專利名稱：一種胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及胚胎干細(xì)胞，更具體地說，涉及一種胚
胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞是來自于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能性細(xì)胞。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞可以通過細(xì)胞融合改變成體細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)特性。體細(xì)胞和胚胎來源的細(xì)胞融合重新編程的關(guān)鍵在于通過細(xì)胞融合，體細(xì)胞核內(nèi)的物質(zhì)可以有效地和胚胎來源細(xì)胞核內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)態(tài)的相互影響，在此過程中，胚胎來源干細(xì)胞有效的改變體細(xì)胞的基因表達(dá)核染色體結(jié)構(gòu)，使其恢復(fù)到未分化的狀態(tài)。研究顯示畸胎瘤細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞(ES cells)和胚胎生殖細(xì)胞(EG cells)等都有相應(yīng)的重新編程體細(xì)胞的能力。 但尚未見有胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞形成的雜合細(xì)胞系的報(bào)道，因此，胚胎干細(xì)胞是否可以通過細(xì)胞融合改變腫瘤細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)特性也未知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系，以提供一種研究腫瘤細(xì)胞的新的模型。 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系的構(gòu)建方法。 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系的應(yīng)用。 本發(fā)明提供的胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系通過胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞融合獲得。 本發(fā)明提供的胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟
A)分別構(gòu)建胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株；
B)胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株融合。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述方法還包括雜合細(xì)胞的篩選步驟。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述方法還包括雜合細(xì)胞單克隆株構(gòu)建的步驟。 本發(fā)明提供的胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系的應(yīng)用為用于構(gòu)建去分化的
腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用。 本發(fā)明提供的胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系的應(yīng)用為用于構(gòu)建腫瘤細(xì)胞模型。 本發(fā)明提供的雜合細(xì)胞，為進(jìn)一步的研究腫瘤的發(fā)生和惡化提供了一種全新的模型，使用本發(fā)明提供的方法，可以構(gòu)建新的雜合細(xì)胞模型，從而從全新的角度研究腫瘤表觀遺傳學(xué)，對(duì)未來的臨床治療提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)，將會(huì)全面推動(dòng)腫瘤的基礎(chǔ)研究。


圖1是融合前胚胎干細(xì)胞E14和腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞系的熒光檢測結(jié)果，其中，
