亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法

文檔序號:510241閱讀:306來源:國知局
使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使體細(xì)胞去分化的方法。具體而言,本發(fā)明提供一種制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法,所述方法包括用包含胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的組合物處理體細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法,使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡可使體細(xì)胞的去分化有效進(jìn)行而無副作用,并且,預(yù)見到本發(fā)明的方法在研發(fā)具有個體免疫相容性的細(xì)胞療法產(chǎn)品方面非常有用。
【專利說明】使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種通過使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使體細(xì)胞去分化來制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]去分化是成熟體細(xì)胞恢復(fù)為較年輕的干細(xì)胞的過程并且去分化涉及體內(nèi)再生,這種體內(nèi)再生在昆蟲體內(nèi)、兩棲動物體內(nèi)、植物體內(nèi)發(fā)生。所述去分化不會自然地發(fā)生在諸如人之類的哺乳動物體內(nèi),只是通過人工方法在諸如人之類的哺乳動物體內(nèi)發(fā)生。細(xì)胞去分化的方法以使用細(xì)胞融合的方法為開端。本領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)的使體細(xì)胞去分化的第一種方法是使用如下特征的方法:當(dāng)胚胎干細(xì)胞(ESC)與體細(xì)胞融合時胚胎干細(xì)胞成為占主導(dǎo)地位的細(xì)胞。此后,通過將體細(xì)胞與除了 ESC之外的具有類似于ESC的能力的干細(xì)胞融合使在誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化方面的研究取得了長足發(fā)展,所述具有類似于ESC的能力的干細(xì)胞例如,胚胎生殖細(xì)胞(EGC)或胚胎癌細(xì)胞(ECC)。
[0003]然而,進(jìn)行細(xì)胞融合的細(xì)胞會隨機(jī)分裂或維持在融合狀態(tài)而不進(jìn)行分裂。發(fā)生分裂的細(xì)胞(雜合體)具有一個細(xì)胞核,而沒有發(fā)生分裂的細(xì)胞(異核體)具有兩個不同細(xì)胞的細(xì)胞核。由于這個原因,大多數(shù)細(xì)胞成為癌細(xì)胞,只有一些細(xì)胞具有正常功能。
[0004]此外,檢查細(xì)胞融合(細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì))的方法具有以下不足之處:許多細(xì)胞由于使用聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合而死亡,聚乙二醇可損傷細(xì)胞以幫助大尺寸的細(xì)胞進(jìn)行融合。為了解決這個問題,僅使細(xì)胞的一部分而非全部胚胎干細(xì)胞去分化的常規(guī)研究取得了進(jìn)展。一項(xiàng)研究工作通過從細(xì)胞中僅分離細(xì)胞質(zhì)而在融合過程中排除細(xì)胞核。用化學(xué)物質(zhì)(鏈球菌溶血素)處理體細(xì)胞以使細(xì)胞膜具有滲透性并嵌入從胚胎干細(xì)胞衍生的細(xì)胞質(zhì)的方法得到使用。然而,截止2010年,在使用細(xì)胞質(zhì)去分化的情況下,還沒有成功的去分化實(shí)例產(chǎn)生與胚胎干細(xì)胞類似的性質(zhì)。
[0005]此外,本領(lǐng)域還存在特異性因子的遞送系統(tǒng)。2006年,日本東京大學(xué)的Yamanaka研究組發(fā)現(xiàn)了可僅通過胚胎干細(xì)胞中的四個基因進(jìn)行去分化。將這四個基因(0ct-4、klf4、Sox2和c-Myc)引入小鼠皮膚細(xì)胞,從而制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)。這項(xiàng)研究開創(chuàng)了合成細(xì)胞的一部分用于嵌入而不是融合整個細(xì)胞這一概念。iPS技術(shù)采用了一種通過在起始階段利用病毒的能力將基因嵌入基因組并強(qiáng)制表達(dá)RNA生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。然而,由于病毒的特性,基因被整合在若干位點(diǎn),從而形成不理想的修飾。目前,為了解決這個問題,使用mRNA遞送方法或者遞送蛋白質(zhì)本身的方法。然而,本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)mRNA易于降解并且合成過程有難度,會誘導(dǎo)RNA的免疫反應(yīng),而且僅遞送蛋白質(zhì)無法實(shí)現(xiàn)完全去分化。
[0006]因此,本領(lǐng)域亟需研發(fā)一種可克服上述問題的制備去分化的多能性干細(xì)胞的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]【技術(shù)問題】
