胞的培養(yǎng)基的一部分或感興趣的胚胎的2、 3、或4或者更多個(gè)卵裂球。
[0181] 表達(dá)譜可使用任何常規(guī)程序從初始核酸樣品產(chǎn)生。當(dāng)產(chǎn)生表達(dá)譜的多種不同方式 是已知的，例如在差異基因表達(dá)分析的領(lǐng)域中使用的那些時(shí)，用于產(chǎn)生表達(dá)譜的一個(gè)代表 性且適宜性類型的程序是以陣列基礎(chǔ)的基因表達(dá)譜產(chǎn)生程序。這些應(yīng)用是雜交測(cè)定，其中 使用在有待被產(chǎn)生的譜中展示用于有待被測(cè)定或進(jìn)行譜分析的基因中的每一種的"探針" 核酸的核酸。在這些測(cè)定中，首先從正在測(cè)定的初始核酸樣品制備靶核酸的一個(gè)樣品，其 中，制備可包括用標(biāo)記物例如信號(hào)表達(dá)系統(tǒng)的一員來(lái)標(biāo)記靶核酸。靶核酸樣品制備之后，將 樣品在雜交條件下與陣列接觸，由此在與連接至陣列表面的探針序列互補(bǔ)的靶核酸之間形 成復(fù)合物。之后定性或者定量地檢測(cè)雜交復(fù)合物的存在。
[0182] 可實(shí)行以產(chǎn)生在主題方法中使用的表達(dá)譜的特異雜交技術(shù)包括描述于美國(guó)專利 第 5, 143, 854 ;5, 288, 644 ;5, 324, 633 ;5, 432, 049 ;5, 470, 710 ;5, 492, 806 ;5, 503, 980 ; 5, 510, 270 ;5, 525, 464 ;5, 547, 839 ;5, 580, 732 ;5, 661，028 ;5, 800, 992 號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通 過(guò)引用并入本文；以及 W095/21265 ;TO96/31622 ;TO97/10365 ;TO97/27317 ;EP 373 203 和 EP 785 280中的技術(shù)。在這些方法中，如上文描述的將包括用于其表達(dá)正被測(cè)定的表型決 定基因中的每一種的探針的"探針"核酸的陣列與靶核酸接觸。在雜交條件例如嚴(yán)格雜交 條件下進(jìn)行接觸，并且之后除去未結(jié)合的核酸。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格測(cè)定條件"是指 適于產(chǎn)生具有足夠互補(bǔ)性以在測(cè)定中提供所期望的特異性水平的核酸例如表面結(jié)合的和 溶液相核酸的結(jié)合對(duì)而較不適于形成具有不足以提供所期望的特異性的互補(bǔ)性的結(jié)合成 員之間的結(jié)合對(duì)的條件。嚴(yán)格互補(bǔ)條件是雜交和清洗條件的總和或組合（全體）。
[0183] 所得到的雜交的核酸的模式提供關(guān)于已經(jīng)被探針探測(cè)的基因中的每一種的表達(dá) 信息，其中表達(dá)信息是以基因是否表達(dá)以及典型地什么水平表達(dá)的方式，其中表達(dá)信息，即 表達(dá)譜（例如以轉(zhuǎn)錄組（transcriptosome)形式），都可以是定性和定量的。
[0184] 可選擇地，可使用用于將樣品中的一個(gè)或多個(gè)核酸的水平定量的非陣列基礎(chǔ)的方 法，包括以擴(kuò)增程序?yàn)榛A(chǔ)的那些例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)基礎(chǔ)的測(cè)定，包括定量PCR、 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)PCR和類似方法。
[0185] 在一些實(shí)施方案中，基因的表達(dá)可通過(guò)獲得蛋白組表達(dá)譜來(lái)評(píng)估，其中確定樣品 中的一種或多種蛋白/多肽的量或水平，例如由感興趣的基因編碼的蛋白/多肽。在這些實(shí) 施方案中，被測(cè)定以產(chǎn)生所述方法中使用的表達(dá)譜的樣品是蛋白樣品。當(dāng)表達(dá)譜是蛋白組 表達(dá)譜，即樣品中一種或多種蛋白水平的譜時(shí)，可使用用于評(píng)估蛋白水平的任何常規(guī)程序， 其中確定所測(cè)定的樣品中的一種或多種蛋白的水平。
[0186] 盡管用于蛋白水平的多種不同方式的測(cè)定是本領(lǐng)域中已知的，但用于測(cè)定蛋白水 平的一種代表性且適宜性類型的方案是ELISA。在ELISA和以ELISA基礎(chǔ)的測(cè)定中，對(duì)于 感興趣的蛋白來(lái)說(shuō)特異性的一種或多種抗體可被固定在所選擇的固體表面上，優(yōu)選地展示 蛋白親和性的表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。清洗以除去不完全吸附的材料之后，將 測(cè)定板孔用對(duì)于測(cè)試樣品例如牛血清白蛋白（BSA)、酪蛋白或奶粉溶液來(lái)說(shuō)已知抗原中性 的非特異性"封閉"蛋白包被。這允許封閉固定表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，由此減少由所 述表面上抗原的非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景。