圖1A為E14的熒光檢測結(jié)果，圖IB為腫瘤細(xì)胞H印al-6細(xì)胞的熒光檢測結(jié)果。 圖2是雜合細(xì)胞的表型的熒光檢測結(jié)果，其中，圖A-C依次為胚胎干細(xì)胞樣，成纖
維樣，和上皮樣細(xì)胞表型的雜合細(xì)胞，l-4分別為相應(yīng)細(xì)胞樣的明場圖像，綠色熒光標(biāo)記圖
像、紅色熒光標(biāo)記圖像、紅色和綠色熒光重疊圖像。 圖3是胚胎干細(xì)胞，成體腫瘤細(xì)胞H印al-6以及雜合細(xì)胞的染色體核型與DNA含 量檢測結(jié)果示意圖，其中，A-C依次代表胚胎干細(xì)胞，成體腫瘤細(xì)胞H印al-6以及雜合細(xì)胞， 1和2分別為染色體核型檢測結(jié)果與DNA含量檢測結(jié)果的示意圖。 圖4是雜合細(xì)胞的基因表達(dá)的電泳圖，其中，圖4A為E14(1)、 H印al-6(2)、 EH0926(3)和EH0929(4)中多能性基因0CT4、 Rexl、 Nanog、 S0X2和組織特異性基因TTR、 ALB的表達(dá)檢測結(jié)果；圖4B為胚胎干細(xì)胞ES(l)、成體腫瘤H印all-6(2)和雜合細(xì)胞 ESXH印al-6(3)中腫瘤抑制基因P19、 P16、原癌基因C-fos和P actin的表達(dá)檢測結(jié)果。
圖5是雜合細(xì)胞在體外形成擬胚體的檢測結(jié)果，其中，圖5A是明場下的擬胚體的 檢測結(jié)果，圖5B是融合細(xì)胞形成的擬胚體表達(dá)的紅色熒光的觀測結(jié)果；圖5C是融合細(xì)胞形 成的擬胚體表達(dá)的綠色熒光的觀測結(jié)果；圖5D是圖5B和圖5C的重疊影像。
圖6是胚胎干細(xì)胞(A)，成體腫瘤H印al-6(B)和雜合細(xì)胞(C)在體外形成的腫瘤 細(xì)胞的組織切片檢測結(jié)果，其中，圖6A中切片圖1-4分別為四倍鏡下畸胎瘤組織類型的切 片圖；二十倍鏡下神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的切片圖；二十倍鏡下脂肪組織的切片圖；二十倍鏡下肌 肉組織的切片圖；圖6B中的切片圖1為四倍鏡下H印al-6的組織類型的切片圖；切片圖2 為二十倍鏡下腫瘤組織的邊緣圖片的切片圖，切片圖3為二十倍鏡下腫瘤組織的內(nèi)部圖片 的切片圖；圖6C中切片圖1-4分別為四倍鏡下畸胎瘤組織類型的切片圖；二十倍鏡下神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞的切片圖；二十倍鏡下脂肪組織的切片圖；二十倍鏡下肌肉組織的切片圖，其中， 箭頭所指為未分化神經(jīng)管組織。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。
在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的E14細(xì)胞系購自于中科院干細(xì)胞平臺(tái)(其編號(hào) 為SCSP-205)，腫瘤細(xì)胞H印al-6(肝癌細(xì)胞)購自于中科院細(xì)胞庫(其編號(hào)為TCM30)，來 自于小鼠肝癌，是分化程度高的成體腫瘤細(xì)胞。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的慢病毒Hygromycin-RFP參考文獻(xiàn)Jo 1 anta Szulc et.al. A Versatile Tool for Conditional Gene Expression and Knockdown. Nature Methods, 3， 109-116 (2006)中提供的方法構(gòu)建。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的TE buffer、 Buffer EC、促進(jìn)反應(yīng)緩沖液 (enhancer)和改良的脂類轉(zhuǎn)染試劑(Effectene Transfection Reagent)均為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試 劑盒內(nèi)試劑，該試劑盒購自Qiagen ;G418購自Gibco BRL ;4， 6-聯(lián)脒_(dá)2_苯基吲哚二鹽酸鹽
4(DAPI)和Rnase購自Sigma ;碘化丙啶(Propidium Iodide)購自Invitrogen ;GAPDH購自
上海生工合成；PEGFPC1 DNA購自Clontech ;2XSYBRGreen master mix購自Qiagen。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的TRIzol總RNA抽提試劑盒購自上海生工生物工