[0008]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題,本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),體細(xì)胞的去分化可通過使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡而有效且穩(wěn)定地進(jìn)行。
[0009]因此,本發(fā)明意在提供一種使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使體細(xì)胞有效地進(jìn)行去分化而不產(chǎn)生副作用來制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法,并且本發(fā)明還提供通過上述方法制備的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。
[0010]然而,技術(shù)問題不限于上面描述的那些,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)下面的描述會清楚地理解本文沒有描述的其他技術(shù)問題。
[0011]【技術(shù)方案】
[0012]本發(fā)明一方面提供一種制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法,所述方法包括使用包含胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的組合物處理體細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明另一方面提供通過如下方法制備的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞,所述方法包括使用包含胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的組合物處理體細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明的再一方面提供一種包含誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的細(xì)胞療法產(chǎn)品。
[0015]【有益效果】
[0016]根據(jù)本發(fā)明可知,使用融合微囊泡遞送細(xì)胞質(zhì)的方法不需要使用在細(xì)胞融合過程中所需的聚乙二醇(PEG)或不需要使用注入細(xì)胞質(zhì)時所用的諸如鏈球菌溶血素之類的細(xì)胞毒性物質(zhì),因此,對細(xì)胞的損傷較小。此外,在遞送細(xì)胞質(zhì)的過程中,微囊泡具有較高的遞送效率,并且更有效地保護(hù)遞送的內(nèi)容物,因此能夠特異性地遞送細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)遞送方面的常規(guī)研究可知,細(xì)胞質(zhì)的遞送效率隨著細(xì)胞核內(nèi)待表達(dá)的蛋白質(zhì)的量的減少而減少,因此,無法進(jìn)行完全去分化。 然而,基于本發(fā)明的制備方法,本發(fā)明的微囊泡可自由地控制細(xì)胞質(zhì)的濃度并且防止融合過程中細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的損失,這樣,使用細(xì)胞質(zhì)使體細(xì)胞去分化的效率可增加。
[0017]此外,根據(jù)使用本發(fā)明的微囊泡的方法可知,靶向誘導(dǎo)體內(nèi)去分化的目標(biāo)是可能的。具體而言,因?yàn)樵诨颊叩氖軗p器官中產(chǎn)生的信號是主要靶向因子,所以,可預(yù)見到的是,體外去分化會成為能夠在體內(nèi)進(jìn)行的新的去分化方式。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1表示通過擠壓制備的胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。
[0019]圖2為表示通過擠壓制備的胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的尺寸的圖。
[0020]圖3為表示胚胎干細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)(即,0ct3/4)存在于胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡中的圖。
[0021]圖4為表示胚胎干細(xì)胞特異性基因(即,0ct3/4和Nanog)存在于胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡中的圖。
[0022]圖5表示在使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)去分化之后產(chǎn)生的細(xì)胞集落。
[0023]圖6表示在使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)去分化并隨時間進(jìn)行增殖之后產(chǎn)生的細(xì)胞集落。[0024]圖7表示在使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使GFP轉(zhuǎn)染的小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3-GFP細(xì)胞)去分化之后產(chǎn)生的細(xì)胞集落。
[0025]圖8為表示胚胎干細(xì)胞特異性基因(即,0ct3/4和Nanog)在去分化的小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3去分化的細(xì)胞)中表達(dá)的圖。[0026]圖9表示去分化的小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3去分化的細(xì)胞)具有分化能力。