清洗以除去未結(jié)合封閉的封閉蛋白之后，將固 定的表面與有待被測(cè)試的樣品在有助于免疫復(fù)合物（抗原/抗體）形成的條件下接觸。這 些條件包括同樣有助于幫助減少非特異性背景的用稀釋液例如溶于鹽酸緩沖鹽水（PBS)/ 吐溫或PBS/Triton-XlOO中的BSA或牛血清丙種球蛋白（BGG)稀釋樣品和允許樣品在約 25°C-27°C的溫度（盡管也可使用其他溫度）孵育約2-4小時(shí)。孵育后，清洗抗血清接觸 的表面以便除去非免疫復(fù)合的材料。示例性的清洗程序包括用溶液例如PBS/吐溫、PBS/ Triton-XlOO或硼酸鹽緩沖液清洗。免疫復(fù)合物形成的出現(xiàn)和量然后可通過(guò)使結(jié)合的免疫 復(fù)合物經(jīng)歷對(duì)與第一抗體不同的靶具有特異性的第二抗體并且檢測(cè)第二抗體的結(jié)合來(lái)確 定。在某些實(shí)施方案中，第二抗體具有所結(jié)合的酶，例如尿素酶、過(guò)氧化物酶或堿性磷酸化 酶，其將在與適當(dāng)?shù)娘@色底物孵育時(shí)產(chǎn)生有色沉淀。例如，可使用尿素酶或過(guò)氧化物酶軛合 的抗人類IgG -段時(shí)間并且在有利于免疫復(fù)合物形成的發(fā)展的條件下（例如在含有PBS的 溶液例如PBS/吐溫中于室溫孵育2小時(shí)）。這樣用第二抗體孵育并且清洗以除去未結(jié)合的 材料之后，將標(biāo)記的量定量，例如通過(guò)在尿素酶標(biāo)記的實(shí)例中用顯色底物例如尿素和溴甲 酚紫或在過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的實(shí)例中用2, 2' -聯(lián)氮-雙- (3-乙基-苯并噻唑啉）-6-磺 酸（ABTS)和H2O2孵育。之后通過(guò)測(cè)量顏色生成的程度例如使用可見(jiàn)光譜分光光度計(jì)獲得 定量。
[0187] 之前的格式可通過(guò)首先將樣品與測(cè)定板結(jié)合來(lái)改變。之后將初級(jí)抗體與測(cè)定板孵 育，之后使用對(duì)初級(jí)抗體具有特異性的標(biāo)記的次級(jí)抗體檢測(cè)結(jié)合的初級(jí)抗體。
[0188] 一種或多種抗體固定于其上的固體基質(zhì)可由許多種材料制成并且為許多種形狀 例如微量滴定板、微珠、測(cè)驗(yàn)片、樹(shù)脂顆粒等。可以選擇基質(zhì)以最大化信噪比，從而最小化背 景結(jié)合以及便于分離和包被?？梢赃m合所使用的基質(zhì)的方式實(shí)施清洗，例如通過(guò)將微珠或 測(cè)驗(yàn)片從儲(chǔ)器除去，將儲(chǔ)器例如微量滴定板孔清空或稀釋或者用清洗溶液或溶劑漂洗珠、 顆粒、層析柱或?yàn)V器。
[0189] 可選擇地，可使用用于測(cè)量樣品中一種或多種蛋白的水平的以非ELISA基礎(chǔ)的方 法。代表性的實(shí)例包括但不限于質(zhì)譜、蛋白組陣列、xMAPTM微球技術(shù)、流式細(xì)胞計(jì)、蛋白質(zhì) 印跡和免疫組織化學(xué)。
[0190] 所得到的結(jié)果提供了與已經(jīng)被探針探測(cè)的基因中的每一種的表達(dá)有關(guān)的信息，其 中表達(dá)信息以基因是否表達(dá)以及通常以什么水平表達(dá)的方式并且其中表達(dá)數(shù)據(jù)可以是定 性并且定量的。
[0191] 在產(chǎn)生表達(dá)譜時(shí)，在一些實(shí)施方案中，測(cè)定樣品以產(chǎn)生包括至少一個(gè)基因/蛋白、 有時(shí)多個(gè)基因/蛋白的表達(dá)數(shù)據(jù)的表達(dá)譜，其中復(fù)數(shù)意指至少兩種不同的基因/蛋白以及 經(jīng)常至少約3種，通常至少約10種或更多，常常至少約15種不同的基因/蛋白或更多，例 如50種或更多或者100種或更多等。
[0192] 在最廣泛的意義上，表達(dá)評(píng)估可以是定性或者定量的。像這樣，當(dāng)檢測(cè)是定性的 時(shí)，所述方法提供讀數(shù)或評(píng)價(jià)，例如評(píng)估靶分析物例如核酸或表達(dá)產(chǎn)物是否存在于被測(cè)定 的樣品中。在還有另外的實(shí)施方案中，所述方法提供了靶分析物是否存在于被評(píng)估的樣品 中的定量檢測(cè)，即估計(jì)或評(píng)估靶分析物例如被測(cè)定的樣品中的核酸或蛋白的真實(shí)量或相對(duì) 豐度。在這些實(shí)施方案中，定量檢測(cè)可以是絕對(duì)的或如果所述方法是檢測(cè)樣品中的兩種或 更多種不同分析物例如核酸或蛋白的方法時(shí)是相對(duì)的。像這樣，術(shù)語(yǔ)"定量"用于定量樣品 中的靶分析物例如一種或多種核酸或蛋白的上下文時(shí)，可指絕對(duì)或相對(duì)定量。絕對(duì)定量可 通過(guò)包含已知濃度的一種或多種對(duì)照分析物并且用已知的對(duì)照分析物（例如通過(guò)產(chǎn)生標(biāo) 準(zhǔn)曲線）參照即標(biāo)準(zhǔn)化靶分析物的檢測(cè)水平來(lái)完成?？蛇x擇地，可通過(guò)將兩種或更多種不 同的靶分析物之間的檢測(cè)水平或量比較以提供兩種或更多種不同分析物中的每一種的相 對(duì)定量例如相對(duì)于彼此來(lái)完成相對(duì)定量。