程技術(shù)服務(wù)有限公司；RT-PCR試劑盒購自上海申能博采生物技術(shù)公司。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的nu小鼠購自中科院動(dòng)物中心。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基的配方為每400ml培養(yǎng)基
含有343. 2ml格拉斯哥極限必需培養(yǎng)基，40ml 10%FBS，4ml 0. lmM非必需氨基酸，4ml lmM
丙酮酸鈉，O. lmM P巰基乙醇，40ul 1000U/ml LIF， 2ml青霉素-鏈霉素雙抗。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中的"融合母體細(xì)胞"指的是融合前的細(xì)胞。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，由于轉(zhuǎn)染成功的E14細(xì)胞系具有潮霉素抗性，因此，可
使用潮霉素(Hygromycin)篩選轉(zhuǎn)染后的E14細(xì)胞系；由于H印al-6細(xì)胞內(nèi)具有新霉素抗
性，因此，可使用G418篩選H印al-6細(xì)胞系。聯(lián)合兩種抗生素可以篩選融合后的融合細(xì)胞系。 ^ML丄、融合前的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建
1. 1、胚胎干細(xì)胞E14單克隆細(xì)胞株構(gòu)建 參照Gondon keller建立起來的無滋養(yǎng)層胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法(Keller G M. In vitrodifferentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol，1995，7: 862-869.)，培養(yǎng)E14細(xì)胞系，獲得克隆樣的E14細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)2 X 105，培養(yǎng)過夜。
第二天在細(xì)胞中，加入慢病毒Hygromycin-RFP，于37。C孵育2小時(shí)后，離心，棄上 清，使用PBS清洗細(xì)胞沉淀2遍，向清洗后的細(xì)胞沉淀中加入新鮮胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù) 培養(yǎng)； 在轉(zhuǎn)染24-36小時(shí)后，于顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染慢病毒的E14細(xì)胞的熒光表達(dá)，熒光檢 測結(jié)果如圖1A所示。圖1A的結(jié)果顯示，E14細(xì)胞已帶有顏色，證明轉(zhuǎn)染成功，可用于細(xì)胞融合。 在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，加入潮霉素200 y g/ml，篩選兩周后，挑取單克隆建系，獲得帶 有Hygromycin抗性和RFP熒光表達(dá)的胚胎干細(xì)胞單克隆株。
1. 2J中瘤細(xì)胞H印al-6單克隆細(xì)胞株構(gòu)建 培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞H印al-6，獲得H印al-6細(xì)胞，并于細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天計(jì)數(shù)2 X 105。
將培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞H印al-6鋪于加有5ml培養(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿中，于37°C ，置于 5%0)2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。 取1 ii g PEGFPC1DNA溶于TE buffer中，使其濃度為1 P g/ P 1 ;然后加入Buffer EC至總體積為150iU，再加8iU enhancer吹打一次，并于室溫下孵育2_5分鐘，然后，向 離心管中加入25iU Effectene Transfection Reagent,并上下吹打5次，于室溫下放置 5-10分鐘。 