[0027]圖10為表示分化特異性基因(即,AFP、Foxfl和β -1II微管蛋白)在去分化的小鼠成纖維細(xì)胞(ΝΙΗ3Τ3去分化的細(xì)胞)分化時表達(dá)的圖。
[0028]圖11表示在通過胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡與布雷菲德菌素A (BFA)聯(lián)合處理使小鼠成纖維細(xì)胞(ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞)去分化之后產(chǎn)生的細(xì)胞集落。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明提供一種制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法,所述方法包括使用包含胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的組合物處理體細(xì)胞,從而使體細(xì)胞去分化。
[0030]本發(fā)明使用的胚胎干細(xì)胞可來源于人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛,但是本發(fā)明不限于此。
[0031]本文使用的“微囊泡”被脂質(zhì)雙層分為內(nèi)側(cè)和外側(cè),所述脂質(zhì)雙層由衍生的細(xì)胞的細(xì)胞膜成分構(gòu)成,所述微囊泡包括所述細(xì)胞的細(xì)胞膜脂質(zhì)、細(xì)胞膜蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞成分,并且所述微囊泡的尺寸比原始細(xì)胞的尺寸小,但是本發(fā)明不限于此。
[0032]本發(fā)明的微囊泡可通過如下方法由包含胚胎干細(xì)胞的懸浮液制備,所述方法選自:擠壓、超聲處理、細(xì)胞溶解、同質(zhì)化、冷凍-解凍、電穿孔、機(jī)械降解以及用化學(xué)物質(zhì)處理,但是本發(fā)明不限于此。
[0033]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,微囊泡的膜還可包含不同于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞膜的成分。
[0034]不同于細(xì)胞膜的成分可包括靶向分子、細(xì)胞膜與靶細(xì)胞融合所必需的物質(zhì)(融合劑)、環(huán)糊精、PEG,等等。此外,不同于細(xì)胞膜的成分可通過各種不同的方法添加,所述方法包括細(xì)胞膜的化學(xué)修飾。
[0035]例如,微囊泡的膜成分可通過使用巰基(-SH)或氨基(-NH2)的化學(xué)方法或通過將PEG化學(xué)連接至微囊泡被化學(xué)修飾。
[0036]本發(fā)明可進(jìn)一步包括在制備本發(fā)明的微囊泡的過程中對微囊泡的膜成分進(jìn)行化學(xué)修飾。
[0037]此外,本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞包括轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。具體而言,所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括被轉(zhuǎn)化為表達(dá)細(xì)胞膜與特定蛋白質(zhì)、靶分子或靶細(xì)胞融合所必需的物質(zhì)的細(xì)胞,并且所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞還包括由至少兩種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞組合構(gòu)成的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,但本發(fā)明并不限于此。
[0038]胚胎干細(xì)胞可通過物質(zhì)的處理或轉(zhuǎn)導(dǎo)被轉(zhuǎn)化,并且所述胚胎干細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化至少兩次。
[0039]在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中,胚胎干細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化為抑制至少一種特定蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0040]在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中,胚胎干細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化為表達(dá)選自細(xì)胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細(xì)胞膜融合蛋白以及它們的融合蛋白中的至少一種。[0041]在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中,胚胎干細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化為過表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性蛋白質(zhì),即,0ct3/4、Nanog或者Sox_2蛋白質(zhì)。
[0042]在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中,本發(fā)明的組合物還可包括不同于胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的成分。