[0193] 表達(dá)水平預(yù)測(cè)合子發(fā)育潛力的基因的實(shí)例包括Cofil I in (NM_005507)， DIAPHl (NM_001079812、NM_005219)，ECT2 (匪_018098)，MYLC2/MYL5 (NM_002477)， DGCR8 (NM_022720)，Dicer/DICERl(NM_030621、NM_177438)，TARBP2 (NM_004178、 NM_134323、 NM_134324)， CPEBl(NM_001079533, NM_001079534、 NM_001079535、 NM_030594), Symplekin/SYMPK(NM_004819) , YBX2 (NM_015982), ZARl (NM_175619), CTNNBl (NM_001098209、NM_001098210、NM_001098210、NM_001904)，DNMT3B(NM_006892、 NM_175848、NM_175849、NM_175850)，TERT (NM_198253、NM_198255)，YYl (NM_003403)， IFGR2/IFNGR2(NM_005534)，BTF3(NM_001037637、NM_001207),和 NELF(NM_001130969、 NM_001130970、NM_001130971，NM_015537)。表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛力的細(xì)胞參數(shù) 的其他基因提供于圖8中。獲得基因表達(dá)水平測(cè)量時(shí)，基因水平常常被評(píng)估并且之后對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)對(duì)照例如已知在整個(gè)發(fā)育中恒定的基因例如GAPDH或RPLPO或者在這一時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)已 知的基因的樣品中的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0194] 基因表達(dá)水平可從單個(gè)細(xì)胞、例如來(lái)自感興趣的胚胎的分裂球或分離的卵母細(xì)胞 或來(lái)自干細(xì)胞的培養(yǎng)基的分離的細(xì)胞等確定，或者它們可以從胚胎例如感興趣的胚胎的2、 3或4或更多個(gè)卵裂球直到并且包括感興趣的整個(gè)胚胎、或者來(lái)自干細(xì)胞的培養(yǎng)基的多個(gè) 細(xì)胞直到并且包括干細(xì)胞的整個(gè)培養(yǎng)基等確定。
[0195] 在其他的方面，本發(fā)明包括用于在單個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行同時(shí)的基因分型和基因表達(dá)分 析的程序。對(duì)于胚胎，這可用于改善著床前胚胎遺傳學(xué)診斷（PGD)，一種將單個(gè)細(xì)胞從胚胎 除去并且檢測(cè)其DNA的染色體組型缺陷或者特定疾病基因的存在的程序。我們的方法允許 同時(shí)的遺傳和基因表達(dá)分析。所述方法包括下列步驟：（1)將單個(gè)細(xì)胞收集到小體積的培 養(yǎng)基或緩沖液中，（2)使用基因分型和基因表達(dá)分析引物的混合物進(jìn)行一步逆轉(zhuǎn)錄和聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增，（3)小于18個(gè)循環(huán)的PCR之后收集等份的擴(kuò)增的cDNA以維持?jǐn)U 增的線性，（4)使用cDNA等份用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定量實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析，（5)使用剩 余的樣品進(jìn)行第二輪PCR以為了基因分型的目的進(jìn)一步擴(kuò)增遺傳信息和（6)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 例如凝膠電泳進(jìn)行基因分型。
[0196] 從圖像和/或某閔表.汰分析確定發(fā)育潛力
[0197] -旦已經(jīng)獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果，所述測(cè)量就被用來(lái)確定胚胎/多潛能細(xì)胞的發(fā) 育潛力。如上文所討論的，術(shù)語(yǔ)"發(fā)育潛力"和"發(fā)育感受性"是指多潛能細(xì)胞或組織生長(zhǎng) 或發(fā)育的能力（ability)或能力（capacity)。例如，在卵母細(xì)胞或胚胎的實(shí)例中，發(fā)育潛力 可以是卵母細(xì)胞或胚胎生長(zhǎng)或發(fā)育為健康胚泡的能力（ability)或能力（capacity)。作 為另一個(gè)實(shí)例，在干細(xì)胞的實(shí)例中，發(fā)育潛力是生長(zhǎng)或發(fā)育為感興趣的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞例 如神經(jīng)元、肌肉、B或T細(xì)胞和類似細(xì)胞的能力（ability)或能力（capacity)。