移去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，然后加4mlPBS清洗H印al-6細(xì)胞一次，再向培養(yǎng)皿中加 入4ml新鮮的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基； 另取lml培養(yǎng)基加至加入了 25ii 1 Effectene Transfection Reagent的離心管 中，上下吹打兩次后立即加入到加有4ml新鮮的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并 輕柔晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使其與培養(yǎng)基混合；放置入37°C，5% C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時(shí)后，熒光
5顯微鏡下觀察，熒光檢測結(jié)果如圖1B所示。 圖IB的結(jié)果顯示，ES細(xì)胞已帶有顏色，證明轉(zhuǎn)染成功，可以用于細(xì)胞融合。
于48小時(shí)后，向培養(yǎng)皿中加入500ug/ml新霉素(Neomycin)G418，進(jìn)行篩選，兩周 后，從培養(yǎng)基上挑取單克隆培養(yǎng)，建系，獲得帶有neomycin抗性和GFP熒光表達(dá)的腫瘤細(xì)胞 單克隆株。 ^MMl、細(xì)胞融合及雜合細(xì)胞單克隆株構(gòu)建 分別將穩(wěn)定建系帶有Hygromycin抗性RFP熒光表達(dá)的胚胎干細(xì)胞和帶有 neomycin抗性GFP熒光表達(dá)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，具體過程如下 融合前進(jìn)行細(xì)胞消化，并分別計(jì)數(shù)5X 106個(gè)細(xì)胞，使得待融合的胚胎干細(xì)胞和腫 瘤細(xì)胞的比例為1 : 1，充分混合兩種細(xì)胞后，于lOOOrpm離心10分鐘，完全棄去液體；然 后，輕輕震蕩離心管下側(cè)，使沉淀完全松散；向離心管中緩慢加入lml預(yù)熱的50% PEG1500, 加入時(shí)間持續(xù)1分鐘，吹打細(xì)胞1-2分鐘；向離心管中加入1ml預(yù)熱的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基， 吹打細(xì)胞1分鐘；再向離心管中加入3ml預(yù)熱的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞3分鐘；加 10ml預(yù)熱的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，于37t:孵育5分鐘后，于lOOOrpm離心10分鐘，并棄去上 清； 向沉淀中加入10ml新鮮的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，并種于10cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小 時(shí)后，鏡下觀察，根據(jù)觀測結(jié)果，可見帶有雙熒光的融合細(xì)胞；
培養(yǎng)48小時(shí)后，加入新霉素和潮霉素抗生素進(jìn)行篩選； 篩選兩周內(nèi)，每日鏡下觀察細(xì)胞并記錄觀測結(jié)果，其中，圖2為融合篩選兩周后的 觀測結(jié)果。 圖2結(jié)果顯示，在和胚胎干細(xì)胞融合之后，熒光和抗性雙陽性的細(xì)胞有三種表型 A、胚胎干細(xì)胞克隆樣生長表型這種雜合細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞表型類似，為緊實(shí)生長的克隆 樣，邊緣光滑整齊，內(nèi)部細(xì)胞輪廓不清。這種細(xì)胞占所有雜合細(xì)胞的5%左右，貼壁不牢。第 二代挑單克隆建系后即進(jìn)入生長停滯期，逐漸的發(fā)生調(diào)亡。所挑的六個(gè)克隆均不能存活；B、 成纖維細(xì)胞樣表型這種類型的雙陽性細(xì)胞占所有雜合細(xì)胞的10%_15%左右。細(xì)胞大，長 寬之比約為6 : 1，內(nèi)有2-3個(gè)細(xì)胞核，核質(zhì)比為1 : 3-4。細(xì)胞倍增速度慢，達(dá)到80%匯合 后可以形成漩渦樣生長。單克隆挑選時(shí)間較其他兩種類型細(xì)胞晚，為4-5周。建系2代后 細(xì)胞逐漸生長停滯。在第4代左右即死亡；C、扁平樣克隆表型85%融合后的雙陽性細(xì)胞為 該種表型，細(xì)胞呈克隆樣生長，但扁平，邊緣不光滑，內(nèi)部細(xì)胞清晰可見，輪廓清楚。細(xì)胞長 寬比小于2，為典型上皮樣細(xì)胞表型。細(xì)胞核質(zhì)比大。于融合后12天單克隆挑選建系，所挑 的6個(gè)克隆均能穩(wěn)定生長，生長速度與第一代無異。細(xì)胞在體外生長40代，表型無變化，凍 存后的細(xì)胞亦可穩(wěn)定生長。 根據(jù)圖2結(jié)果，帶有雙熒光的融合細(xì)胞系已經(jīng)建立；然后，在熒光顯微鏡下找到紅 綠上雙陽性細(xì)胞克隆，挑取2株單克隆，擴(kuò)大建系，分別命名為EH0926和EH0929。