[0043]例如,包含胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡和刺激體細(xì)胞去分化的物質(zhì)的組合物可用于處理體細(xì)胞。額外的物質(zhì)包括布雷菲德菌素A (BFA)、BiP誘導(dǎo)物X (BIX)和丙戊酸(VPA)。
[0044]下文中提供示例性的實(shí)例以幫助理解本發(fā)明。然而,本發(fā)明提供的下列實(shí)例可能更加易于理解本發(fā)明,但是本發(fā)明的范圍不限于實(shí)施例。
[0045]實(shí)施例1.胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的制備
[0046]以5X IO6個細(xì)胞/ml的濃度將小鼠胚胎干細(xì)胞重懸于3ml磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液中。使重懸液流過孔徑為IOym的膜過濾器10次,流過孔徑為5μπι的膜過濾器10次。將lml50%0ptiPr印?、lml5%0ptiPr印"和3ml流過膜過濾器的細(xì)胞懸浮液放置于5ml超速離心管中。隨后,在100,OOOXg的條件下進(jìn)行超速離心處理持續(xù)2小時。在50%0ptiPi^p?和5%0ptiPrep?之間的層中獲得微囊泡。
[0047]實(shí)施例2.胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的性質(zhì)分析
[0048]將根據(jù)實(shí)施例1所述的方法由胚胎干細(xì)胞制備的微囊泡吸附在輝光放電碳包被的銅網(wǎng)上持續(xù)3分鐘。用蒸餾水洗滌所述網(wǎng)并且用2%乙酸鈾酰染色I(xiàn)分鐘,使用透射電子顯微鏡JEMlOl (Jeol,Japan)觀察到的結(jié)果如圖1所示。
[0049]如圖1的TEM圖像所示 ,可以看到通過擠壓由胚胎干細(xì)胞制備的微囊泡由脂質(zhì)雙層構(gòu)成,并且通常形成尺寸為IOOnm至200nm的球形。
[0050]將實(shí)施例1所述的由胚胎干細(xì)胞制備的微囊泡稀釋于Iml PBS中,使其濃度達(dá)到5ug/mL.將含有微囊泡的Iml PBS放置于比色皿中并使用動態(tài)光散射粒度分析儀進(jìn)行分析,結(jié)果如圖2所示。
[0051]圖2所示的結(jié)果證實(shí)了微囊泡的尺寸為50nm至IOOnm,平均尺寸為70nm。
[0052]根據(jù)實(shí)施例1所述的方法由胚胎干細(xì)胞制備50 μ g微囊泡,并制備10 μ g胚胎干細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物,加入5X上樣染料(250mM Tris-HCl, 10%SDS, 0.5%溴酚藍(lán),50%甘油),使上樣染料的終濃度為IX上樣染料,在100°C下處理得到的溶液5分鐘。制備8%聚丙烯酰胺凝膠,隨后上樣。在80V的條件下對樣品進(jìn)行電泳分離持續(xù)2小時,并在400mA的條件下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜持續(xù)2小時。將脫脂牛奶溶于PBS中,使?jié)舛冗_(dá)到3%,并在該溶液中封閉所述膜2小時。在4°C條件下用0ct3/4和β-肌動蛋白的抗體處理所述膜12小時。用PBS洗滌得到的膜兩次,在室溫下再用連接有過氧化物酶的二抗處理所述膜I小時。得到的膜用PBS洗滌30分鐘并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL; Amersham C0.N0.RPN2106)底物進(jìn)行鑒定,結(jié)果如圖3所示。
[0053]圖3所示的結(jié)果證實(shí)了由胚胎干細(xì)胞制備的微囊泡中存在胚胎干細(xì)胞特異性蛋白質(zhì),即0ct3/4。
[0054]使用RNeasy'kMini試劑盒(QIAGEN, Cat.N0.74104),從根據(jù)實(shí)施例1所述的方
法由胚胎干細(xì)胞制備的微囊泡和胚胎干細(xì)胞中提取總基因(RNA)。使用特異性基因引物和PCR試劑盒(BIOLAB,Cat.N0.E5000)從提取的RNA中獲得多種cDNA,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,并且使用溴化乙錠(ETBR)染色進(jìn)行鑒定。為了保證使用相同量的RNA作為陽性對照(胚胎干細(xì)胞),還一同鑒定了管家基因(甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH))。使用5’ -AGACCATGTTTCTGAAGTGC-3’作為胚胎干細(xì)胞特異性基因(即,Oct-3/4)的正義引物,使用5’ -GAACCATACTCGAACCACA-3’作為胚胎干細(xì)胞特異性基因(即,Oct-3/4)的反義引物。使用5’ -CTAGTTCTGAGGAAGCATCG-3’作為另一胚胎干細(xì)胞特異性基因(即,Nanog)的正義引物,使用5’ -TCTCAGTAGCAGACCCTTG-3’作為該胚胎干細(xì)胞特異性基因(即,Nanog)的反義引物。圖4所示的基因表達(dá)圖像用于胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的性質(zhì)分析。
[0055]圖4所示的結(jié)果證實(shí)了胚胎干細(xì)胞特異性基因(B卩,0ct3/4和Nanog)在胚胎干細(xì)胞制備的微囊泡中表達(dá)。
[0056]實(shí)施例3.使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使體細(xì)胞去分化