在一些實(shí) 施方案中，卵母細(xì)胞或胚胎的發(fā)育潛力是所述卵母細(xì)胞或胚胎發(fā)育為健康胚泡；以成功植 入子宮；以經(jīng)過(guò)妊娠和/或以活著出生的能力（ability)或能力（capacity)。在一些實(shí)施 方案中，多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力是所述多潛能細(xì)胞發(fā)育為感興趣的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞例如神 經(jīng)元、肌肉、B或T細(xì)胞和類似細(xì)胞和/或體內(nèi)促進(jìn)感興趣的組織的能力（ability)或能力 (capacity)〇
[0198] "良好發(fā)育潛力"意指胚胎/多潛能細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)上很可能如所期望的發(fā)育，即其具 有如所期望的發(fā)育的55%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的概率，例如100%的概率。 換句話說(shuō)，證明曾獲得對(duì)良好發(fā)育潛力的確定的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果的100個(gè)中55個(gè)、100個(gè) 中60個(gè)、100個(gè)中70個(gè)、100個(gè)中80個(gè)、100個(gè)中90個(gè)、100個(gè)中95個(gè)或整個(gè)100個(gè)中100 個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞事實(shí)上確實(shí)如所期望的繼續(xù)發(fā)育。相反地，"不良發(fā)育潛力"意指胚胎 /多潛能細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)上很可能不如所期望的發(fā)育，即其具有如所期望的發(fā)育的50%、40%、 30 %、20 %、10 %、5 %或更少的概率，例如0 %的概率。換句話說(shuō)，證明曾獲得對(duì)不良發(fā)育潛 力的確定的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果的100個(gè)中僅50個(gè)、100個(gè)中40個(gè)、100個(gè)中30個(gè)、100個(gè)中 20個(gè)、100個(gè)中10個(gè)、100個(gè)中5個(gè)或更少的胚胎或多潛能細(xì)胞事實(shí)上確實(shí)如所期望的繼續(xù) 發(fā)育。如本文所用的，"正常的"或"健康的"胚胎和多潛能細(xì)胞證明良好發(fā)育潛力而"不正 常的"胚胎和多潛能細(xì)胞表現(xiàn)出不良的發(fā)育潛力。
[0199] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果被直接用于確定胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育 潛力。換句話說(shuō)，測(cè)量本身的絕對(duì)值足以確定發(fā)育潛力。使用時(shí)差成像測(cè)量細(xì)胞單數(shù)的實(shí)施 方案中這樣的實(shí)例包括但不限于下列，其單獨(dú)或組合中的任一種指示人類胚胎中的良好發(fā) 育潛力：（a)持續(xù)約0-30分鐘例如，約6-20分鐘，平均約12-14分鐘的胞質(zhì)分裂I ; (b)持 續(xù)約20-27小時(shí)例如約25-27小時(shí)的細(xì)胞周期I ; (c)約8-15小時(shí)，例如約9-13小時(shí)，具有 約11+/-2. 1小時(shí)的平均值的胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始之間的時(shí)間間隔；（d) 約0-5小時(shí)，例如約0-3小時(shí)，具有約1+/-1. 6小時(shí)的平均時(shí)間的胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì) 分裂3的起始之間的時(shí)間間隔，即同步性。單獨(dú)或組合中任一種指示人類胚胎中不良發(fā)育 潛力的直接的測(cè)量的實(shí)例包括但不限于（a)持續(xù)超過(guò)約30分鐘例如約32、35、40、45、50、 55或60分鐘或更多的胞質(zhì)分裂I ; (b)持續(xù)超過(guò)約27小時(shí)例如28、29或30或更多小時(shí)的 細(xì)胞周期I ; (c)持續(xù)超過(guò)15小時(shí)例如16、17、18、19或20或更多小時(shí)或少于8小時(shí)例如約 7、 5、4或3或更少小時(shí)的胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始之間的時(shí)間間隔；（d)6、7、 8、 9或10或者更多小時(shí)的胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí)間間隔。