實(shí)施例3、穩(wěn)定性檢測 由于雜合體細(xì)胞是四倍體細(xì)胞，和正常的二倍體細(xì)胞染色體不同，因此，為了確定 獲得的雜合體細(xì)胞是否穩(wěn)定，在本實(shí)施例中，制備了雜合細(xì)胞染色體標(biāo)本，并使用流式細(xì)胞 儀檢測了雜合細(xì)胞的DNA含量，具體制備過程如下
3. 1、細(xì)胞染色體標(biāo)本制備
6
取實(shí)施例2中獲得的雜合細(xì)胞，采用常規(guī)方法，將其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，停止培 養(yǎng)，除去培養(yǎng)液，然后用PBS洗滌細(xì)胞，再加入含O. lii g/ml秋水仙素的細(xì)胞培養(yǎng)液(0. lii g 秋水仙素+lmlPBS)作用4小時(shí)后，離心，收集細(xì)胞沉淀。用0. 25 % Trypsin/EDTA消化細(xì)胞2min，再加入培養(yǎng)基終止反應(yīng)，獲得單細(xì)胞懸 液。并將消化處理過后的細(xì)胞懸液于1000rpm離心，收集沉淀并用PBS洗兩次，lOOOrpm離 心，收集細(xì)胞沉淀，使用0. 075M的KC1低滲液重懸細(xì)胞沉淀后，于37t:作用30分鐘；
然后于lOOOrpm離心5分鐘，將收集獲得的細(xì)胞沉淀用固定液(3 : 1的甲醇冰 醋酸)重懸并固定20分鐘； 再次于lOOOrpm離心5分鐘，將收集獲得的細(xì)胞沉淀用固定液重懸，獲得細(xì)胞懸 液；取冰凍載玻片，將細(xì)胞懸液滴在冰凍載玻片上，并迅速將載玻片通過酒精燈火焰2 3 次；用DAPI染色10分鐘后，自來水沖洗，自然晾干； 然后，于熒光顯微鏡下觀察，并記錄染色體數(shù)目。選擇30個(gè)分散良好的分裂相，鏡 下記數(shù)，以進(jìn)行染色體數(shù)目分析。檢測結(jié)果如圖3-1所示，并取胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞作為 對(duì)照。 3. 2、細(xì)胞的DNA含量檢測 取實(shí)施例2中獲得的雜合細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后分別取第2、14代對(duì)數(shù)生長期 的細(xì)胞進(jìn)行如下處理使用PBS清洗細(xì)胞3次后，再使用0. 25% Trypsin/EDTA消化細(xì)胞 2-3min，然后加入培養(yǎng)基以終止消化，并用洗管將消化后的細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)吹打，至獲得單細(xì) 胞懸液。 將消化終止后的細(xì)胞用PBS洗兩次，lOOOrpm離心后，收集細(xì)胞沉淀，并用75%的 酒精重懸，于-2(TC固定過夜； 然后，分別使用75%的酒精和PBS洗滌固定后的細(xì)胞各三次；再使用lOOii g/ml Rnase在37。C處理30分鐘；再用40ug/ml的propidium iodide染色后上流式細(xì)胞儀，觀察 DNA含量的變化，結(jié)果如圖3-2所示，并取胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照。
根據(jù)圖3結(jié)果，與融合母體細(xì)胞相比，在胚胎干細(xì)胞與成體腫瘤H印al-6的雜合細(xì) 胞中，染色體數(shù)目和DNA的含量均獲得加倍。在細(xì)胞周期方面，雜合細(xì)胞的周期偏向于胚胎 干細(xì)胞。另外，來源于肝臟的腫瘤的染色體數(shù)目并不均一，為非穩(wěn)定的二倍體核型，其DNA 含量也沒有在正常細(xì)胞的二倍體峰值上。雜合細(xì)胞與融合母體細(xì)胞的細(xì)胞周期的對(duì)比結(jié)果 顯示，雜合細(xì)胞的細(xì)胞周期類型偏向于胚胎干細(xì)胞，而非成體腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例4、細(xì)胞總RNA抽提 為了檢測雜合體細(xì)胞的基因表達(dá)，在本實(shí)施例中，采用RT-PCR方法檢測了雜合細(xì) 胞的分子特征，以b-actin作為對(duì)照，具體過程如下