[0057]用0.1%的明膠包被6孔平板并在該平板上接種8 X IO4個NIH3T3細(xì)胞,孵育細(xì)胞24小時。隨后,用PBS洗滌每個孔,將2ml根據(jù)實(shí)施例1所述的方法由胚胎干細(xì)胞制備的微囊泡稀釋于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM,10%FBS, 100U/ml青霉素-鏈霉素)中,使其濃度達(dá)到100 μ g/ml,隨后用其處理孵育的NIH3T3細(xì)胞。48小時后,識別出每孔大約2個細(xì)胞集落至3個細(xì)胞集落,并且每個細(xì)胞集落的尺寸為約10 μ m至100 μ m。使用電子顯微鏡觀察細(xì)胞集落,結(jié)果如圖5所示。
[0058]圖5所示的結(jié)果證實(shí)了使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡使NIH3T3細(xì)胞去分化,從而誘導(dǎo)細(xì)胞集落。用PBS洗滌每個孔,并加入400 μ 10.1XTE (胰蛋白酶-EDTA)。I分鐘后,使用移液器將10μ IlXTE加至細(xì)胞集落中,并將移液器的尖端置于細(xì)胞集落周圍進(jìn)行抽吸。將取出的細(xì)胞集落稀釋于500 μ I胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(knock-out DMEM,15%knock_outFBS, 10ng/ml LIF,0.lmM2-巰基乙醇,4mM L-谷氨酰胺,10 μ g/ml 慶大霉素,100U/ml 青霉素-鏈霉素)中,接種于0.1%明膠包`被的24孔平板中,并孵育5天或更長時間。
[0059]在細(xì)胞生長至80%匯合或更高程度匯合時,使用I X TE將全部體細(xì)胞稀釋于2ml胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中,并且在0.1%明膠包被的6孔平板中傳代培養(yǎng)。通過上述相同的方法,在細(xì)胞生長至80%匯合時,將細(xì)胞稀釋于8ml培養(yǎng)基中,在0.1%明膠包被的IOOmm培養(yǎng)皿中傳代培養(yǎng),并且每兩天至三天重復(fù)一次傳代培養(yǎng)。
[0060]如圖6所示,通過5天或更長時間的觀察結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞集落連續(xù)增殖。
[0061]實(shí)施例4.誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的來源的確定
[0062]使用逆轉(zhuǎn)錄病毒(pMSCV),將GFP基因注入NIH3T3細(xì)胞的基因組。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表現(xiàn)出綠色熒光,但是形成微囊泡的胚胎干細(xì)胞未顯示出熒光。6孔平板包被有0.1%的明膠并且接種有8 X IO4個NIH3T3GFP細(xì)胞,孵育細(xì)胞24小時。隨后,用PBS洗滌每個孔,將實(shí)施例1中制備的胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡稀釋于2ml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM,10%FBS,100U/ml青霉素-鏈霉素)中,使其濃度達(dá)到100μ g/ml,并將其用于處理NIH3T3GFP細(xì)胞。48小時后,識別出每孔約2個細(xì)胞集落至3個細(xì)胞集落,并且細(xì)胞集落的尺寸為約10 μ m至100 μ m,通過電子顯微鏡觀察到的結(jié)果如圖7所示。
[0063]根據(jù)常規(guī)研究可知,去分化需要經(jīng)歷一段很長的時間段,例如至少7天至30天,但是,如圖6和圖7所示,在使用本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的情況下,僅僅在48小時內(nèi)就形成細(xì)胞集落,因此去分化的時間可顯著縮短。
[0064]實(shí)施例5.誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的性質(zhì)確認(rèn)
[0065]通過洗滌劑相容性蛋白分析(DC)對根據(jù)實(shí)施例3所述的方法增殖了 40天的細(xì)胞集落(NIH3T3衍生的去分化細(xì)胞)、胚胎干細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物進(jìn)行定量分析,分別制備50 μ g的根據(jù)實(shí)施例3所述的方法增殖了 40天的細(xì)胞集落(NIH3T3衍生的去分化細(xì)胞)、50μ g胚胎干細(xì)胞和50μ g [!1313細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物,并加入5\上樣染料,使上樣染料的終濃度為I X上樣染料,并在100°C下處理5分鐘。制備8%的聚丙烯酰胺凝膠,并上樣。在80V條件下使樣品進(jìn)行電泳分離持續(xù)2小時,在400mA條件下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜持續(xù)2小時。根據(jù)待施加的抗體使用不同的封閉緩沖液封閉膜。在使用肌動蛋白抗體的情況下,將脫脂牛奶溶于PBS中,使脫脂牛奶的濃度為3%,在使用Oct3/4抗體的情況下,將脫脂奶粉溶于PBS中,使其濃度為5%,在使用Nanog抗體的情況下,將10%脫脂奶粉溶于PBS中,使其濃度為10%,并且在該溶液中封閉膜2小時。在4°C條件下使用0ct3/4、Nanog和β-肌動蛋白的抗體處理所述膜12小時,用PBS洗滌膜兩次,在室溫下用連接有過氧化物酶的二抗處理所述膜I小時。用PBS洗滌得到的膜30分鐘,使用ECL底物進(jìn)行鑒另IJ,結(jié)果如圖8所示。