[0200] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將其與來(lái)自參照或?qū)φ张咛?多潛能細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)測(cè) 量結(jié)果比較并且使用這一比較的結(jié)果以提供對(duì)所述胚胎/多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的確定 來(lái)使用細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。術(shù)語(yǔ)"參照"和"對(duì)照"如本文所用的意指被用來(lái)解釋給定胚胎 /多潛能細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果并且給出對(duì)其發(fā)育潛力的確定的標(biāo)準(zhǔn)化的胚胎或細(xì)胞。 參考或?qū)φ湛梢允且阎哂兴谕谋硇屠缌己冒l(fā)育潛力并且因此可以是陽(yáng)性參照或 對(duì)照胚胎/多潛能細(xì)胞的胚胎/多潛能細(xì)胞?？蛇x擇地，所述參照/對(duì)照胚胎/多潛能細(xì) 胞可以是已知不具有所期望的表型并且因此是陰性參照或?qū)φ张咛?多潛能細(xì)胞的胚胎/ 多潛能細(xì)胞。
[0201] 在某些實(shí)施方案中，將所獲得的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自單個(gè)參照/ 對(duì)照胚胎/多潛能細(xì)胞的可比較的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果比較以獲得與評(píng)估的所 述胚胎/細(xì)胞的表型有關(guān)的信息。在還有其他的實(shí)施方案中，將所獲得的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞 參數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自兩個(gè)或更多個(gè)不同參照/對(duì)照胚胎或多潛能細(xì)胞的可比較的一個(gè)或 多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果比較以獲得與評(píng)估的所述胚胎/細(xì)胞的表型有關(guān)的更深入的信息。 例如，可將從所評(píng)估的所述一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞獲得的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果與陽(yáng)性 和陰性胚胎或多潛能細(xì)胞兩者相比較以獲得與所述胚胎/細(xì)胞是否具有感興趣的表型有 關(guān)的確定的信息。
[0202] 作為一個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎即具有良好發(fā)育潛力的胞質(zhì)分裂1為約0-30分鐘， 更經(jīng)常地約6-20分鐘，平均約12-14分鐘，即約1、2、3、4或5分鐘，更經(jīng)常地約6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分鐘，在某些實(shí)例中為21、22、23、24、25、26、27、28、 29或多達(dá)約30分鐘。當(dāng)與從正常參照胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的胚胎中完成胞質(zhì)分裂 1的較長(zhǎng)的時(shí)間段指示不良發(fā)育潛力。作為第二個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎中的細(xì)胞周期1即 從受精到胞質(zhì)分裂1完成的時(shí)間，通常在約20-27小時(shí)中，更經(jīng)常地在約25-27小時(shí)，即約 15、16、17、18或19小時(shí)，更經(jīng)常地約20、21、22、23或24小時(shí)和更經(jīng)常地約25、26或27小 時(shí)中完成。當(dāng)與從正常參照胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的胚胎中較長(zhǎng)的細(xì)胞周期1指示不 良發(fā)育潛力。作為第三個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎中胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始是 約8-15小時(shí)，更常常約9-13小時(shí)，具有約11+/-2. 1小時(shí)的平均值，即6、7或8小時(shí)，更經(jīng) 常地約9、10、11、12、13、14或多達(dá)約15小時(shí)。與從正常參照胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的 胚胎中較長(zhǎng)或較短的細(xì)胞周期2指示不良發(fā)育潛力。