4. 1、細(xì)胞總RNA抽提 參考生產(chǎn)廠商提供的方法，分別使用TRIzol總RNA抽提試劑盒，分別抽取各個(gè)細(xì) 胞的總RNA，然后使用分光光度計(jì)檢測抽提的RNA的純度與含量。
4. 2、cDNA的合成 按廠商提供的方法，使用RT-PCR試劑盒合成cDNA，其中， 反應(yīng)體系(25 ill)為細(xì)胞RNA樣品2 ii g，隨機(jī)引物3 iil， Rnase Free ddH20 10 ii 1。
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反應(yīng)過程為70。C，10min。冰上驟冷，lmin。短暫離心。加入10mM dNTP 1.5iU， Rnase Inhibitor 0. 5 li 1 (25皿its) ， M-匪LV Reverse Transcriptase 1 li 1 (200皿its)， 5XRNA PCRBuffer 5iU，Rnase Free ddH20 4 ii 1，輕彈，PCR儀中37°C ， 100min。
反應(yīng)結(jié)束后，獲得cDNA，并用P-actin檢測，結(jié)果顯示各個(gè)細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄后的次DNA
量相一致。 4. 3、 RT-PCR和Q-PCR檢測細(xì)胞的分子特征 設(shè)計(jì)用于RT-PCR反應(yīng)的引物，所使用的引物的序列如表1所示。
表1、引物序列及其應(yīng)用
引物 序列 P actin(F;) GGTGGGAATGGGTCAGAAGG 0 actin(R) AGGAAGAGGATGCGCCAGTG SOX2(F) CGACCGGCGGCAACCAGAAGAACA SOX2 (R) GCCGGCGCCCACCCCAACC Nanog(F) AAGTACCTCAGCCTCCAGCAGATG
作用 RT-PCR RT-PCR RT-PCR RT-PCR RT-PCR
Nanog(R)AGAAAGTCCTCCCCGAAGTTATGGRT-PCR
OCT4(F)AGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTART-PCR
OCT4 (R)丁GGGGGCAGAGGAAAGGATACAGCRT-PCR
Rexl(F)GAAGCACATGCTTGTCCACGGRT-PCR
Rexl(R)GCCTTTGCGTGGGTTAGGATGRT-PCR
p19 (ARF) (F)ATGGGTCGCAGGTTCTTGRT-PCR
pl9(ARF)(R)GTGCTTGAGCTGAAGCTART-PCR
p16 (Ink4a) (F)ATGGAGTCCGCTGCAGACAGART-PCR
pl6(Ink4a)(R)GTGCTTGAGCTGAAGCTART-PCR
Ofos senseGGTCATCGGGGATCTTGCRT-PCR
C-fos antisenseATGGGCTCTCCTGTCAACRT-PCR
ALB (F)GCTACGGCACAGTGCTTGRT-PCR
ALB (R)CAGGATTGCAGACAGATAGTCRT-PCR
TTR (F)CTCACCACAGATGAGAAGRT-PCR
TTR (R)GGCTGAGTCTCTCAATTCRT-PCR
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使用上述用于RT-PCR反應(yīng)的引物，通過RT-PCR反應(yīng)檢測雜合細(xì)胞的分子特征，其
中，反應(yīng)體系為cDNA模板0. 5 iil， 10mM dNTP 0. 5 yl， Taq酶0. 5 y 1，上下游PCR引物各
0. 5iU，PCR緩沖液(10X)5ii1，以ddH20補(bǔ)足50ii1反應(yīng)體系。 取上述RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。 圖4A的結(jié)果顯示，在胚胎干細(xì)胞和成體腫瘤細(xì)胞H印al-6融合所得到的雜合細(xì)胞
中，來源于肝臟的特異性基因TTR和ALB表達(dá)消失，而多能性基因如0CT4、Nanog、S0X2重新