[0066]圖8所示的結(jié)果證實(shí)了胚胎干細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)(即,0ct3/4和Nanog)在通過胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡去分化的NIH3T3去分化細(xì)胞(誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞)中表達(dá)。
[0067]實(shí)施例6.誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的自發(fā)分化的確認(rèn)
[0068]本發(fā)明對通過實(shí)施例3所述的方法增殖了 40天的誘導(dǎo)多能性細(xì)胞自發(fā)分化為所有細(xì)胞的能力進(jìn)行了確認(rèn),從而鑒定通過實(shí)施例3所述的方法增殖了 40天的誘導(dǎo)多能性細(xì)胞的功能。當(dāng)胚胎干細(xì)胞成為胚體時,胚體具有自發(fā)分化為所有細(xì)胞的能力。通過相同的原理,通過懸滴法誘導(dǎo)的細(xì)胞被誘導(dǎo)進(jìn)行強(qiáng)制性聚集。使用胰蛋白酶將集落細(xì)胞懸浮并稀釋于分化培養(yǎng)基(IMDM, 20%FBS, 4mM L-谷氨酰胺,10 μ g/ml慶大霉素,100U/ml青霉素-鏈霉素)中,使其濃度達(dá)到3.3 X 104/ml。將30μ1 (IX IO3)各稀釋溶液施加于細(xì)菌培養(yǎng)皿的上表面,并且誘導(dǎo)聚集持續(xù)2天。用分化培養(yǎng)基洗滌聚集在細(xì)菌培養(yǎng)皿上表面的細(xì)胞以在細(xì)胞培養(yǎng)皿中重懸細(xì)胞,并孵育2天。圖8為在細(xì)菌培養(yǎng)皿中懸浮的聚集的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的圖像。通過相同 的方法,通過懸滴法誘導(dǎo)聚集ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。
[0069]將胚體稀釋于分化培養(yǎng)基中,達(dá)到3/ml的匯合度,隨后將2ml稀釋的胚體注入
0.1%明膠包被的6孔平板的每個孔中進(jìn)行孵育。轉(zhuǎn)移新鮮培養(yǎng)溶液兩次,即,每隔8天轉(zhuǎn)移一次,孵育持續(xù)16天。圖9顯示誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞。
[0070]使用RNeasy_?Mini試劑盒(QIAGEN,Cat.N0.74104)從分化的細(xì)胞中提取總基因(RNA)。使用特異性基因引物和PCR試劑盒(BIOLAB, Cat.N0.E5000)從提取的RNA中獲取多種cDNA,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,并通過ETBR染色進(jìn)行識別。為了保證使用相同量的RNA作為陽性對照(胚胎干細(xì)胞),還一同鑒定了管家基因(肌動蛋白)。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的自發(fā)分化的結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞被分化為NIH3T3去分化細(xì)胞的內(nèi)胚層(AFP)、中胚層(Foxfl)和外胚層(b-1II 微管蛋白)。對于 AFP 而言,5’ -AACTCTGGCGATGGGTGTT-3’用作正義引物,5’ -AAACTGGAAGGGTGGGACA-3’用作反義引物。對于Foxfl而言,5’ -CGTGTGTGATGTGAGGTGAG-3’ 用作正義引物,5’ -CTCCGTGGCTGGTTTCA-3’ 用作反義引物。對于b-1II微管蛋白而言,5’ -TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG-3,用作正義引物,5’-GGCCCTGGGCACATACTTGTG-3’用作反義引物。圖10顯示用于檢查基因是否表達(dá)的圖像,從而證實(shí)NIH3T3去分化細(xì)胞(誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞)的自發(fā)分化能力。
[0071]圖10所示的圖像證實(shí)了內(nèi)胚層、中胚層和外胚層基因在NIH3T3去分化細(xì)胞中表達(dá),這說明NIH3T3去分化細(xì)胞具有自發(fā)分化能力。
[0072]實(shí)施例7.同時使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡和BFA進(jìn)行處理使體細(xì)胞去分化
[0073]用0.1%明膠包被6孔平板,并將8 X IO4個NIH3T3細(xì)胞接種于每個孔并孵育24小時。在用PBS洗滌孔之后,將實(shí)施例1中制備的胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡稀釋于2ml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM,10%FBS, 100U/ml青霉素-鏈霉素)中,使其濃度達(dá)到100 μ g/ml,并將BFA稀釋于2ml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM,10%FBS, 100U/ml青霉素-鏈霉素)中,使其濃度達(dá)到2 μ Μ,隨后用得到的各產(chǎn)物處理孵育的ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞。48小時后,識別出每孔2個細(xì)胞集落至3個細(xì)胞集落,并且細(xì)胞集落的尺寸為約10 μ m至100 μ m。通過電子顯微鏡觀察到的結(jié)果如圖11所示。
