技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法。

背景技術(shù)：
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豬是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是生物醫(yī)學(xué)模型動(dòng)物，其生殖調(diào)控研究既可以為人類生殖生理和病理過(guò)程研究提供參考，又可以為提高豬的繁殖性能提供理論依據(jù)。然而,繁殖力低下是目前困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)難題。繁殖力低體現(xiàn)在各個(gè)階段，包括卵減數(shù)分裂成熟率低、受精后早期胚胎發(fā)育率低、妊娠率及活仔率低等。其中，豬卵成熟和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的高比率損失已成為一個(gè)重要問(wèn)題，因此，提高豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，對(duì)于提升豬生產(chǎn)效率來(lái)說(shuō)，具有重要意義。為了提高人類體外受精(invitrofertilization,ivf)的成功率，通常移植數(shù)枚胚胎，但這樣會(huì)增加多重受孕的危險(xiǎn)。在移植單卵的情況下，為了提高成功率，則需要一個(gè)鑒定高量胚胎的可靠方法。以往的評(píng)分系統(tǒng)都是以形態(tài)學(xué)指標(biāo)為基礎(chǔ)的，包括原核形態(tài)學(xué)，卵裂率，卵裂球數(shù)量和形態(tài)等，這些指標(biāo)與胚胎活力有密切關(guān)系。胚胎初次卵裂時(shí)間也是一個(gè)挑選用來(lái)移植或冷凍的高質(zhì)量胚胎的標(biāo)準(zhǔn)。一般認(rèn)為卵裂球體積越大，發(fā)育能力越強(qiáng)。

現(xiàn)有的測(cè)量方法是直徑估算法（如圖1所示），但是該方法對(duì)豬2細(xì)胞胚胎體積的估算不夠準(zhǔn)確，此外，同一胚胎在旋轉(zhuǎn)90度后，觀察到的體積會(huì)有較大變化（如圖2所示）。故有必要研發(fā)一種新的有效測(cè)量豬2細(xì)胞胚胎體積的方法，有助于評(píng)估豬卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法。

上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，其組成包括：豬2細(xì)胞，該方法包括如下步驟：

（1）制作回歸曲線

a、將2細(xì)胞卵裂胚胎染色，將極體置于胚胎12點(diǎn)鐘位置，在顯微鏡下拍照，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx1、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly1、右邊細(xì)胞寬度rx1、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry1；

b、沿卵裂溝方向旋轉(zhuǎn)90度，將極體旋轉(zhuǎn)至胚胎上方，拍攝第2張照片，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx2、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly2、右邊細(xì)胞寬度rx2、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry2；

c、由步驟a、b測(cè)量取得的lx1、lx2、ly1、ly2、rx1、rx2、ry1、ry2按照橢圓體計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積；

d、然后用鏈酶蛋白酶去除透明帶，分離2細(xì)胞，在顯微鏡下拍照，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly、右邊細(xì)胞寬度rx、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry；

e、由步驟d測(cè)量取得的lx、rx、ly、ry計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積；

f、步驟c計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積認(rèn)為是估計(jì)值，步驟e計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積認(rèn)為是實(shí)際值，按照上述方法測(cè)量10枚胚胎，計(jì)算取得回歸曲線，得到回歸方程；

（2）測(cè)量豬2細(xì)胞胚胎兩個(gè)細(xì)胞的體積，并計(jì)算預(yù)估體積：

經(jīng)過(guò)步驟a、b的測(cè)量并根據(jù)回歸方程計(jì)算，不用去除透明帶就可以得出豬2細(xì)胞胚胎體積，用于后續(xù)活體培養(yǎng)，評(píng)估胚胎發(fā)育能力。

所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的胚胎染色劑為hoechst33342。

所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的步驟a、b、d中，拍照時(shí)，連續(xù)五次聚焦照片確保取得長(zhǎng)度最大值。

所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的步驟d中，當(dāng)分離2細(xì)胞后，若2細(xì)胞大小較為接近，去除透明帶時(shí)為了防止混淆左側(cè)細(xì)胞和右側(cè)細(xì)胞，用持卵針在左側(cè)細(xì)胞稍微用力吸出一個(gè)小突起，分離后可以辨認(rèn)，放入二氧化碳培養(yǎng)箱恢復(fù)1小時(shí)，每隔20分鐘檢查和翻動(dòng)細(xì)胞，防止細(xì)胞變?yōu)楸馄?，待其變?yōu)榍蝮w，在顯微鏡下拍照。