表達(dá)腫瘤細(xì)胞的多能性表達(dá)增高或者可以完全重新表達(dá)。 圖4B的結(jié)果顯示，腫瘤抑制基因P19和P16在胚胎干細(xì)胞和雜合細(xì)胞中均有表 達(dá)，根據(jù)該結(jié)果，在得到的雜合細(xì)胞中，腫瘤抑制因子表達(dá)狀態(tài)發(fā)生了改變。原先完全不 表達(dá)腫瘤抑制基因的H印al-6在與胚胎干細(xì)胞融合之后，腫瘤抑制基因重新表達(dá)。在原癌 基因組，經(jīng)過篩選，我們找到了在腫瘤中表達(dá)量高但是在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)量極低的基因 C-fos。在成體腫瘤中，C-fos的表達(dá)相對(duì)畸胎瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞有明顯的區(qū)別，而在雜 合細(xì)胞中，C-fos表達(dá)量相對(duì)融合母體腫瘤細(xì)胞明顯降低，說明通過胚胎干細(xì)胞融合，腫瘤 細(xì)胞的確發(fā)生了重新編程。 根據(jù)上述圖4結(jié)果，腫瘤細(xì)胞通過與胚胎干細(xì)胞融合，腫瘤基因表達(dá)方式發(fā)生了 變化。 實(shí)施例5、 擬胚體(EB)的培養(yǎng) 由于能否在體外無白血病抑制因子(LIF)培養(yǎng)的條件下形成擬胚體(EB)，是檢測 多能性的重要指標(biāo)，因此，在本實(shí)施例中，進(jìn)行了 EB的培養(yǎng)，以檢測雜合體細(xì)胞是否具有多 能性，具體培養(yǎng)過程如下 0.25X胰酶消化ES細(xì)胞后，用吸管吹打成單細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)1_2乂106，換成不加 LIF的擬胚體細(xì)胞全培養(yǎng)基，置于不貼壁的培養(yǎng)皿中，懸浮培養(yǎng)；每天吹打兩次，避免細(xì)胞 貼壁；每兩天換液一次，鏡下觀察，第5天的觀測結(jié)果如圖5所示。 其中，圖5A是明場下的擬胚體的檢測結(jié)果，說明雜合體細(xì)胞具有分化潛能；圖5B 是融合細(xì)胞形成的擬胚體表達(dá)的紅色熒光的觀測結(jié)果，說明雜合體細(xì)胞的一部分來源于胚 胎干細(xì)胞細(xì)胞；圖5C是融合細(xì)胞形成的擬胚體表達(dá)的綠色熒光的觀測結(jié)果，說明雜合體細(xì) 胞的一部分來源于腫瘤細(xì)胞。 圖5結(jié)果顯示，雜合細(xì)胞也可以在去除LIF和滋養(yǎng)層細(xì)胞以后自發(fā)形成擬胚體。
胚胎干細(xì)胞具有多能性的指標(biāo)之一就是胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，在去除LIF和 滋養(yǎng)層細(xì)胞以后，胚胎干細(xì)胞將自動(dòng)分化為與種植后胚胎組織相似的具有三個(gè)胚層的擬胚 體(EB)。因此，根據(jù)圖5結(jié)果，即使腫瘤細(xì)胞已高度分化，依然可以通過與胚胎干細(xì)胞融合
以后被重新編程，回復(fù)到多能態(tài)。
實(shí)施例6、
細(xì)胞致瘤性檢測 參照Gondon keller建立起來的無滋養(yǎng)層胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)E14細(xì)胞，然 后將2乂107個(gè)融合前和融合后的細(xì)胞分別移植到皿小鼠皮下(n = 3)，觀察兩個(gè)月，采用 免疫組化方法分析組織類型的區(qū)別，以檢測腫瘤的形成，其中，待腫瘤形成后當(dāng)其體積大于 1立方厘米時(shí)取材，進(jìn)行組織切片的HE染色，于鏡下進(jìn)行觀測，結(jié)果如圖6所示。
圖6結(jié)果顯示，胚胎干細(xì)胞形成畸胎瘤的時(shí)間為3-4周，在組織切片中可見三個(gè)胚
層的組織類型，包括代表外胚層的神經(jīng)膠質(zhì)和角化上皮組織；代表中胚層的肌肉和脂肪組
織；代表內(nèi)胚層的管狀上皮等，充分說明了胚胎干細(xì)胞廣泛的分化潛能。 在胚胎干細(xì)胞的組織切片中，成熟細(xì)胞占到整個(gè)組織的80%以上，只有20%左右
呈現(xiàn)典型的未分化成熟細(xì)胞，表現(xiàn)為核質(zhì)比大，細(xì)胞呈惡行性生長。成體腫瘤H印al-6在
小鼠體內(nèi)在3-4周可以形成腫瘤，為均一未分化成熟的肝癌細(xì)胞組織類型，表現(xiàn)為核質(zhì)比
大，細(xì)胞呈多核和分頁核。切片可見癌巢組織，其間有壞死灶生成。胚胎干細(xì)胞和成體腫
瘤H印al-6形成的畸胎瘤中，可見三個(gè)胚層的細(xì)胞類型，具有一定的分化潛能。但是成熟細(xì)
胞所占比例比胚胎干細(xì)胞形成的成熟細(xì)胞比例低，未成熟組織占到整個(gè)組織切片的70%以
上。雖然沒有明顯的未成熟神經(jīng)管類型，但是可見到典型的癌巢組織。 因此，根據(jù)圖6結(jié)果，雖然通過與胚胎干細(xì)胞融合，腫瘤細(xì)胞仍未改變其惡型性。 綜上所述，本研究證明了成體細(xì)胞可以被胚胎干細(xì)胞重新編程，表現(xiàn)為迥然不同
的細(xì)胞形態(tài)，生長特性及發(fā)育潛能，并且在和腫瘤細(xì)胞融合的試驗(yàn)中證實(shí)了胚胎干細(xì)胞可