[0074]圖11所示的結(jié)果證實(shí)了可誘導(dǎo)細(xì)胞集落產(chǎn)生,甚至當(dāng)同時使用胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡與BFA進(jìn)行處理時,也會誘導(dǎo)細(xì)胞集落產(chǎn)生。
[0075]用PBS洗滌每個孔,并加入400 μ 10.1 X TE(胰蛋白酶-EDTA)。I分鐘后,使用移液器將10μ IlXTE加至細(xì)胞集落中,并將移液器尖端置于細(xì)胞集落的周圍進(jìn)行抽吸。將取出的細(xì)胞集落稀釋于500 μ I胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(knock-out DMEM, 15%knock_out FBS, IOng/ml LIF,0.lmM2-巰基乙醇,4mM L-谷氨酰胺,10 μ g/ml慶大霉素,lOOU/ml青霉素-鏈霉素)中,接種于0.1%明膠包被的24孔平板,并孵育5天或更長的時間。
[0076]如圖11所示,證實(shí)了細(xì)胞集落連續(xù)增殖。
[0077]雖然通過本發(fā)明的一些示例性的實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行了說明和描述,但是,本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的是,在不背離所附的權(quán)利要求界定的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的條件下,可對本發(fā)明作出各種形式上 的改變并在細(xì)節(jié)上對本發(fā)明作出改變。
[0078]【工業(yè)實(shí)用性】
[0079]因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法使用了利用微囊泡融合遞送細(xì)胞質(zhì)的方法,所以,可以預(yù)見到的是,體細(xì)胞的去分化可有效進(jìn)行而沒有副作用,并且本發(fā)明的方法可有效地用于研發(fā)對個體具有不同免疫相容性的細(xì)胞療法產(chǎn)品。
【權(quán)利要求】
1.一種制備誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的方法,所述方法包括: 用包含胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的組合物處理體細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述胚胎干細(xì)胞來源于選自人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述胚胎干細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述胚胎干細(xì)胞為被轉(zhuǎn)化為過表達(dá)作為胚胎干細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)的Oct3/4, Nanog或Sox_2蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述胚胎干細(xì)胞為被轉(zhuǎn)化為表達(dá)選自細(xì)胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細(xì)胞膜融合蛋白以及它們的融合蛋白中的至少一種的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述微囊泡的膜還包括不同于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞膜的成分。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,不同于細(xì)胞膜的成分為環(huán)糊精或聚乙二醇。
8.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述微囊泡的膜成分被化學(xué)修飾。
9.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述組合物還包括不同于胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的成分。
10.如權(quán)利要求9所述的方法,其中,所述不同于胚胎干細(xì)胞衍生的微囊泡的成分為布雷菲爾德菌素A (BFA),BiP誘導(dǎo)物X (BIX)或丙戊酸(VPA)。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法制備的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。
12.—種細(xì)胞療法產(chǎn)品,所述細(xì)胞療法產(chǎn)品包含權(quán)利要求11所述的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/0735GK103492554SQ201280020868
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月28日
【發(fā)明者】鄭多英, 金俊鎬, 樸宰成, 李南雨, 高用柗, 金潤根, 張壽哲, 崔銀廷 申請人:浦項(xiàng)工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
1