所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的去透明帶前，細(xì)胞形態(tài)認(rèn)為是接近橢圓體，計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積，公式為：測(cè)量體積=（x1+x2）/2×y1×y2×1/6×π。

所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的去透明帶后，細(xì)胞形態(tài)認(rèn)為是球體，計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積，公式為：測(cè)量體積=1/6×π×[（x+y）/2]3。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明通過(guò)在顯微鏡下對(duì)豬2細(xì)胞胚胎進(jìn)行拍照并測(cè)量，制作回歸曲線，得到回歸方程，然后通過(guò)簡(jiǎn)單拍照并測(cè)量，即可得到較為精確的胚胎體積，有利于進(jìn)一步研究提高豬胚胎的發(fā)育潛能，提升豬生產(chǎn)效率，是一個(gè)鑒定高質(zhì)量胚胎的可靠方法。

本發(fā)明參照表1：對(duì)10枚胚胎進(jìn)行測(cè)量結(jié)果如下（附圖說(shuō)明中的附圖11中顯示）參照表2：對(duì)10枚胚胎進(jìn)行計(jì)算，得到如下數(shù)據(jù)（附圖說(shuō)明中的附圖12中顯示）：

用去透明帶后（實(shí)際值）20個(gè)數(shù)據(jù)（左右各十個(gè)）對(duì)去透明帶前（估計(jì)值）20個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行直線回歸（如圖8所示），r2=0.9885擬合度好，得到回歸方程：y=1.04x+7.67。其中，y為去透明帶后實(shí)際測(cè)量值計(jì)算得到結(jié)果，x為根據(jù)去透明帶前2細(xì)胞卵裂球測(cè)量結(jié)果計(jì)算值。

、根據(jù)回歸曲線，經(jīng)過(guò)步驟a、b的測(cè)量圖9胚胎，用回歸方程：y=1.04x+7.67計(jì)算得出體積。不用去除透明帶就可以得出豬2細(xì)胞胚胎體積左邊269μm3，右邊418μm3，用于后續(xù)活體培養(yǎng)，評(píng)估胚胎發(fā)育能力。

本實(shí)施例仍然去除透明帶分離2細(xì)胞，得到圖10細(xì)胞，實(shí)測(cè)計(jì)算得出實(shí)際體積為左邊286μm3，為測(cè)量估計(jì)值的1.06倍，右邊433μm3，為測(cè)量估計(jì)值的0.98倍，以驗(yàn)證本發(fā)明可信度。

由以上測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道，通過(guò)本發(fā)明的方法估算的豬2細(xì)胞胚胎體積誤差值可以控制在10%以內(nèi)。

附圖說(shuō)明：

附圖1是傳統(tǒng)的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法：直徑估算法示意圖。

附圖2是同一胚胎旋轉(zhuǎn)90度后照片數(shù)據(jù)變化示意圖。

附圖中：a為極體在12點(diǎn)鐘位置；圖中b為極體旋轉(zhuǎn)90度后的位置。

附圖3是去透明帶前，豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量示意圖。

附圖4是同一胚胎旋轉(zhuǎn)90度后極體位置變化3d模擬示意圖。

圖中：a為極體在12點(diǎn)鐘位置；圖中b為極體旋轉(zhuǎn)90度后，在胚胎上方。

附圖5是去透明帶分離2細(xì)胞后，細(xì)胞示意圖。

附圖6是去除透明帶時(shí)為了防止混淆示意圖。

附圖7是豬2細(xì)胞胚胎，細(xì)胞分離后體積測(cè)量實(shí)例圖。

附圖8是實(shí)施例1中的回歸曲線示意圖。

圖中y為去透明帶后實(shí)際測(cè)量值計(jì)算得到結(jié)果；圖中x為根據(jù)去透明帶前2細(xì)胞卵裂球測(cè)量結(jié)果計(jì)算值。

附圖9是實(shí)施例1，去透明帶前，豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量實(shí)例圖。

附圖10：實(shí)施例1，豬2細(xì)胞胚胎，細(xì)胞分離后體積測(cè)量實(shí)例圖。

附圖11是對(duì)10枚胚胎進(jìn)行測(cè)量結(jié)果的表格圖。

附圖12是對(duì)10枚胚胎進(jìn)行計(jì)算，得到數(shù)據(jù)表格圖。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：

一種豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，其組成包括：豬2細(xì)胞，該方法包括如下步驟：