以在某種程度上改變腫瘤細(xì)胞的發(fā)育潛能和基因表達(dá)方式。 證實(shí)腫瘤細(xì)胞可以通過與胚胎干細(xì)胞融合而發(fā)生重新編程，體現(xiàn)于基因表達(dá)、分 化狀態(tài)及表觀遺傳學(xué)調(diào)控發(fā)生變化。但是這種重新編程是不完全的，腫瘤細(xì)胞雖然可以恢 復(fù)為胚胎性質(zhì)，但是腫瘤源性并沒有完全改變。腫瘤細(xì)胞通過融合被重新編程為胚胎性質(zhì) 的腫瘤細(xì)胞，而這種細(xì)胞的建立可以通過分化，進(jìn)一步了解腫瘤基因在表觀遺傳學(xué)上發(fā)生 的改變。 本發(fā)明提供的雜合細(xì)胞，為進(jìn)一步的研究腫瘤的發(fā)生和惡化提供了一種全新的模 型，使用本發(fā)明提供的方法，可以構(gòu)建新的雜合細(xì)胞模型，從而從全新的角度研究腫瘤表觀 遺傳學(xué)，對(duì)未來的臨床治療提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)，將會(huì)全面推動(dòng)腫瘤的基礎(chǔ)研究。
權(quán)利要求
一種胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系。
2. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系通過胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞融合獲得。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述胚胎干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞E14細(xì)胞。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述肝癌細(xì)胞H印al-6細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A) 分別構(gòu)建胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株；B) 胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株融合。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括雜合細(xì)胞的篩選步驟。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括雜合細(xì)胞單克隆株構(gòu)建的步驟。
9. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述細(xì)胞系用于構(gòu)建去分化的腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述細(xì)胞系用于構(gòu)建腫瘤細(xì)胞模型的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系，以及該細(xì)胞系的構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雜合細(xì)胞系通過胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞融合獲得，其構(gòu)建方法包括以下步驟A)分別構(gòu)建胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株；B)胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株融合。本發(fā)明提供的細(xì)胞系可用于構(gòu)建腫瘤細(xì)胞模型。本發(fā)明提供的雜合細(xì)胞，為進(jìn)一步研究腫瘤的發(fā)生和惡化提供了一種全新的模型，使用本發(fā)明提供的方法，可以構(gòu)建新的雜合細(xì)胞模型，從而從全新的角度研究腫瘤表觀遺傳學(xué)，對(duì)未來的臨床治療提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)，將會(huì)全面推動(dòng)腫瘤的基礎(chǔ)研究。
文檔編號(hào)C12N5/16GK101760452SQ20081020286
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者姚嘉宜, 王欣 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院