作為第四個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎中胞 質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí)間間隔即第二次和第三次有絲分裂的同步性 是通常約0-5小時(shí)，更經(jīng)常地約0、1、2或3小時(shí)，具有約1+/-1. 6小時(shí)的平均值，與從正常 參照胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的胚胎中胞質(zhì)分裂2的完成和胞質(zhì)分裂3之間的較長(zhǎng)的間 隔指示不良發(fā)育潛力。最后，作為當(dāng)使用基因表達(dá)水平作為評(píng)估發(fā)育潛力的參數(shù)時(shí)可如何 應(yīng)用這一實(shí)施方案的實(shí)例，Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2、DGCR8、Dicer、TARBP2、CPEB1、 Symplekin、YBX2、ZARl、CTNNBl、DNMT3B、TERT、YYl、IFGR2、BTF3 和 / 或NELF 的較低的表達(dá) 水平即與從正常參照2細(xì)胞胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的2細(xì)胞胚胎中低1. 5-倍、2-倍、 3-倍、4-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍或100-倍的表達(dá)指示不良發(fā)育潛力，而等于或大 于從正常參照2細(xì)胞胚胎所觀察到的表達(dá)的表達(dá)指示良好發(fā)育潛力。其他實(shí)例可來(lái)自于經(jīng) 驗(yàn)數(shù)據(jù)，例如通過(guò)觀察有待被測(cè)定的胚胎/多潛能細(xì)胞旁邊的一個(gè)或多個(gè)參照胚胎或多潛 能細(xì)胞?？墒褂萌魏螀⒄张咛?多潛能細(xì)胞，例如具有良好發(fā)育潛力的正常參照樣品或具 有不良發(fā)育潛力的異常參照樣品。在一些實(shí)例中，可使用不只一個(gè)參照樣品，例如正常參照 樣品和異常參照樣品兩者都可使用。
[0203] 在一些實(shí)施方案中，使用通過(guò)時(shí)差顯微術(shù)或通過(guò)表達(dá)譜分析但不是通過(guò)時(shí)差顯微 術(shù)和表達(dá)譜分析兩者獲取的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果是可以期望的。在其他的實(shí)施方案中，使用 通過(guò)時(shí)差顯微術(shù)獲取的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以及通過(guò)表達(dá)譜分析獲取的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果 是可以期望的。
[0204] 如上文所討論的，可測(cè)量并使用一個(gè)或多個(gè)參數(shù)來(lái)確定胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育 潛力。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)參數(shù)的測(cè)量可能足以獲得對(duì)發(fā)育潛力的確定。在一些實(shí)施 方案中，使用不只一個(gè)參數(shù)例如2個(gè)細(xì)胞參數(shù)、3個(gè)細(xì)胞參數(shù)或4個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè) 量是可以期望的。
[0205] 在某些實(shí)施方案中，對(duì)于多個(gè)參數(shù)的測(cè)定是可以期望的，因?yàn)閷?duì)多個(gè)參數(shù)的測(cè)定 可提供更高的敏感性和特異性。敏感性意指正確鑒定為陽(yáng)性的實(shí)際上陽(yáng)性的比例。這可被 算術(shù)表示為：
【權(quán)利要求】
1. 一種用于將培養(yǎng)中的人類胚胎自動(dòng)成像的設(shè)備，其包括： a) 配置以在孵育器內(nèi)操作的一個(gè)或多個(gè)顯微鏡； b) 配置以聚焦在置于臺(tái)上的相關(guān)培養(yǎng)皿上的每個(gè)顯微鏡； c) 包含用于照明所述相關(guān)培養(yǎng)皿中的胚胎的光源的每個(gè)顯微鏡； d) 包含照相機(jī)的每個(gè)顯微鏡；和 e) -種用于隨時(shí)間儲(chǔ)存來(lái)自一個(gè)或多個(gè)照相機(jī)的連續(xù)圖像的方式和一種用于隨時(shí)間 分析連續(xù)圖像的方式； 其中所述圖像被分析用于測(cè)量一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)，所述細(xì)胞參數(shù)選自由下列所組成 的組： i) 第一次胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間； ii) 胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔； iii) 胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔； iv) 第一次和第二次有絲分裂之間的時(shí)間間隔；和 v) 第二次和第三次有絲分裂之間的時(shí)間間隔。
2. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)顯微鏡的光源被配置以提供亮視野 照明。
3. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)顯微鏡的光源被配置以提供暗視野 照明。
4. 如權(quán)利要求3所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)顯微鏡的光源是紅色或近紅外的。
5. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量發(fā)生在受精后約48 小時(shí)至約96小時(shí)發(fā)生。
6. 如權(quán)利要求5所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量發(fā)生在受精后約48 小時(shí)內(nèi)發(fā)生。
7. 如權(quán)利要求5所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量發(fā)生在受精后約54 小時(shí)內(nèi)發(fā)生。
8. 如權(quán)利要求5所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量發(fā)生在受精后約60 小時(shí)內(nèi)發(fā)生。
9. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述連續(xù)圖像時(shí)間間隔5分鐘。
10. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)為：胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分 裂2之間的時(shí)間間隔和/或胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
11. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)為：胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分 裂2之間的時(shí)間間隔和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
12. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)為：第一次和第二次有絲 分裂之間的時(shí)間間隔和/或第二次和第三次有絲分裂之間的時(shí)間間隔。
13. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)為：第一次和第二次有絲 分裂之間的時(shí)間間隔和第二次和第三次有絲分裂之間的時(shí)間間隔。
14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔為胞 質(zhì)分裂1的起始和胞質(zhì)分裂2的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束 之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的起始和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞 質(zhì)分裂2的起始之間的間隔。
15. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔為 胞質(zhì)分裂1的起始和胞質(zhì)分裂2的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的結(jié) 束之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的起始和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和 胞質(zhì)分裂2的起始之間的間隔。
16. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述胞質(zhì)分裂1和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔為 胞質(zhì)分裂1的起始和胞質(zhì)分裂2的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的結(jié) 束之間的間隔、胞質(zhì)分裂1的起始和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂1的結(jié)束和 胞質(zhì)分裂2的起始之間的間隔。
17. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔為胞 質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束 之間的間隔、胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞 質(zhì)分裂3的起始之間的間隔。
18. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔為 胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞質(zhì)分裂3的結(jié) 束之間的間隔、胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和 胞質(zhì)分裂3的起始之間的間隔。
19. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔為 胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞質(zhì)分裂3的結(jié) 束之間的間隔、胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和 胞質(zhì)分裂3的起始之間的間隔。
20. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)顯微鏡被配置為通過(guò)計(jì)算機(jī)來(lái)控 制。
21. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)顯微鏡包含在顯微鏡陣列中。
22. 如權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中所述包含在顯微鏡陣列中的一個(gè)或多個(gè)顯微鏡與 陣列中的其它顯微鏡至少是部分分離的。
23. 如權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中所述包含在顯微鏡陣列中的一個(gè)或多個(gè)顯微鏡被 配置為同時(shí)成像一個(gè)或多個(gè)培養(yǎng)皿；和所述一個(gè)或多個(gè)顯微鏡中的每個(gè)成像相應(yīng)的一個(gè)或 多個(gè)培養(yǎng)皿。
24. 如權(quán)利要求3所述的設(shè)備，其中所述一個(gè)或多個(gè)顯微鏡中的至少一個(gè)還包含：暗視 野片；聚光透鏡；和一個(gè)或多個(gè)配置以捕捉圖像和/或連接用于圖像分析的計(jì)算機(jī)的傳感 器。
25. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其還包含基于與圖像相關(guān)的數(shù)據(jù)配置以控制培養(yǎng)條件 的反饋控制組件，所述培養(yǎng)條件包括溫度和pH中的至少一種。
26. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其還包含含有凹入培養(yǎng)皿表面的多個(gè)微孔的培養(yǎng)皿，其 中所述多個(gè)微孔具有大小和間距，使得一個(gè)或多個(gè)顯微鏡配置為同時(shí)觀察多個(gè)微孔。
27. 如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其還包含：（f)配置以通過(guò)概率模型評(píng)估技術(shù)來(lái)評(píng)估一 個(gè)或多個(gè)時(shí)間連續(xù)圖像中胚胎的細(xì)胞邊界的計(jì)算機(jī)，所述計(jì)算機(jī)還配置以跟蹤基于評(píng)估的 細(xì)胞邊界的時(shí)間連續(xù)圖像所顯示的細(xì)胞邊界。
28.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其還包含：（f)配置以通過(guò)概率模型評(píng)估技術(shù)來(lái)評(píng)估一 個(gè)或多個(gè)時(shí)間連續(xù)圖像中胚胎的細(xì)胞邊界的計(jì)算機(jī)，所述評(píng)估技術(shù)包括對(duì)細(xì)胞參數(shù)的多個(gè) 假設(shè)的產(chǎn)生，所述細(xì)胞參數(shù)與基于概率分布的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間連續(xù)圖像中的每個(gè)中的一個(gè) 或多個(gè)細(xì)胞邊界中的每個(gè)相關(guān)，所述計(jì)算機(jī)還配置以跟蹤基于評(píng)估的細(xì)胞邊界的時(shí)間連續(xù) 圖像所顯示的細(xì)胞邊界以測(cè)量所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)。
【文檔編號(hào)】C12M1/36GK104293646SQ201410443757
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2009年8月22日
【發(fā)明者】C.C.王, K.E.洛克, T.M.貝爾, R.A.賴喬-佩拉, B.貝爾 申請(qǐng)人:里蘭斯坦福初級(jí)大學(xué)理事會(huì)