（1）制作回歸曲線

a、將2細(xì)胞卵裂胚胎染色，將極體置于胚胎12點(diǎn)鐘位置，在顯微鏡下拍照，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx1、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly1、右邊細(xì)胞寬度rx1、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry1；

b、沿卵裂溝方向旋轉(zhuǎn)90度，將極體旋轉(zhuǎn)至胚胎上方，拍攝第2張照片，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx2、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly2、右邊細(xì)胞寬度rx2、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry2；

c、由步驟a、b測(cè)量取得的lx1、lx2、ly1、ly2、rx1、rx2、ry1、ry2按照橢圓體計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積；

d、然后用鏈酶蛋白酶去除透明帶，分離2細(xì)胞，在顯微鏡下拍照，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly、右邊細(xì)胞寬度rx、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry；

e、由步驟d測(cè)量取得的lx、rx、ly、ry計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積；

f、步驟c計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積認(rèn)為是估計(jì)值，步驟e計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積認(rèn)為是實(shí)際值，按照上述方法測(cè)量10枚胚胎，計(jì)算取得回歸曲線，得到回歸方程；

（2）測(cè)量豬2細(xì)胞胚胎兩個(gè)細(xì)胞的體積，并計(jì)算預(yù)估體積：

經(jīng)過(guò)步驟a、b的測(cè)量并根據(jù)回歸方程計(jì)算，不用去除透明帶就可以得出豬2細(xì)胞胚胎體積，用于后續(xù)活體培養(yǎng)，評(píng)估胚胎發(fā)育能力。

實(shí)施例2：

根據(jù)實(shí)施例1所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的胚胎染色劑為hoechst33342。

實(shí)施例3：

根據(jù)實(shí)施例1或2所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的步驟a、b、d中，拍照時(shí)，連續(xù)五次聚焦照片確保取得長(zhǎng)度最大值。

實(shí)施例4：

根據(jù)實(shí)施例1或2或3所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的步驟d中，當(dāng)分離2細(xì)胞后，若2細(xì)胞大小較為接近，去除透明帶時(shí)為了防止混淆左側(cè)細(xì)胞和右側(cè)細(xì)胞，用持卵針在左側(cè)細(xì)胞稍微用力吸出一個(gè)小突起，分離后可以辨認(rèn)，放入二氧化碳培養(yǎng)箱恢復(fù)1小時(shí)，每隔20分鐘檢查和翻動(dòng)細(xì)胞，防止細(xì)胞變?yōu)楸馄剑渥優(yōu)榍蝮w，在顯微鏡下拍照。

實(shí)施例5：

根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的去透明帶前，細(xì)胞形態(tài)認(rèn)為是接近橢圓體，計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積，公式為：測(cè)量體積=（x1+x2）/2×y1×y2×1/6×π。

實(shí)施例6：

根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4或5所述的豬2細(xì)胞胚胎體積的測(cè)量方法，所述的去透明帶后，細(xì)胞形態(tài)認(rèn)為是球體，計(jì)算得出左邊細(xì)胞和右邊細(xì)胞的體積，公式為：測(cè)量體積=1/6×π×[（x+y）/2]3。

實(shí)施例7：

由說(shuō)明書附圖2所示，同一胚胎的會(huì)導(dǎo)致取得數(shù)據(jù)不同，胚胎左照片旋轉(zhuǎn)90度得到右照片，故需要拍攝第1張照片后，旋轉(zhuǎn)90度拍攝第2張照片。

實(shí)施例8：

根據(jù)說(shuō)明書附圖3得出同一胚胎測(cè)量得到左邊細(xì)胞寬度lx1、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly1、右邊細(xì)胞寬度rx1、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry1；沿卵裂溝方向旋轉(zhuǎn)90度，拍攝第2張照片，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx2、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly2、右邊細(xì)胞寬度rx2、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry2。

實(shí)施例9：

根據(jù)說(shuō)明書附圖6所示2細(xì)胞大小較為接近，去除透明帶時(shí)為了防止混淆左側(cè)細(xì)胞和右側(cè)細(xì)胞，用持卵針在左側(cè)細(xì)胞稍微用力吸出一個(gè)小突起如a所示，分離后可以辨認(rèn)如b所示。

實(shí)施例10：

根據(jù)說(shuō)明書附圖9得出同一胚胎測(cè)量得到左邊細(xì)胞寬度lx1、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly1、右邊細(xì)胞寬度rx1、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry1；沿卵裂溝方向旋轉(zhuǎn)90度，拍攝第2張照片，用矩形框架校正測(cè)量數(shù)據(jù)邊緣然后測(cè)量長(zhǎng)度，分別得到左邊細(xì)胞寬度lx2、左邊細(xì)胞長(zhǎng)度ly2、右邊細(xì)胞寬度rx2、右邊細(xì)胞長(zhǎng)度ry2。